森林蛀木虫昆虫病原真菌的分离、行为鉴定和致病性评估

Summary

在这里，我们提出了一种从森林蛀木虫中获取昆虫病原真菌的方案，以及一种使用鞘翅目模式昆虫评估其昆虫病原活性的替代方法。该方法高效、方便地从天然林的蛀木害虫中探寻昆虫病原真菌资源。

Abstract

森林蛀木虫 （FWB） 在世界范围内造成严重的树木破坏和经济损失。在 FWB 出现期间释放昆虫病原真菌 （EPF） 被认为是化学控制的可接受替代方案。然而，与农业害虫相比，FWB 的 EPF 资源勘探明显较少。本文以野生 Monochamus alternatus 种群为例，提出了一种从 FWB 中探索 EPF 资源的方案。在这个协议中，分配了以 M 为诱饵的陷阱。在甲虫的出现期间，对不同种群的 Alternatus 引诱剂保证了收集到足够的具有自然感染症状的样本。在精细解剖外皮并将其放在选择性培养基上后，从甲虫身体的每个部分分离出真菌物种，并根据分子和形态特征进行鉴定。

几种真菌物种通过用孢子悬浮液重新感染健康的 M. alternatus 被证明为寄生 EPFs。使用扫描电子显微镜观察它们在 M. alternatus 上的行为表型，并进一步与鞘翅目模式昆虫 Tribolium castaneum 上的行为表型进行比较。对于在两种甲虫物种上表现出一致寄生表型的 EPF，评估它们在 T 上的活性。 castaneum 为未来对 M. alternatus 的研究提供了有关致死率的宝贵信息。该方案有助于发现中国新报道的 M. alternatus 种群的 EPF，可作为一种有效的方法，从其他 FWB 中探索更多的 EPF 资源。

Introduction

害虫造成的破坏给森林和农业生态系统造成了巨大的生态和经济损失。大多数农业害虫在损害寄主植物的同时，将自己暴露在天敌或人工控制剂中。相反，森林蛀木虫 （FWB） 几乎在寄主树干¹ 内完成其整个发育周期，这为在野外探索 FWB 的有效生防生物提出了巨大挑战。更糟糕的是，FWB 携带大量植物病原体² 或与这些病原体密切相关，因为它们的潜在载体 ^3,4，大大放大了 FWB 对森林健康的负面影响。过量使用化学杀虫剂可以减轻 FWB 的严重程度，但杀虫剂耐药性的出现 ^5,6 限制了它们在环境中的应用。在某些情况下，昆虫寄生虫、捕食性节肢动物以及昆虫病原微生物作为生物防治剂被释放到 FWB⁷ 的分布区域，并被证明是化学防治的有效且经济上可接受的替代品 ^8,9,10。

昆虫病原真菌 （EPF） 被认为在控制 FWB 方面优于大多数其他微生物群。它们的孢子可以被昆虫宿主携带，并通过渗透到角质层或外皮中稳定地固定在体表^{上 8,11}。EPF 还表现出对环境胁迫的极好适应性，一些物种以内生菌^12,13 的形式很好地定植在树木组织中，促进它们的生长、生存和传播。然而，与农业相比，天然林生态系统中使用的 EPF 物种多样性受到显著限制 14,15,16。Beauveria bassiana（菌株 PPRI 5339）被证明是最有前途的菌株，可以促进南非桉树象鼻虫^{IPM 计划17} 以及两种有前途的 B 分离株的组合。 Bassiana 为棕榈树田不同生命阶段的红棕象鼻虫 Rhynchophorus ferrugineus 的实际微生物控制提供了机会¹⁸。除了白僵菌和众所周知的 Metarhizium 之外，其他 EPF 属 Hypocreales 属，尤其是 Lecanicillium 物种（其中许多现在被归类为 Akanthomyces^{属 19,20}），在森林害虫管理方面表现出很强的致病性和很高的潜力，例如智利的柏树蚜虫²¹。

松锯甲虫 Monochamus alternatus 是中国和邻国臭名昭著的松树林害虫，它会钻入松树的树枝和树干中，阻碍养分和水的运输 22,23,24。此外，M. alternatus 还促进植物寄生松木线虫 （Bursaphelenchus xylophilus， PWN） 作为其主要媒介甲虫的入侵。甲虫的另一个同系物种 M. Galloprovincialis，近年来已在欧洲多个国家传播 PWN²⁵。先前的研究报道了来自单核菌属的几个天然 EPF 属，例如西班牙、日本和中国安徽/浙江省的白僵菌属、Metarhizium 和 Lecanicillium（Verticillium，甚至是 Lecanicillium 的前身）26,27,28,29.然而，与自然领域中广泛出现的 Monochamus 甲虫相比，这些 EPF 的收集似乎通常限制在某个地方。由于链状蠹虫在中国具有较宽的地理分布，因此可以将其视为一种具有代表性的蛀木虫，可以探索不同种群中更多潜在的 EPF。

在本方案中，我们引入了一个特定的程序，探索来自 M 的几个地理种群的 EPF。 alternatus 在中国南方。该方案使用模型鞘翅目甲虫作为替代品进行昆虫致病性测定，条件是测试的真菌物种对两种甲虫物种具有一致的行为表型。该协议还可以为其他森林蛀木虫的 EPF 勘探提供见解，其中其昆虫病原真菌物种的多样性被低估或研究较少。

Protocol

1. 从 M. alternatus 中分离真菌（图 1）

1. 采集甲虫样本
   1. 收集松树锯木甲虫 M。在自然感染的松树林中，使用商业诱捕器（见材料表）以诱饵诱饵的 alternatus 甲虫种群。
      注:本研究从华南地区的五个地理区域（湖州/浙江、凉山/四川、厦门/福建、韶关/广东、玉林/广西）收集了甲虫。陷阱设置从上到下如下:圆顶（直径 50 cm）、十字形面板（宽 35 cm，长 66 cm）、漏斗（顶部圆直径 35.5 cm，底部圆直径 5.5 cm）、收集杯（直径 10.5 cm，长 26.5 cm）。宿主挥发物（例如乙醇和 α-蒎烯）和聚集信息素（2-十一氧基-1-乙醇）用作诱饵³⁰。
   2. 在将标本转移到实验室之前，请给标本贴上标签。将每只甲虫放入带有新鲜树枝的单独消毒管中。每 2 天用新的树枝更换树枝。
   3. 在 25 ± 1 °C 的非加湿培养箱（16-8 L/D 循环）中饲养活的甲虫，并每天观察它们。
   4. 记录显示进食和活动能力下降的样本。转移死亡 M。 变 质菌变硬到湿室，以观察真菌菌丝体和分生孢子的生长。
      注:一旦被昆虫病原真菌感染，甲虫在感染初期表现出摄食和活动能力下降^31,32。死后，他们的身体变得坚硬和僵硬，菌丝体和分生孢子在湿室中存放几天后出现³³。
   5. 将有真菌感染的甲虫尸体储存在 4 °C 以备将来使用。要遵循此方案，请在几个小时内立即处理样品，以避免被更多腐生真菌污染。
2. 生长培养基的制备
   1. 将 39 g 马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA） 粉末加入 1 L 纯水中，并在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。
   2. 冷却至可操作温度 （~50 °C），加入 0.05 g 链霉素、0.05 g 青霉素 G 和 0.05 g 四环素，并摇动以分散培养基。
   3. 将培养基接种到干净的工作台下的培养皿中，凝固后使用。
      注:含有抗生素的 PDA 培养基用于从甲虫中分离，可防止细菌生长，而不会影响分离过程中真菌的生长。然而，不含抗生素的 PDA 培养基用于日常培养和保存。
   4. 将 35 g 马铃薯葡萄糖肉汤 （PDB） 粉末放入 1 L ddH₂O 中，并在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。 冷却后使用。
3. 解剖有真菌感染症状的甲虫样本
   1. 准备消毒过的剪刀、手术刀和昆虫针;然后，在带有酒精燃烧器的干净工作台下工作。
      注意:解剖工具的使用可以根据个人喜好进行调整。昆虫针比标准解剖针更锋利，不同规格可以满足解剖的需要。
   2. 在无菌和一次性培养皿中用工具解剖甲虫体外皮。注意避免可能渗出内部内容物的中肠和后肠组织损伤。
   3. 将甲虫身体分为以下主要位置:触角、头部、胸部、腹部、翅膀（每对）和腿。
4. 真菌净化
   1. 用剪刀将每个位置的外皮切成小块。用抗生素轻轻将外表面压在 PDA 板的表面。
      注意:确保外皮上的真菌菌丝体已接种到板上。
   2. 小心地用封口膜密封，并在 25 ± 1 °C 的培养箱中培养，直到组织被菌丝体完全覆盖。
   3. 根据表型特性（颜色、形状）将单个菌落转移到含有抗生素的新 PDA 上，以便在 25 ± 1 °C 下培养。
   4. 用抗生素对 PDA 重复步骤 1.4.3 两次或三次，直到单独分离纯菌落。
      注意:如果原始板中生长多种真菌菌株，请精确挑选出菌丝体，以便于对更多真菌物种进行分类。
5. 真菌分离物的储存
   1. 将琼脂块（直径 ~5 mm）从菌落转移到新的 PDA 板中。
   2. 在 25 ± 1 °C 的培养箱中培养 1-2 周。
   3. 置于 4 °C 冰箱中，每天存放以备将来使用。
   4. 将真菌菌株接种到 250 mL 烧瓶中的 50 mL 无菌 PDB 中，在 25 °C 下以 180 rpm/min 振荡 5-7 天。
   5. 收获 1 mL 新鲜生长的真菌菌丝体，并将其悬浮在 2 mL 无菌冷冻管中的 1 mL 无菌 20% 甘油中（甘油的最终浓度为 10%）。
   6. 用封口膜密封试管，并在-20°C和-40°C下预冷。 然后，将试管保持在-80°C作为储备液。

2. 真菌分离物的分子和形态学鉴定

1. 真菌基因组 DNA 的提取
   1. 如步骤 1.5.4 所述，在 PDB 中培养真菌。
   2. 收获菌丝体并过滤以将其与 PDB 分离。使用预冷的研钵和研杵在液氮中均质化。
   3. 根据制造商的说明，使用真菌基因组 DNA 分离试剂盒提取基因组 DNA（参见 材料表）。
2. PCR 扩增和 DNA 测序
   1. 按如下方式制备 PCR 反应混合物:25 μL Taq DNA 聚合酶、1 μL 模板、2 μL 正向和反向引物以及 ddH₂O，总体积为 50 μL。
   2. 使用引物对 ITS1 和 ITS4³⁴ （见 表 1）扩增 DNA 样品的 rDNA-ITS 区域，程序如下:在 95 °C 下初始变性 4 分钟，然后在 94 °C 下变性 35 个循环 60 秒，在 58 °C 下退火 60 秒，在 72 °C 下伸长 2 分钟， 并在 72 °C 下最终伸长 10 分钟。
   3. 使用 1.5% 琼脂糖凝胶在 100 V、100 mA 下对扩增产物进行电泳。
   4. 对 PCR 进行测序。
   5. 使用 Clustal X2.0 和 MEGA 6.0 对齐序列。
      注意:在序列比对过程中，比对不明确的位点被排除在外，间隙被视为缺失数据。
   6. 使用美国国家生物技术信息中心 （NCBI） 网站上的 BLAST 将获得的序列与 GenBank 中 ITS 序列数据库中的序列进行比较。初步鉴定真菌菌株种类信息。
3. 形态学鉴定
   1. 使用相机捕捉 PDA 板正面和背面的成熟真菌纯菌落形态。
   2. 用接种针从纯培养的真菌菌落中摘取分生孢子，并用一滴无菌水将它们转移到载玻片上。
   3. 握住盖玻片，以 ~45° 的角度慢慢放下，使盖玻片可以覆盖标本而没有气泡。
   4. 用手术刀从真菌菌落边缘的菌落中切下 5 mm² 琼脂块，并用一滴无菌水将其转移到干净的载玻片上。用细针小心地梳理出真菌，以查看特定结构。
   5. 重复步骤 2.3.3。
   6. 在光学显微镜 （OM） 下观察真菌的无性形态，包括菌丝、分生孢子、分生孢子和分生孢子的形状、透明度和姿势。记录并测量无性特征的形状和大小，以区分不同的真菌分离株。
      注:为了最大限度地提高观察真菌结构的能力，请使用染色剂和封固剂³⁵。

3. 诱导 M. alternatus 的真菌感染症状以观察它们的行为表型

1. 分生孢子悬浮液的制备
   1. 用纯水制备 0.01% Tween-80，并在 121 °C 下高压灭菌 25 分钟。 冷却后使用。
   2. 向 2 mL 离心管中加入适量的无菌小玻璃珠和 0.01% Tween-80 溶液。
   3. 将真菌菌落刮入试管中，并用涡旋摇床充分摇晃，直到菌落被打碎。过滤两层纱布以去除菌丝体。
      注意:摇动以确保分生孢子孢子悬浮在 0.01% Tween-80 溶液中。
   4. 用血细胞计数器计数OM下的孢子数，用无菌的0.01%吐温-80调节至1×10⁸ 分生孢子/ mL，并保持在4°C使用。
2. 甲虫的制备
   1. 将松树枝（大约相同大小）高压灭菌并在烤箱中干燥（~ 60 °C）。
   2. 保持现场收集 的 M。在 25 ± 1 °C 的培养箱中具有松树枝的 alternatus 成虫。
   3. 将甲虫饿死 24 小时，并在使用前用漂白剂、乙醇和蒸馏水 [10:10:80 （v:v）] 对甲虫表面进行消毒。
3. 真菌感染的诱导
   1. 在干净的工作台下工作，将松树枝浸入分生孢子悬浮液中 10 秒，然后在空气中干燥。
   2. 将甲虫浸入分生孢子悬浮液中 10 秒，然后转移到 50 mL 无菌管中（每管一只甲虫和一根树枝）。每 2 天更换一次新树枝。
   3. 对于阴性对照，将分生孢子悬浮液仅更换为无菌 0.01% 吐温-80 溶液。对每个真菌菌株和对照组进行五次重复。
   4. 根据松树枝上产生的碎屑量评估甲虫的活动。当喂食停止时，认为它们已经死了。
   5. 将死甲虫转移到新的无菌 50 mL 试管中，并放入一块无菌湿棉。在 25 ± 1 °C 孵育。
      注意:湿棉用于保持湿度，因为真菌的生长需要适当的水分，但不要太多。
   6. 每天在同一时间观察和拍摄甲虫表面的变化。
4. 重新分离并确认真菌种类
   1. 在甲虫表面出现清晰的真菌感染表型之前，从不同的组织中分别挑选菌丝体到新的 PDA 板中。
   2. 在 25 ± 1 °C 下培养并观察以确保形态与接种的真菌的形态一致。
5. 模型甲虫的治疗
   1. 在模型甲虫 Tribolium castaneum 上重复步骤 3.2.1-3.3.6，以麦麸为食物，并用紫外线对麦麸进行消毒。
   2. 用无菌镊子轻轻触摸甲虫。如果没有回应，就假设他们已经死了。

4. 确认 M. alternatus 和模式甲虫上真菌的感染表型

1. 用于观察的样品制备
   1. 解剖受感染的 M。像步骤 1.3 一样小心地进行 alternatus 尸体。
   2. 拾取 T。具有明显真菌感染症状的 栗 体。
   3. 切下生长在 PDA 上的四个成熟真菌菌落的 5 mm 圆盘塞。
2. 样品前处理
   1. 将栓子、受感染的甲虫组织和身体放入 4 °C 的预冷 2.5% 戊二醛中 2 天。
   2. 在 0.1% 磷酸盐缓冲液 （pH 7.2-7.4） 中洗涤样品 3 次，每次 5 分钟，然后在 30%、50%、70%、80%、90%、95%、100% 乙醇中脱水 10 分钟。
   3. 在真空冷冻干燥机中干燥样品。
      注:整个预处理过程应小心，包括切割、浸泡、脱水、洗涤和干燥，以防止样品损坏。
3. 扫描电子显微镜 （SEM） 观察
   1. 使用溅射镀膜机用铂涂覆预处理的样品，并在扫描电子显微镜下观察³⁶。
   2. 记录在 PDA、 M. 上生长的菌丝和分生孢子的形态学特征。 交替 组织，并模拟甲虫身体。
   3. 比较结果是否与步骤 2.3 中 OM 下的结果一致。

5. 昆虫致病活性的评价

1. 分生孢子悬浮液的制备
   1. 分生孢子悬浮液的制备与步骤 3.1.1-3.1.4 相同。
2. 模型甲虫的预处理
   1. 培养、喂养、绝育和饥饿 T。 castaneum 与步骤 3.5.1 相同。
   2. 通过 UV 对麦麸进行消毒，并将同等重量置于无菌培养皿中。
3. 昆虫病原活性试验
   1. 用分生孢子悬浮液处理麦麸，并在室温下在干净的工作台下在空气中干燥。
   2. 浸入 T。 栗 形甲虫在分生孢子悬浮液中 10 秒，并将它们转移到培养皿中（每个培养皿中 n = 20）。每 4 天用相同的分生孢子处理替换新的麦麸。
   3. 对于阴性对照，仅应用无菌 0.01% Tween-80 溶液。
      注意:为每个处理组和对照留出至少三个重复。
   4. 每天数点死甲虫的数量。
      注意: 用无菌镊子轻轻触摸甲虫。如果缺乏回应，就假设他们已经死了。
4. 多基因系统发育分析
   1. 如步骤 2.1 中所述提取昆虫病原真菌基因组 DNA。
      注意:对寄生 EPF 进行多基因鉴定，这些寄生 EPF 对模型甲虫表现出显着的感染表型和强烈的昆虫病原活性。
   2. 扩增以下基因，包括跨越核糖体 SSU³⁴ 基因的区域、大亚基 rRNA 基因 （LSU^37,38） 的一段、延伸因子 1-α （tef-1α³⁹） 基因的一部分、RNA 聚合酶 ІІ （rpb2⁴⁰） 的第二大亚基序列和 β-微管蛋白⁴¹ 的一部分基因，分别使用引物对 NS1/NS4、LR7/LROR、EF-983F/EF-2218R、RPB2-5'F/RPB2-5'R 和 TUB1/TUB22（见表 1）。
      1. 如步骤 2.2.1 所示制备 PCR 反应混合物。
      2. 按如下方式进行扩增:在95°C下初始变性4分钟，然后在94°C下变性35个循环（tef-1α，rpb2，SSU），38个循环（LSU）或39个循环（β-微管蛋白）在94°C下变性60秒，在47°C下退火60秒（LSU），55°C退火60秒（tef-1α），54°C下40秒（β-微管蛋白）和50°C下30秒（rpb2， SSU），在 72 °C 下伸长 1 分钟，最终在 72 °C 下伸长 10 分钟。
   3. 按照步骤 2.2.4-2.2.5 中所示的相同步骤进行排序和对齐。
   4. 根据最大似然 （ML） 方法⁴² 通过 MEGA 6.0 进行系统发育分析。

Results

从 M 中分离和鉴定真菌分离株。 替代
在引诱器的帮助下，大量（总共约 500 只甲虫）的 M。 Alternatus 是从 5 个地理区域收集的。挑选具有昆虫病原真菌感染典型症状的甲虫尸体;然后，将每只甲虫的体皮解剖成几个位置，如方案步骤 1.3 中所述。结果，从不同的身体位置分离出 600 多种真菌分离株。这使得更丰富的真菌候选者可用于筛选针对松木锯木甲虫的病原体。对 ITS 区域的测序初步显示，这些分离株可分为 15 个真菌属和 39 个物种。此外， M. alternatus 成虫地理种群之间的真菌群落组成存在显著差异。真菌种类 Aspergillus austwickii、 Akanthomyces attenuatus （syn. Lecanicillium attenuatum）、 柑橘青霉 Penicillium citrinum、 Scopulariopsis alboflavescens 分别是四川、...

Discussion

由于 EPF 物种对当地气候因素和寄主昆虫的特定基因型种群的长期环境适应，FWB 的不同地理种群可能与天然昆虫病原真菌发生不同的相互作用^44,45。正如先前对农业害虫的研究所描述的那样，将采样点扩展到多个昆虫发生区域有助于增加从其自然宿主获得不同菌株或种类的 EPF 的可能性⁴⁶。在该协议中，在以引诱剂为诱饵的陷阱的帮助下，松木锯木甲虫 M.在中国南方 5 个不同地点进行跨纬度采集，考虑到较高的温度和湿度，被认为是探索新型 EPF 的理想且丰富的资源库。这种省力的方法可以活捉甲虫，应将其单独装在单独的无菌管中运送到实验室。甲虫的自然感染症状需要几天才能出现。代表性 EPF 种类 A.austwickii， A. attenuatus （syn. L.attenuatum） 和 S.通...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL、2 mL 离心管	Biosharp	BS-15-M
10 µL 移液器吸头	Sangon Biotech	F601216
10 µL、20 和微量;L、100 和微量;L、200 和微量;L、1,000 和微量;L 移液器	Rainin
1,000 & 微量移液器;L 移液器吸头	Sangon Biotech	F630102
2 mL 低温小瓶	康宁	430659
20x PBS 缓冲液	Sangon Biotech	B548117-0500
200 µL 移液器吸头	Sangon Biotech	F601227
2,000 bp 制造商	TaKaRar	SD0531
50 mL 管	巢	602052
50% 戊二醛溶液	Sangon Biotech	G916054
50x TAE 缓冲液	Sangon Biotech	B548101
6x 上样缓冲液	TaKaRar	SD0503
琼脂糖	桑贡生物科技	A610013
无水乙醇	Jkchemical	LB10V37
生化培养柜	上海亿恒	LRH-250F
氯仿	巨华	61553
商业甲虫陷阱	飞蒙迪	BF-8	www.yinyouji.com
凝胶成像仪	Bio-Rad	GelDoc XR+
甘油	Sangon Biotech	A600232
高速冷冻离心机	Sigma	D-37520
高压蒸汽灭菌锅	Mettler Toledo	JA5003
异丙醇	通用试剂	G75885B
核酸染料	Sangon Biotech	A616696
光学显微镜，OM	Leica	DM2000
封口	膜	Parafilm PM996
PCR 计	Heal Force	Trident960
青霉素 G	Marklin	GB15743
马铃薯葡萄糖琼脂，PDA	Oxoid	CM0139
马铃薯葡萄糖汤，PDB	Solarbio	P9240
引物	Sangon Biotech	/
引物 Taq	TaKaRar	RR902A
快速真菌基因组 DNA 分离试剂盒	Sangon Biotech	B518229
扫描电子显微镜、SEM	日立	S-3400N
链霉素	Marklin	S6153
四环素	Marklin	T829835
Tween-80	Marklin	T6336
真空冷冻干燥机	Yamato	DC801
涡旋摇床	HLD	WH-861
β-巯基乙醇	Marklin	M6230