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方法文章

从森林木蛀虫中分离、行为鉴定及昆虫病原真菌致病性评估

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DOI：

10.3791/65782

⸱

2023年9月29日

 ,  ,  ,  , 
1School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A&F University, 2Key Laboratory of Vector Biology and Pathogen Control of Zhejiang Province, Huzhou University, 3Department of Biology, Lund University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种从森林钻蛀性害虫中分离昆虫病原真菌的实验方案，并提供了一种利用鞘翅目模式昆虫评估其昆虫病原活性的替代方法。该方法对于在天然林中挖掘和研究钻蛀性害虫来源的昆虫病原真菌资源具有高效性和便利性。

摘要

森林蛀干害虫（FWB）在全球范围内造成严重的树木损害和经济损失。在蛀干害虫羽化期间释放昆虫病原真菌（EPF）被认为是化学防治的一种可接受的替代方法。然而，与农业害虫相比，针对森林蛀干害虫的EPF资源研究显著不足。本文以野生松墨天牛（Monochamus alternatus）种群为例，提出了一种探索FWB相关EPF资源的实验方案。在该方案中，通过在不同种群区域布设含有M. alternatus引诱剂的诱捕器，确保在成虫羽化期收集到具有自然感染症状的足够样本。随后，通过精细解剖虫体表皮并将其接种于选择性培养基上，从天牛身体各部位分离真菌物种，并结合分子和形态学特征进行鉴定。

多种真菌物种通过重新感染健康宿主被确认为寄生性杀虫真菌 M. alternatus 孢子悬液。它们在上述条件下的行为表型 M. alternatus 使用扫描电子显微镜观察，并进一步与鞘翅目模式昆虫上的结果进行比较 赤拟谷盗对于在两种甲虫物种上均表现出一致寄生表型的EPF，应评估其活性 T. castaneum 为未来研究提供了有关致死率的重要信息 M. alternatus该方案有助于新近报道的EPF的发现 M. alternatus 中国境内的种群，该方法可有效用于从其他淡水生物中发掘更多的杀虫真菌资源。

引言

昆虫害虫造成的破坏给森林和农业生态系统带来了巨大的生态和经济损失。大多数农业害虫在危害寄主植物时会暴露于天敌或人工防治因子之下。然而，森林蛀干害虫（FWB）几乎整个发育周期都在寄主树木的树干内部完成1，这给在野外寻找有效的生物防治生物带来了巨大挑战。更严重的是，蛀干害虫携带大量植物病原体2，或作为这些病原体的潜在传播媒介与其存在密切关系3,4，从而显著加剧了其对森林健康的负面影响。过度使用化学杀虫剂虽可减轻蛀干害虫的危害程度，但杀虫剂抗性的出现5,6限制了其在环境中的应用。在某些情况下，昆虫寄生性天敌、捕食性节肢动物以及昆虫病原微生物已被释放到蛀干害虫的分布区域7，并被证明是化学防治的有效且经济可行的替代方案8,9,10。

昆虫病原真菌（EPF）被认为在防控FWB方面比大多数其他微生物类群更具优势。其孢子可由昆虫宿主携带，并通过穿透体壁或表皮稳定地附着在虫体表面。8,11EPF 对环境胁迫也表现出优异的适应性，某些物种可作为内生真菌在树木组织中良好定殖。12,13，促进其生长、存活与传播。然而，与农业领域相比，自然森林生态系统中使用的虫生真菌（EPF）物种多样性显著受限14,15,16. 球孢白僵菌 （菌株PPRI 5339）被证实是推动IPM项目最具前景的菌株 桉树 南非的象鼻虫17 两种有前景的分离株的组合 B. bassiana 为红棕象甲的微生物防控实践提供了机会， Rhynchophorus ferrugineus，在棕榈树林不同生活阶段18此外 球孢白僵菌 以及众所周知的 绿僵菌，肉座菌目中的其他EPF属，尤其是某些物种的 Lecanicillium （其中许多现被归类于属 Akanthomyces19,20），表现出强致病性和防治森林害虫的高潜力，例如 柏木 智利的蚜虫21.

松墨天牛Monochamus alternatus是中国及周边国家臭名昭著的松林害虫，其幼虫钻蛀松树的枝干，阻碍水分和养分的运输22,23,24。此外，M. alternatus还是植物寄生性松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus，PWN）的主要传播媒介昆虫，促进该线虫的入侵。近年来，该属的另一近缘种M. galloprovincialis已在欧洲多个国家传播松材线虫25。先前的研究在西班牙、日本以及中国安徽和浙江等省份的Monochamus spp.中报道了多种天然昆虫病原真菌（EPFs）属，如Beauveria、Metarhizium和Lecanicillium（Verticillium是Lecanicillium更早的名称）26,27,28,29。然而，与自然界中广泛分布的Monochamus天牛相比，这些EPF菌株的采集似乎通常局限于特定地区。由于M. alternatus在中国具有广泛的地理分布，因此可将其视为代表性木蛀害虫，用于在不同种群中探索更多潜在的EPF资源。

在本实验方案中，我们介绍了一种针对中国南方地区多种地理种群的M. alternatus中昆虫病原真菌（EPFs）的研究方法。该方案采用一种典型的鞘翅目甲虫作为替代宿主，开展昆虫病原性测定实验，前提是所测试的真菌物种在两种甲虫宿主上表现出一致的行为表型。本方案也可为其他森林钻蛀性害虫的昆虫病原真菌研究提供参考，这些害虫相关的病原真菌物种多样性目前尚被低估或研究不足。

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方案

1. 从M. alternatus中分离真菌（图1）

  1. 采集甲虫样本
    1. 在自然感染的松林中，于甲虫种群预计羽化期之前，使用商业诱捕器（见材料表）并添加引诱剂来采集松墨天牛M. alternatus。
      注：本研究中，甲虫样本采自中国南方五个地理区域（浙江湖州、四川凉山、福建厦门、广东韶关、广西玉林）。诱捕器自上而下的结构依次为：圆形顶盖（直径50 cm）、十字形挡板（宽35 cm，长66 cm）、漏斗（顶部圆口直径35.5 cm，底部圆口直径5.5 cm）、收集杯（直径10.5 cm，长26.5 cm）。以寄主挥发物（如乙醇和α-蒎烯）及聚集性信息素（2-十一烷氧基-1-乙醇）作为诱饵30。
    2. 在将样本转移至实验室前进行标记。将每只甲虫放入含有新鲜嫩枝的独立无菌管中，每隔2天更换一次新鲜嫩枝。
    3. 将活体甲虫置于25 ± 1 °C、非加湿培养箱中（16小时光照/8小时黑暗循环），每日观察其状态。
    4. 记录摄食和活动能力下降的样本。将死亡后变得僵硬的M. alternatus个体转移至湿润培养室，观察真菌菌丝和分生孢子的生长情况。
      注：一旦被昆虫病原 真菌感染，甲虫在感染初期即表现出摄食和活动能力下降31,32。死亡后，其身体逐渐变硬，存放于湿润培养室数日后可见菌丝和分生孢子出现33。
    5. 将带有真菌感染的甲虫尸体储存在4 °C条件下以备后续使用。为遵循本方案，应在数小时内立即处理样本，避免被更多腐生真菌污染。
  2. 培养基制备
    1. 将39 g马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）粉末加入1 L纯水中，于121 °C条件下高压灭菌30分钟。
    2. 冷却至可操作温度（约50 °C），加入0.05 g链霉素、0.05 g青霉素G和0.05 g四环素，摇匀使抗生素均匀分布。
    3. 在超净工作台中将培养基倒入培养皿，待凝固后使用。
      注：含抗生素的PDA培养基用于从甲虫中分离真菌，可抑制细菌生长而不影响真菌生长。然而，日常培养与保藏应使用不含抗生素的PDA培养基。
    4. 将35 g马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）粉末加入1 L ddH2O中，于121 °C高压灭菌30分钟，冷却后备用。
  3. 对表现出真菌感染症状的甲虫样本进行解剖
    1. 准备无菌剪刀、解剖刀和昆虫针，并在超净工作台中配合酒精灯操作。
      注：解剖工具的使用可根据个人习惯调整。昆虫针比标准解剖针更锋利，不同规格可满足不同的解剖需求。
    2. 在无菌且一次性使用的培养皿中，使用工具解剖甲虫体壁。操作时注意避免损伤中肠和后肠组织，以防内容物外溢。
    3. 将甲虫身体分为以下主要部位：触角、头部、胸部、腹部、翅（每对）和足。
  4. 真菌纯化
    1. 用剪刀将各部位体壁剪成小块，轻轻将外表面压接到含抗生素的PDA平板表面。
      注：确保体壁上的真菌菌丝已接种至平板上。
    2. 用封口膜仔细密封，在25 ± 1 °C培养箱中培养，直至组织被菌丝完全覆盖。
    3. 根据菌落表型特征（颜色、形态），挑取单菌落转移至新的含抗生素PDA平板，在25 ± 1 °C下继续培养。
    4. 在含抗生素的PDA平板上重复步骤1.4.3两到三次，直至获得独立的纯菌落。
      ​注：若原始平板中生长出多种真菌菌株，应精确挑取菌丝，以便分离出更多真菌种类。
  5. 真菌分离物的保存
    1. 从菌落中切取琼脂块（直径约5 mm），转移至新的PDA平板。
    2. 在25 ± 1 °C培养箱中培养1–2周。
    3. 置于4 °C冰箱中进行日常保存，以备后续使用。
    4. 将真菌菌株接种于250 mL三角瓶中的50 mL无菌PDB培养基中，在25 °C、180 rpm/min条件下振荡培养5–7天。
    5. 收集1 mL新鲜生长的真菌菌丝体，悬浮于2 mL无菌冻存管中的1 mL灭菌20%甘油溶液中（终浓度为10%甘油）。
    6. 用封口膜密封冻存管，依次在-20 °C和-40 °C预冷，然后置于-80 °C长期保存。

2. 真菌分离株的分子与形态学鉴定

  1. 真菌基因组DNA的提取
    1. 按照步骤1.5.4所述方法在PDB中培养真菌。
    2. 收集菌丝体并过滤，使其与PDB分离。使用预冷的研钵和研杵在液氮中进行匀浆处理。
    3. 根据制造商说明，使用真菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA（见材料表）。
  2. PCR扩增与DNA测序
    1. 按如下方式配制PCR反应体系：Taq DNA聚合酶25 µL，模板1 µL，上下游引物各2 µL，ddH2O补足至总体积50 µL。
    2. 使用引物对ITS1和ITS434（见表1）扩增DNA样本的rDNA-ITS区域，反应程序如下：95 °C预变性4分钟；随后进行35个循环，每个循环包括94 °C变性60秒、58 °C退火60秒、72 °C延伸2分钟；最后72 °C终延伸10分钟。
    3. 将扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中以100 V、100 mA进行电泳分析。
    4. 对PCR产物进行测序。
    5. 使用Clustal X2.0和MEGA 6.0进行序列比对。
      注：在序列比对过程中，排除比对位置不确定的位点，空缺（gaps）视为缺失数据。
    6. 通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站上的BLAST工具，将所获得的序列与GenBank中的ITS序列数据库进行比对，初步鉴定真菌菌株的物种信息。
  3. 形态学鉴定
    1. 使用相机拍摄PDA平板上成熟真菌纯培养物正面和反面的菌落形态。
    2. 用接种针从纯培养的真菌菌落中挑取分生孢子，并转移至含一滴无菌水的载玻片上。
    3. 手持盖玻片，以约45°角缓慢放下，使盖玻片覆盖样品且无气泡产生。
    4. 用解剖刀从菌落边缘切取一块5 mm2的琼脂块，转移至含一滴无菌水的洁净载玻片上。用细针小心挑散真菌，以观察其特定结构。
    5. 重复步骤2.3.3。
    6. 在光学显微镜（OM）下观察真菌的无性形态，包括菌丝、分生孢子梗、瓶梗和分生孢子的形状、透明度及姿态。记录并测量无性特征的形态和大小，以区分不同真菌分离株。
      ​注：为最大程度观察真菌结构，可使用染色剂和封片介质35。

3. 诱导M. alternatus真菌感染症状以观察其行为表型

  1. 分生孢子悬浮液的制备
    1. 用纯水配制0.01%吐温-80溶液，并在121 °C下高压灭菌25分钟。冷却后使用。
    2. 向2 mL离心管中加入适量无菌小玻璃珠和0.01%吐温-80溶液。
    3. 将真菌菌落刮入管中，用涡旋振荡器充分振荡，直至菌落完全破碎。通过两层纱布过滤以去除菌丝体。
      注：振荡的目的是确保分生孢子在0.01%吐温-80溶液中均匀悬浮。
    4. 使用血细胞计数板在光学显微镜下计数孢子数量，用无菌0.01%吐温-80溶液调整至1 × 108 个分生孢子/mL，并于4 °C保存备用。
  2. 甲虫的准备
    1. 将松枝（大小相近）进行高压灭菌，并在烘箱中干燥（约60 °C）。
    2. 将野外采集的M. alternatus成虫与松枝一起置于25 ± 1 °C的培养箱中饲养。
    3. 实验前将甲虫饥饿处理24小时，并用次氯酸钠、乙醇和蒸馏水[10:10:80 (v:v)]对甲虫体表进行表面消毒。
  3. 诱导真菌感染
    1. 在超净工作台内操作，将松枝浸入分生孢子悬浮液中10秒，然后在空气中晾干。
    2. 将甲虫浸入分生孢子悬浮液中10秒，随后转移至无菌50 mL离心管中（每管一只甲虫和一根松枝）。每隔2天更换一次松枝。
    3. 阴性对照组使用无菌0.01%吐温-80溶液代替分生孢子悬浮液。每种真菌菌株及对照组均设置五个重复。
    4. 根据甲虫在松枝上产生的排泄物量评估其活动状态。当停止取食时，视为死亡。
    5. 将死亡甲虫转移至新的无菌50 mL离心管中，并放入一小块无菌湿润棉球。于25 ± 1 °C条件下培养。
      ​注：湿润棉球用于维持湿度，因为真菌生长需要适当的水分，但不宜过多。
    6. 每天同一时间观察并拍摄记录甲虫体表的变化情况。
  4. 再分离并确认真菌种类
    1. 当甲虫体表出现明显的真菌感染表型时，从不同组织部位分别挑取菌丝接种至新的PDA平板上。
    2. 在25 ± 1 °C下培养，观察菌落形态是否与接种的真菌一致。
  5. 模式甲虫的处理
    1. 在模式甲虫Tribolium castaneum上重复步骤3.2.1–3.3.6，以小麦麸皮作为食物，并用紫外光对小麦麸皮进行灭菌处理。
    2. 用无菌镊子轻轻触碰甲虫，若无反应则判定为死亡。

4. 确认真菌在M. alternatus及模式甲虫上的感染表型

  1. 用于观察的样品制备
    1. 参照步骤1.3，小心解剖被感染的 M. alternatus 尸体。
    2. 挑选表现出明显真菌感染症状的 T. castaneum 虫体。
    3. 从PDA培养基上生长的四个成熟真菌菌落中，切取直径5 mm的菌块。
  2. 样品预处理
    1. 将菌块、感染的甲虫组织及虫体放入预冷的2.5%戊二醛溶液中，在4 °C下固定2天。
    2. 用0.1%磷酸缓冲液（pH 7.2–7.4）清洗样品三次，每次5分钟；随后依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇进行脱水，每次10分钟。
    3. 将样品置于真空冷冻干燥机中干燥。
      ​注意：整个预处理过程应小心操作，包括切割、浸泡、脱水、清洗和干燥，以防止样品损伤。
  3. 扫描电子显微镜（SEM）观察
    1. 使用溅射镀膜仪将预处理后的样品镀铂，然后在扫描电子显微镜下观察36。
    2. 记录菌丝和分生孢子在PDA培养基、M. alternatus 组织以及模型甲虫虫体上生长的形态特征。
    3. 比较结果是否与步骤2.3中光学显微镜（OM）下的观察结果一致。

5. 昆虫病原活性的评价

  1. 分生孢子悬液的制备
    1. 分生孢子悬液的制备方法与步骤 3.1.1–3.1.4 相同。
  2. 模式甲虫的预处理
    1. 按照步骤 3.5.1 的方法培养、饲喂、消毒并饥饿处理 T. castaneum。
    2. 用紫外光对小麦麸皮进行灭菌，并将等量的灭菌小麦麸皮放入无菌培养皿中。
  3. 昆虫病原活性检测
    1. 用分生孢子悬液处理小麦麸皮，并在室温下洁净工作台中风干。
    2. 将 T. castaneum 甲虫浸入分生孢子悬液中 10 秒，然后转移至培养皿中（每培养皿 n = 20）。每隔 4 天更换一次经相同分生孢子处理的新鲜小麦麸皮。
    3. 阴性对照组仅使用无菌的 0.01% Tween-80 溶液。
      注：每个处理组和对照组至少设置三个重复。
    4. 每天统计死亡甲虫数量。
      注：用无菌镊子轻轻触碰甲虫，若无反应则判定为死亡。
  4. 多基因系统发育分析
    1. 按照步骤 2.1 所述方法提取昆虫病原真菌的基因组 DNA。
      注：对表现出显著感染表型且对模式甲虫具有较强昆虫病原活性的寄生性昆虫病原真菌进行多基因鉴定。
    2. 使用引物对 NS1/NS4、LR7/LROR、EF-983F/EF-2218R、RPB2-5'F/RPB2-5'R 和 TUB1/TUB22（见表 1），分别扩增以下基因片段：核糖体小亚基 SSU34 基因的一段区域、大亚基 rRNA 基因（LSU37,38）的一段序列、延伸因子 1-α（tef-1α39）基因的部分序列、RNA 聚合酶Ⅱ第二大亚基（rpb240）的序列以及 β-tubulin41 基因的部分序列。
      1. PCR 反应体系的配制方法同步骤 2.2.1。
      2. 扩增程序如下：95 °C 预变性 4 分钟；随后进行 35 个循环（tef-1α、rpb2、SSU）、38 个循环（LSU）或 39 个循环（β-tubulin），每个循环包括：94 °C 变性 60 秒，退火（LSU 为 47 °C 60 秒，tef-1α 为 55 °C 60 秒，β-tubulin 为 54 °C 40 秒，rpb2 和 SSU 为 50 °C 30 秒），72 °C 延伸 1 分钟；最后 72 °C 终末延伸 10 分钟。
    3. 测序及序列比对操作参照步骤 2.2.4–2.2.5 进行。
    4. 基于最大似然法（ML），使用 MEGA 6.0 软件进行系统发育分析42。

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结果

从真菌分离物中分离与鉴定 M. alternatus
借助引诱陷阱，可捕获大量（总计约500只）甲虫 M. alternatus 从五个地理区域采集了样本。挑选出具有昆虫病原真菌感染典型症状的甲虫尸体；随后，按照方案步骤1.3所述，将每只甲虫的体壁分割为多个部位。最终，从不同体部分离出600多个真菌分离株。这为筛选针对松墨天牛的病原真菌提供了更丰富的候选菌株。ITS区序列分析初步显示，这些分离株可归入15个真菌属、39个种。此外，不同地理种群间的真菌群落组成存在显著差异。 M. alternatus 成虫。该真菌物种， Aspergillus austwickii, Akanthomyces attenuatus （同义词 Lecanicillium attenuatum), Penicillium citrinum, Scopulariopsis alboflavescens 分别是中国四川、浙江、广东、福建地区的优...

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讨论

由于虫生真菌（EPF）物种长期适应当地的气候因素以及寄主昆虫特定的基因型种群，不同地理种群的松墨天牛（FWB）可能与天然的虫生真菌形成不同的互作关系44,45。正如先前对农业害虫研究所述，将采样点扩展至多种昆虫发生区域，有助于从其天然寄主中获得多样化的虫生真菌菌株或物种46。在本方案中，借助含有引诱剂的诱捕器，在中国南方五个不同地点沿纬度梯度采集松墨天牛 M. alternatus，该区域因温度和湿度较高，被视为探索新型虫生真菌的理想且丰富的资源库。这种省力的方法可活体诱捕甲虫，随后应将每只甲虫分别置于无菌管中单独运送到实验室。甲虫上出现自然感染症状通常需要数天时间。通过本方案获得的代表性虫生真菌物种 A. austwickii、A. attenuatus（异名 L. attenuatum）和 S. alboflavescens，在...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究得到中国国家重点研发计划（2021YFC2600100）和浙江省自然科学基金（LY21C040001）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL、2 mL 离心管BiosharpBS-15-M
10 µL 移液器吸头生工生物F601216
10 µL、20 µL、100 µL、200 µL、1,000 µL 移液器Rainin
1,000 µL 移液器吸头生工生物F630102
2 mL 冻存管Corning430659
20x PBS 缓冲液生工生物B548117-0500
200 µL 移液器吸头生工生物F601227
2,000 bp DNA MarkerTaKaRaSD0531
50 mL 离心管Nest602052
50% 戊二醛溶液生工生物G916054
50x TAE 缓冲液生工生物B548101
6x 上样缓冲液TaKaRaSD0503
琼脂糖生工生物A610013
无水乙醇JkchemicalLB10V37
生化培养箱上海一恒LRH-250F
氯仿巨化61553
商用甲虫诱捕器FEIMENGDIBF-8www.yinyouji.com
凝胶成像系统Bio-RadGelDoc XR+
甘油生工生物A600232
高速冷冻离心机SigmaD-37520
高压蒸汽灭菌锅Mettler ToledoJA5003
异丙醇国药化学试剂G75885B
核酸染料生工生物A616696
光学显微镜，OMLeicaDM2000
封口膜（Parafilm）ParafilmPM996
PCR 仪力康生物Trident960
青霉素 G麦克林GB15743
马铃薯葡萄糖琼脂培养基，PDAOxoidCM0139
马铃薯葡萄糖液体培养基，PDB索莱宝P9240
引物生工生物/
Taq 引物酶TaKaRaRR902A
快速真菌基因组 DNA 提取试剂盒生工生物B518229
扫描电子显微镜，SEM日立S-3400N
链霉素麦克林S6153
四环素麦克林T829835
吐温-80麦克林T6336
真空冷冻干燥机YamatoDC801
涡旋振荡器HLDWH-861
β-巯基乙醇麦克林M6230

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