使用隔药饼灸法治疗慢性肾衰竭大鼠

摘要

艾灸实验平台能够无束缚地固定大鼠，使大鼠在清醒状态下接受多穴位艾灸，既保障大鼠福利，保护操作人员安全，又确保治疗效果，提高实验效率。

摘要

在临床实践中进行艾灸时，受试者需要保持情绪稳定和体位舒适，以避免艾灰掉落、烫伤皮肤以及疗效不佳等问题。在大鼠艾灸实验中也存在类似问题。为了模拟临床实践，动物实验中需要引入一种实验装置，即具有固定大鼠与同步实施艾灸治疗功能的艾灸装置，使实验大鼠在非麻醉状态下能够安静、舒适地接受艾灸治疗。

本研究团队设计了一种大鼠艾灸实验平台。该装置由木板框架、支撑底板、多个固定组件和分隔组件构成，能够实现对大鼠进行无束缚艾灸的操作模式，避免使用麻醉和造成烫伤，同时暴露背部多个穴位。该操作可避免对大鼠及操作人员造成身心损伤，提高研究效率，进一步推动艾灸动物实验的发展与研究。

该装置结构简单，易于操作和推广，设计全面且具有创新性，可重复使用，适用于以艾灸为主的实验大鼠研究。本文主要介绍用于大鼠艾灸的实验平台装置的结构、利用该装置进行实验大鼠隔药饼灸的基本操作流程，并描述大鼠慢性肾功能衰竭（CRF）模型的建立方法及典型的实验结果。

引言

艾灸随着火的应用而出现。古代医生偶然发现，身体某些部位经火灼烧后可缓解不适症状。经过长期实践，逐渐选用"Artemisiae Argyi Folium"作为主要的艾灸材料¹。艾灸是中医学的重要组成部分，与中药汤剂和穴位针刺并列，这三大中医疗法在多种疾病中被广泛应用。

早在《黄帝内经》时期，中国医生就常使用艾灸疗法治疗疾病。艾叶（Artemisiae Argyi Folium）是一种具有温经止血、散寒止痛功效的中草药，常用于中医外治法，也可用于中药汤剂的配制。艾灸是一种外治法²，将艾绒或其他药物置于体表穴位上燃烧，利用艾火的温和热力及药物作用来治疗疾病³。

作为常用的治疗方法之一，艾灸已在临床实践中广泛应用。随着艾灸治疗应用范围的不断扩大，越来越多的研究致力于探讨艾灸的作用机制，并开展了大量动物实验^4,5。

艾灸方法可分为直接艾灸和间接艾灸。将艾炷直接置于皮肤上施灸的方法称为直接艾灸。间接艾灸则是在艾炷与穴位之间垫上药物或其他材料。艾灸可用于治疗多种疾病，如肠易激综合征⁶、慢性疲劳综合征⁷和膝骨关节炎⁸。

本文主要探讨隔药饼灸的作用机制。隔药饼灸属于间接灸法，是将艾炷置于药饼上进行施灸的一种方法。目前研究表明，艾炷燃烧产生的红外辐射和温热效应、艾叶焦油的化学成分以及对穴位的刺激，可通过增强药物向穴位的渗透而达到防治疾病的效果⁹。因此，隔药饼灸主要通过艾灸、药物和穴位三者共同产生"综合作用"¹⁰。

既往研究表明，艾灸是治疗慢性肾功能衰竭（CRF）的有效方法^{11,12,13,14,15}，但其潜在作用机制尚不明确。我们一直致力于慢性肾功能衰竭的临床与动物研究。目前，我们正基于内质网应激介导的蛋白激酶RNA样内质网激酶（PERK）信号通路，开展艾炷隔药饼灸对慢性肾功能衰竭大鼠的实验研究。通过本项动物实验，旨在初步阐明艾灸治疗慢性肾脏病的潜在作用机制。在本实验中，对大鼠实施艾炷隔药饼灸 是关键操作步骤。

在先前的实验¹⁶中，使用饲养笼的盖子来捆绑并固定大鼠。为了保护操作人员，在捆绑前需要对大鼠进行麻醉。然而，Sprague-Dawley（SD）大鼠容易产生恐惧和惊吓反应，捆绑操作极易引起大鼠躁动不安。常出现大鼠体位固定不良、穴位定位偏移、实验时间延长以及操作人员受伤等问题。

此外，若束缚过紧，容易导致大鼠呼吸困难，不利于动物福利；若束缚过松，大鼠易发生挣扎和身体移动，导致艾炷脱落并灼伤皮肤，影响实验结果。根据文献报道，动物实验中仍普遍采用束缚方式^16,17,18，且大多数实验装置仅能实现固定，难以兼顾艾灸等其他技术的实施¹⁹。因此，在确保动物福利和实验规范性与效率的前提下，实现固定与艾灸功能的整合，已成为研究人员关注的重点方向之一。

方案

该方案遵循云南中医药大学的动物护理指南，并已获得云南中医药大学动物伦理委员会的批准。实验动物福利与伦理审查编号为 R-062021G098。

1. 艾灸实验平台装置（图1）

注意：我们根据大鼠前后肢之间的距离及其行为学和生理学特征，设计并构建了大鼠艾灸实验平台装置。

1. 艾灸装置的尺寸
   1. 使用防撞板材料和木板制作装置；整体尺寸为 52 cm 长 × 23.5 cm 宽 × 64 cm 高，装置底部面积为 1222 cm².
      注意：艾灸操作在此高度的平台上进行，可使大鼠保持安静。
2. 艾灸装置的主体框架
   1. 使用防撞板材制作整个装置的底座：底板尺寸为长52 cm、宽23.5 cm，表面为白色。确保底座占装置总重量的较大比例，以稳定整个装置。
   2. 使用实木制作设备的 elevated platform，尺寸为 60 厘米高。
      注意：这是整个仪器的主框架，用于稳定整个装置，并支撑大鼠直立放置。
   3. 在高台上方设置五个放置槽，尺寸为 10 cm 长 × 6 cm 宽 × 10 cm 高。使用 用于分隔放置槽的间隔板（10 cm 长 × 1.3 cm 宽 × 10 cm 高），其尺寸对应大鼠直立时前肢与后肢之间的距离。
3. 艾灸装置的组成部分
   1. 在放置槽顶部固定两条不锈钢条。每条固定的不锈钢条为直角等边钢条，长40 cm，宽1.4 cm（两侧宽度相同），带有15个孔。固定条上的三个孔对应每个槽位，用于固定李子形手柄螺钉和移动软管。相邻孔之间的距离为7 厘米
   2. 将可调梅花手柄螺钉置于由304不锈钢制成的隔热网两端，并连接至固定隔热网和固定条。
   3. 将每个放置槽的上端与由镀锌板框架包围的可升降隔热网连接，并将该框架与两端的梅花手柄螺钉相连。在隔热网中部放置304不锈钢圆形网片材料 防止艾灰掉落烫伤大鼠，并固定大鼠以方便进行艾灸。
   4. 将不锈钢可动软管（34 cm长）的底端用不锈钢固定条固定，顶端用管夹连接板固定。
      注意：可移动的软管便于在悬灸操作过程中调整艾条的位置。
   5. 使用铝合金制成的管夹将不锈钢可动软管与艾灸夹连接。
   6. 将不锈钢艾灸夹连接至管夹连接板，可同时固定8-10根艾条进行艾灸。
      注意：可移动软管、管夹连接板和艾灸夹可用于大鼠悬灸操作。

2. 建立大鼠慢性肾衰竭模型

1. 将24只SPF级SD雄性大鼠（3-4周龄，体重180-200 g）适应性饲养1周。饲养环境温度保持在18-24 °C，相对湿度40-70%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。每笼饲养6只，自由饮水和摄食普通饲料。
2. 建立慢性肾功能衰竭（CRF）大鼠模型。根据随机数字表并按照本方案，选取6只大鼠作为对照组，其余18只作为模型组。对照组（n = 6）给予蒸馏水（10 mL∙kg^-1∙day^-1）和普通饲料，模型组（n = 18）给予腺嘌呤混悬液（150 mg kg^-1∙day^-1）和高蛋白饲料，连续干预21天。
3. 每日观察并记录大鼠体重、精神状态及饮食情况。21天干预结束后，所有动物禁食12小时，随后进行眼眶采血。
4. 采集眼眶血液样本。
   1. 用异氟烷短暂麻醉大鼠。用非优势手抓住大鼠背部，用拇指和食指对称固定大鼠头部和面部，充分暴露一侧眼角，保持该体位。
   2. 用优势手将长度为3 cm的熔点毛细管夹在拇指与食指之间，缓慢旋转毛细管，以45°角插入大鼠内眼角静脉丛，直至血液缓慢流出毛细管。
   3. 将150-200 µL血液收集至0.5 mL抗凝采血管中，轻柔拔出毛细管，并用棉球压迫眼眶止血。
5. 迅速充分震荡抗凝管，使用全自动生化分析仪检测血浆肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）。
   注：Scr和BUN水平升高表明CRF模型建立成功。
6. 将大鼠分为四组：A：对照组，6只，不予任何处理；18只模型大鼠分为三组：B：（模型组，不给予药物或艾灸治疗）、C：（氯沙坦钾组，经灌胃针12 G给予2.33 mg∙kg^-1∙day^-1）和D：（隔药饼灸组，在双侧Shenshu [B23] 和双侧Pishu [B20] 穴位施以隔药饼灸）。

3. 治疗阶段

注意：A组和B组不给予任何处理，而C组和D组每天处理一次，持续24天，每处理12天后休息2天。

1. 治疗前的准备工作
   1. 准备300 g黄芪干根、300 g党参干根、200 g熟地黄干根、100 g炙淫羊藿草和100 g 山茱萸混合这些粉末。
   2. 放入500 g的 艾叶 将艾叶放入中药粉碎机（转速34,000转/分钟）粉碎5分钟，将粉碎后的粉末转移至平板上，用600目筛网过筛。经过两轮筛分后，弃去粗艾绒，将细艾绒装入袋中备用（图2).
   3. 用细艾绒填充模具，制成直径0.5 cm、高0.5 cm的小艾炷。或者，也可用双手拇指与食指揉搓艾绒，捏成艾炷图3A).
   4. 通过将一支5 mL注射器切割成四个厚度为0.5 cm的圆形塑料环，并将这四个环粘合在同一水平面上（呈边长为26 cm的正方形四角），制备中药饼模具 毫米 图 3D).
   5. 按1:1比例将药粉与水混合制成药泥，填入中药饼模具中图 3E将药饼留在模具中，并存放于干燥处。
2. 标记穴位
   1. 按以下方法定位穴位： 申述 （B23），第二腰椎两侧，每侧一个穴位； 皮书 （B20），两侧第11胸椎的肋间各一穴位，每侧一个穴位图 4).
      注意：有关穴位位置，请参考 实验动物针灸操作手册²⁰.
   2. 用厚橡胶手套戴在非惯用手，轻轻罩住大鼠头部，用惯用手定位大鼠背部的穴位，然后用彩色标记笔标记穴位。
3. 放置大鼠
   1. 戴上厚橡胶手套。用惯用手的拇指和其他四指轻轻夹住大鼠背部和颈部的皮肤。用非惯用手的拇指和食指轻轻夹住大鼠的尾巴。
   2. 将大鼠提起，使大鼠头部对准放置位置 特殊艾灸平台的插槽，并缓慢将大鼠向前移动，确保大鼠前爪接近放置位置的边缘 狭缝以及大鼠爬入狭缝的行为。
      注意：开始前对整个艾灸平台进行消毒。抓取大鼠前，轻轻触摸大鼠背部或轻声与其说话以使其镇静。将隔热网高度从低位（未使用时）调节至最高，便于大鼠进入。
4. 大鼠固定
   1. 用双手的拇指和食指分别捏住保温网两端的梅花螺钉。旋松梅花螺钉，将保温网降至适当位置，贴近大鼠背部但不造成压迫，然后拧紧螺钉。
5. 放置艾绒锥和药饼。
   1. 将制备好的药饼模具根据大鼠体表穴位标记，放置于对应双侧脾俞（B20）和肾俞（B23）穴位的隔热网上。共四个穴位，每个穴位对应一个药饼。
   2. 将艾绒锥平稳地放置在药饼上。
6. 艾灸
   1. 用打火机点燃艾炷，开始进行艾灸，直至艾炷完全燃尽，余热自然散去（湿药饼变干）。
   2. 在同一个穴位上更换新的艾炷和药饼，继续施灸，直至艾炷燃尽且药饼变干。每个穴位共重复操作5次。
      注意：在更换新的艾炷和药饼之前，需对可拆卸的隔热网进行清洁和消毒。
   3. 每个穴位灸治五壮后，将艾炷和药饼熄灭并浸入盛有水的废弃物容器中。
      注意：每个穴位施以五壮艾灸；每壮艾炷燃尽后可更换新的艾炷。
7. 将大鼠放回笼中
   1. 将空的饲养笼置于大鼠前方，靠近艾灸平台放置槽的下端，并保持静止。轻拍大鼠臀部，使其从放置槽移动至饲喂笼内。待大鼠进入后，放下笼子。用惯用手抓住大鼠背部的毛发，牢固固定大鼠，并将其放在地面上进行进一步观察。
   2. 观察大鼠是否有呼吸急促、情绪是否稳定、皮肤表面是否被烫伤。若无异常，将其放回笼中；若出现烫伤，立即在皮肤表面涂抹烫伤药膏，并将其置于单独的笼子中。

4. 取样阶段

1. 经过24天治疗后，准备 大鼠饲养12小时 采样前需禁食数小时。
2. 将异氟烷倒入气体麻醉机中，使用2-3%异氟烷对大鼠进行麻醉。2-3分钟后，确认反射消失（用手术镊夹住尾巴以检查是否无任何反射），并继续 存在 心跳，并以1-1.5%异氟烷转为维持麻醉。
3. 从准腹主动脉插入针头，采集5 mL血液。将血液静置2 h后，在2490 × g 4 °C下离心10分钟，将血清上清液转移至1.5 mL微量离心管中用于后续分析。
4. 在维持麻醉状态下对大鼠进行深度麻醉，经腹主动脉取血。随后通过颈椎脱位法处死大鼠。
5. 用手术剪刀和镊子剥离双侧肾筋膜及脂肪组织，收集双肾组织，并用0.9%生理盐水冲洗。称量左、右肾重量，记录重量及形态学特征。
6. 将左肾切成六部分，放入含有4%多聚甲醛的50 mL离心管中浸泡、固定并保存，以保护肾组织。用一把刀沿纵向和两把刀沿横向将右肾切成六块，分别放入六个2 mL冻存管中，立即置于液氮中，随后转移至-80 °C冰箱中保存。

5. 检测阶段

1. 取适当大小的右肾组织用于蛋白质提取、凝胶电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、化学发光、显影、定影及胶片扫描。
2. 使用凝胶图像分析系统（例如 Image-Pro Plus 6.0）分析条带的灰度值，并计算每种蛋白质的含量。
3. 将左肾组织进行脱水、透明、石蜡包埋、切片（厚度为 4 µm），经苏木精-伊红染色和马松三色染色后，在光学显微镜下以 200 倍放大观察肾组织的病理变化²¹。

结果

肾脏形态学
如图所示 图5与其他组相比，第X组肾脏的大小、颜色和质地 D （隔药饼灸组）的指标更接近于正常组。模型组和氯沙坦钾组的肾脏形态显示出不同程度的白色纤维化。

肾脏重量
图6 表明A组左肾重量与B组存在显著差异，说明慢性肾功能衰竭（CRF）模型建立成功。A组左肾重量 D 更接近于第2组 A，而各组左肾重量 B 和 C 与对照组相比具有显著差异 D.

B组的右肾重量与A组相比存在显著差异，表明慢性肾功能衰竭（CRF）模型...

讨论

临床上， 针灸治疗要求患者保持平静、放松，避免过度愤怒和饥饿，强调“平和”的状态。然而，目前的 针灸实验实践仍以束缚动物为前提，这不仅违背了实验的初衷，也不符合临床实际。束缚动物会导致动物恐惧和愤怒，迅速升高实验动物体内肾上腺素等激素水平，从而影响实验结果²²。在进行动物针灸实验操作时，必须尽快解决这些问题，以确保实验的准确性并保障动物福利。艾灸对大鼠的刺激较强，加之其性情较为暴烈，若实验过程中无法对大鼠进行安全有效的固定，可能导致操作者受伤、增加疾病传播风险，并影响实验数据的准确性。由于中药饼隔姜灸治疗时间较长、疗程较长，因此需要一种能够耐受长期艾灸的固定装置。研究团队发明的大鼠艾灸实验平台能够克服这一难题，更贴近临床实际。

实验过程中需牢记以下要点。首先，泥的干湿程度目前尚无准确的定量标准。文中提到的泥中粉末与水的比例约为1:1，仅为大致比例，具体数值取决于实验大鼠的数量及操作者的经验。制备时需使泥干燥但不结块，湿润但不挤出水分；过湿或过干均会影响实验结果。使用模具制成的艾炷相对较松，容易散开，但仍需用力捏紧。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 mL 肝素锂生化管	石家庄康为士医疗器械有限公司	220518	血液采集
0.9%生理盐水	昆明南疆制药有限公司	/	冲洗
1.5 mL Eppendorf管	北京兰杰科生物科技有限公司	12100024	子包装
2 mL 冻存管	巴洛克生物技术有限公司	88-0151	包装好的肾脏
4 °C型冰箱	海尔集团有限公司	BCD-236WDGL	储存
5 mL 注射器	四川新世纪医用高分子制品有限公司	20211115	灌胃
50 mL 离心管	北京朗科生物技术有限公司	CT-002-50A	包装好的肾脏
12 G 灌胃针	北京中科恒天科技有限公司	12#55mm	灌胃
96孔板	北京兰杰科生物科技有限公司	11510	蛋白质浓度测定
-80 °C 冷冻室	赛默飞世尔科技	991	储存
腺嘌呤	北京博奥拓技术有限公司	A0607	药物成型
BCA 显色剂	碧云天生物工程有限公司	P0010	蛋白质浓度测定
BCL-2蛋白抗体试剂	Abcam 上海贸易有限公司	ab196495	蛋白质印迹法
Caspase-3 蛋白抗体试剂	Abcam 上海贸易有限公司	ab184787	蛋白质印迹法
化学发光成像系统	上海勤翔科学仪器有限公司	100240073	蛋白质条带成像
中药粉	云南中医药大学第二附属医院	/	治愈
直接上样彩色预染蛋白分子量标准	北京康润诚业生物科技有限公司（GenStar）	M221	蛋白质印迹法
一次性采血针	中国台湾柳营三里医疗科技发展有限公司	YZB/国 0411-2010	采血
一次性人体静脉血液样本采集容器	中国台湾柳营三里医疗科技发展有限公司	20210901	血液采样
DK-30 自动制冰机	河南兄弟仪器设备有限公司	SHDX0023	制冰
ECL 化学发光底物试剂盒	北京兰杰科生物科技有限公司	BL520B	将曝光胶片中的潜影转化为可见影像
电子天平	上海然昊电子有限公司	JCS-31002C	测量大鼠的体重和肾脏重量
冷冻切片机	赛默飞世尔科技	HM525 NX	切片机
全自动生化分析仪	天津微纳芯科技有限公司	PV2112001Z02410305	肾功能检测
气体麻醉系统	中实科技有限公司	ZS-MV-1	麻醉
甘氨酸	北京索莱宝科技有限公司	货号 G8200	运行缓冲液，Western 转膜缓冲液
HE染色试剂	北京索莱宝科技有限公司	G1120	染色
高蛋白饲料	江苏协同生物工程有限公司	XT19008	喂养
智能型实验室超纯水机	重庆华畅水处理工程有限公司	15L	过滤
内参 β-肌动蛋白	江苏秦科生物研究有限公司	AF7018	蛋白质印迹法
异氟烷	江苏中牧倍康药业有限公司	20220701	麻醉
液氮	昆明博泰干冰销售有限公司	/	肾脏组织冷冻
氯沙坦钾片	默克雪兰诺 &默沙东（中国）投资有限公司	J20180054	治愈
低温高速组织研磨仪	武汉赛维尔生物科技有限公司	SKZ3F20200191	组织研磨
马松染色试剂盒	北京索莱宝科技有限公司	G1340	染色
甲醇	广东光华科技股份有限公司	20220519	Western 转膜缓冲液
Mini-PROTEAN Tetra	博乐生命医药产品（上海）有限公司	552BR 233193	电泳
艾灸	云南中医药大学第二附属医院	/	治愈
Multiskan Spectrum 微孔板分光光度计	TECAN	火花	检测组织蛋白的吸光度和浓度
手术剪	张家港市金丰鹿刀切割厂	201118	切开皮肤
多聚甲醛	北京兰杰科生物科技有限公司	BL539A	固定组织
PERK蛋白抗体试剂	上海普迈生物科技有限公司（CST中国代理商）	3192	蛋白质印迹
正荧光显微镜	卡尔·蔡司苏州有限公司	5446000456	拍摄图片
预制胶水	德润诚（北京）生物科技有限公司（ACE中国代理）	B230418	蛋白质印迹法
ProteinFind 山羊抗兔 IgG(H+L)，HRP 标记	上海鼎然电子科技有限公司（TRAN）	HS101	蛋白质印迹法
研磨机	合肥荣事达小家电有限公司	RS-FS1401	粉碎的中药
PVDF膜	默克密理博公司	IPVH00010	蛋白质印迹
冷藏离心机	Hettich Precision Technology (Zhuhai) Co., LTD	MIKRO 220R	离心
RIPA 裂解液	北京索莱宝科技有限公司（Solarbio）	R0010	裂解组织
毛细管采样	江苏康健华医疗器械有限公司	20160157	内眦取血
烫伤膏（紫连膏）	云南省中医医院	/	用于治疗艾灸引起的烫伤
脱脂奶粉	广州赛国生物科技有限公司（BIOFROXX）	1172GR500	Western 封闭缓冲液
手术刀片	上海医疗器械有限公司	JOBO10	切口肾脏组织
手术刀柄	上海医疗器械有限公司	J11010	安装刀片
TS-200 轨道摇床	海门麒麟铃制造有限公司	TS-8S	凝胶固定
Tween 80	MedChemExpress	HY-Y1819	TBST
镊子	上海医疗器械有限公司	JD1050	夹取艾绒
兽药*微核心肾功能检测试剂盘	天津微纳芯科技有限公司	47031-35.5-0145-0227-62-220750	肾功能检测