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方法文章

利用成像流式细胞术研究微生物自聚集

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DOI：

10.3791/65788

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2023年9月29日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, 2Ilse Kats Institute for Nanoscale Science & Technology, Ben-Gurion University of the Negev, 3Department of Plant Pathology and Microbiology, Faculty of Agriculture, Food and Environment, The Hebrew University of Jerusalem, 4The Scojen institute for synthetic biology, Reichman university

本文内容

摘要

本方案描述了一种利用成像流式细胞术定量测定微生物自聚集的方法。

摘要

有益菌和益生菌在其宿主中发挥着至关重要的作用，可提供多种健康益处，包括增强对传染病的免疫力。乳杆菌科（Lactobacillaceae）由已确认具有益生特性的革兰氏阳性菌组成。本研究采用乳杆菌科物种作为模型，以展示单细胞高通量分析在研究细胞聚集方面的有效性，重点分析这些有益菌对饮食中简单碳水化合物的响应。

本研究展示了成像流式细胞术（IFC）如何克服益生菌在有无碳水化合物存在条件下其组装方式的根本差异。IFC 结合了传统流式细胞术的强大功能与高速性以及显微镜的空间分辨率，能够在一系列有益细菌菌株和不同条件下，以表型明确的方式进行高通量的复杂形态测量。本实验方案揭示了乳杆菌科细菌的自发聚集特性，并阐明了其对膳食碳水化合物的响应，有助于理解这些益生菌发挥有益作用的机制。

引言

细菌的自身聚集被认为是生物膜形成的第一步。在此过程中（有时也称为自身凝集或絮凝），同类型的细菌会形成多细胞团块，最终沉降到培养管底部，或附着于其靶组织或表面1。

自聚集是一种广泛观察到的现象，目前已在多种革兰氏阴性病原菌中发现，例如机会性病原菌Acinetobacter baumannii2、牙源性病原菌Aggregobacter actinomycetemcomitans3以及新发传染病原菌Burkholderia pseudomallei4。自聚集现象也已在多种益生性革兰氏阳性菌株中被报道5,6,7,8。在嗜酸乳杆菌（Lactobacillus (L.) acidophilus）中，自聚集部分由S层蛋白介导，并与木聚糖黏附能力相关7。类似地，我们发现葡萄糖依赖性自聚集与多种益生菌种的黏附特性增强之间存在相关性（通过黏蛋白黏附能力判断），这些菌种包括鼠李糖乳杆菌GG株（Lacticaseibacillus rhamnosus GG）、干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus casei）、嗜酸乳杆菌（L. acidophilus）、副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）和植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）5。增强的自聚集很可能反映了细胞黏附素在葡萄糖及其分解代谢产物刺激下表达水平的变化9。尽管自聚集的分子机制仍有待阐明，已有研究表明该过程会改变聚集细菌的表型，使其对环境应激因子具有更强的耐受性1，同时对群体感应分子的敏感性也有所提高10。

已有多种方法用于检测自聚集现象；其中一种实验方法是将培养物在窄口培养管中静置一定时间。对照培养物保持浑浊，而发生自聚集的培养物则会沉降至管底。更为定量的方法是通过沉降或沉淀实验来测定自聚集能力11。

近年来，流式细胞术也越来越多地被用于研究细菌的自发聚集现象。该方法适用于分析尺寸大约在0.5至1000 µm之间的颗粒。单个细菌或形成的聚集体被悬浮于液体中，进入流动液流后可逐一被检测11。通过记录前向散射光，可以测量细胞或聚集体的相对大小。该方法相对快速且简便，但无法检测多个参数，例如聚集体的尺寸或聚集体中细胞的平均数量。因此，可结合显微镜技术进行补充，以检测更多参数12。然而，传统显微镜技术耗时较长，从而限制了检测样本的数量以及分析的统计效力。总体而言，成像流式细胞术相较于传统流式细胞术具有多项优势，例如可同时分析细胞形态与表型、进行基于图像的分析、检测稀有事件以及验证流式细胞术数据13。这些优势增强了流式细胞术的功能，有助于对细胞群体进行更详细的分析。

本研究提供了一种利用成像流式细胞术监测乳酸菌（LAB）自聚集现象的有价值方案。这些革兰氏阳性杆菌为兼性厌氧菌，属于乳酸菌群。它们是高效的葡萄糖发酵菌，以乳酸作为碳水化合物代谢的主要终产物14。这类细菌是微生物组中有益的核心成员，天然存在于人类和动物的胃肠道（GIT）以及女性泌尿生殖道中15。因此，准确表征其自聚集特性在生物技术和临床研究中具有重要意义。

我们先前的研究结果表明，不同益生菌菌株之间的自聚集基础水平存在差异。这种异质性受到用作碳源的不同碳水化合物的影响5。为了克服益生菌细菌这一基本特性，本研究利用成像流式细胞术（IFC）在单细胞水平上监测了饮食来源的碳水化合物对自聚集的影响。这种基于IFC的方法结合了传统流式细胞仪的高通量与快速检测能力以及显微镜的高分辨率，因此能够以表型明确的方式进行高速、复杂的形态测量16,17。该方法可拓展应用于其他益生菌和致病菌，结合荧光报告系统以监测基因表达，或使用荧光标记菌株以检测特定细菌种类在异质性聚集体中的存在与丰度。

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方案

以 Lacticaseibacillus rhamnosus GG（LGG）的模板为例，.ast 文件见于补充代码文件1。

1. 培养基制备

  1. 按照生产商说明配制乳杆菌MRS肉汤（1 L去离子水中加入55 g）以及含1.5%（w/v）琼脂的乳杆菌MRS琼脂平板（参见材料表）。经高压灭菌后，培养基可直接使用，或保存于4 °C。
  2. 配制50%（1 L去离子水中加入15 g）胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）（参见材料表），并在TSB中添加1%（w/v）D-(+)-葡萄糖和1%（w/v）D-(+)-棉子糖，随后进行高压灭菌。建议储存于4 °C以避免污染。
  3. 对于含葡萄糖的缓冲培养基，配制TSB并添加1%（w/v）D-(+)-葡萄糖、5 mM磷酸二氢钾与磷酸氢二钾以及100 mM MOPS（3-(N-吗啉代)丙磺酸，参见材料表），调节pH至7，然后进行高压灭菌以灭菌培养基。

2. 样品制备

注意：此步骤涉及评估细胞在摄入可发酵或不可发酵糖后发生的聚集反应。样品制备过程的示意图见图1。

  1. 从冷冻甘油菌种（50% 甘油）中划线接种乳杆菌科菌株至乳杆菌 MRS 琼脂平板（含 1.5% 琼脂）。
    注意：在本示例实验中，使用了以下益生菌菌株：Lactobacillus acidophilus（ATCC 4356）、Lacticaseibacillus casei（ATCC 393）、Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei（ATCC BAA-52）、Lactiplantibacillus plantarum（ATCC 8014）以及 Lacticaseibacillus rhamnosus GG（ATCC 53103）（LGG）。为将本方法扩展至厚壁菌门其他益生菌成员，选用了 Bacillus coagulans（ATCC 10545）。
  2. 在 37 °C 静置条件下培养过夜。
  3. 用单个菌落接种 5 mL 乳杆菌 MRS 肉汤，并在 37 °C 静置条件下培养过夜。
  4. 将上一步所得菌液按 1:100 比例稀释于 3 mL 50% 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、含 1%（w/v）D-(+)-葡萄糖的 TSB 或含 1%（w/v）D-(+)-棉子糖的 TSB 中。
  5. 在 37 °C 静置条件下培养过夜。
  6. 通过将细胞在培养基中均匀混悬制备样品，并轻轻涡旋第 2.5 步中的菌液管。轻柔倒置试管直至完全混匀。将 200–300 µL 混悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。
    ​注意：切勿对样品进行超声处理，以免破坏聚集体。在步骤 3.4 至 3.10 的数据采集过程中，可能出现样品浓度过高的情况。若观察到样品流速极慢或完全不流动，可用相应的新鲜培养基稀释样品。

3. 数据采集

  1. 根据制造商提供的说明设置成像流式细胞仪（参见 材料表).
  2. 将785 nm激光功率设置为5 mW，用于暗场测量（相当于传统流式细胞术中的侧向散射，简称SSC）。选用数值孔径（N.A.）为0.9的60倍物镜，选择 高灵敏度，并将速度设置为 低.
  3. 在采集任何数据之前，确保散射光通道（SSC）中校准微球流的稳定性。点击 播放 按钮在 "流体学" 检查盒子中的珠子图像质量。珠子图像应清晰锐利。
  4. 按压 加载 按钮，并将一个装有样品（来自步骤 2.6）的离心管放入支架中。
  5. 创建一个新的散点图 "工作区" 盒。点击 新的散点图 在明场通道中选择与SSC通道强度相对应的区域。排除随样本一同在仪器中运行的校准微珠。
    注意：可通过仅加载缓冲液样本并识别面积上的珠子来排除珠子干扰 与. SSC 散点图。然后使用 创建多边形区域 按钮
  6. 在 "采集设置" 盒中，输入 样本名称指定数据存储位置，选择记录的群体（不含微珠的所有细胞），并设置采集事件数。通常采集 10,000–20,000 个事件即可。
  7. 点击 记录 位于的按钮 "采集" 盒子，当达到指定事件数量时，采集过程将自动结束。
  8. 点击 返回 单击按钮以卸载试管，并在小窗口提示时从支架中取出试管。
  9. 对每个样本重复步骤 3.5–3.9。
  10. 保存模板以保持后续重复实验数据采集的一致性。

4. 数据分析

  1. 测量群体中自聚集的百分比（%）。
    1. 使用 IDEAS 软件（参见材料表）分析成像流式细胞仪获取的数据。
    2. 通过将原始文件（.rif）加载到分析软件中，从原始文件（.rif）创建一个数据分析文件（.daf）。点击文件按钮，打开所需的（.rif）文件。在弹出的窗口中，点击使用采集分析，然后点击确定。
    3. 在明场通道中创建梯度均方根（Gradient RMS，图像对比度和聚焦程度的度量）的直方图，以识别聚焦良好的事件。在分析区域中，点击新建直方图按钮。在"新建直方图"窗口中，选择要分析的采集样本中的群体，并在"x 轴特征"中选择明场通道的梯度均方根（Gradient RMS）。
      1. 在分析区域中点击创建线性区域按钮，绘制门控以排除未聚焦的事件（图 2A）。
        注：通常，"聚焦"线性区域应包含梯度均方根得分最高的 80%–90% 的事件，但针对"在焦"细胞的具体阈值应根据每次实验设置确定。
    4. 创建明场通道中面积（µm2）与长宽比（最佳拟合椭圆的宽度除以长度）的散点图。在分析区域中点击新建散点图按钮。在"新建散点图"窗口中，选择步骤 4.1.3 中的聚焦群体。
      1. 为 x 轴特征选择明场通道的面积，为 y 轴特征选择明场通道的长宽比。该散点图可用于对聚焦群体进行门控，以区分单细胞和小聚集体事件与较大的微生物聚集体和链状结构。
    5. 在该散点图上，根据聚集体事件群体的面积值，使用创建矩形区域按钮（或创建多边形区域）绘制一个门控，另为单细胞和小聚集体群体绘制另一个门控（图 2B）。
      注：在某些背景下，区分小聚集体与单细胞可能较困难，因此可将它们合并至同一门控中。较大的聚集体和链状结构亦可依此处理（图 3）。
    6. 手动查看并评估各门控内事件的图像，以验证门控策略的可靠性。如有需要，可调整门控的面积阈值。操作方法为：从"群体"下拉菜单中选择待审查的群体。
      注：门控无固定的面积值，因其可能因所分析细菌的特性而异。
    7. 将数据分析保存为模板。点击文件选项卡，选择另存为模板.ast，然后在相同模板下打开下一个样本（.rif）文件以生成数据分析文件（.daf）（附支持性 .ast 文件作为 LGG 的示例）。
    8. 创建统计表以列举关键事件，用于进一步分析。点击报告选项卡，然后点击定义统计报告。
    9. 在新窗口中点击添加列。添加单细胞/聚集体的计数及%门控统计量。在"统计量"下选择%门控/计数，在选定群体下选择单细胞/聚集体。点击添加统计量将该统计量加入列表，并保存为模板。
    10. 点击生成统计报告，选择统计模板和（.daf）文件进行分析。
  2. 测量聚集体的尺寸分布。
    1. 为分析聚集体事件的平均尺寸，绘制步骤 4.1.5 中聚集体事件群体面积（µm2）的直方图（图 2C）。
    2. 将数据分析保存为模板。点击文件选项卡，选择另存为模板，然后在相同模板下打开下一个样本（.rif）文件以生成数据分析文件（.daf）。
    3. 重复步骤 4.1.7–4.19。对于聚集体尺寸，在统计量下选择均值，在选定群体下选择聚集体，在特征下选择明场通道的面积。点击添加统计量将该统计量加入列表，并保存为模板。
    4. 重复步骤 4.1.9 以生成统计报告。

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结果

结果表明，该方法能够轻松检测膳食糖对乳酸菌（LAB）自聚集能力的影响差异。通过将单个细胞与聚集体分离，该方法可计算出在可发酵或不可发酵膳食糖作用下，发生聚集事件的细胞占所有细胞事件的百分比。此外，还可检测不同处理间聚集体群体平均大小是否存在差异。

图3中的代表性图像展示了每种乳酸菌的设门策略。在LGG和L. paracasei中，检测到了单细胞、小聚集体、大聚集体以及链状结构（图3）。然而，链状结构与较大的聚集体无法完全分离。

如图4所示，不同乳酸菌（LAB）菌株在可发酵或不可发酵糖作用下的聚集特性表现出显著差异，该差异通过聚集事件的群体百分比和平均聚集尺寸进行量化评估5。

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讨论

流式细胞术是定量真核细胞荧光强度的常用方法，但由于细菌细胞体积较大或易形成微小聚集体，该方法可能无法对细菌细胞提供准确的测量结果。这些因素会显著影响在不同条件下自聚集现象及基础聚集体形成水平的精确定量。为解决这一问题，采用成像流式细胞术（IFC）以更清晰地解析碳水化合物如何影响益生菌的聚集行为5。IFC 结合了传统流式细胞术大样本量的统计学优势与常规显微镜的单细胞信息获取能力，通过为每个样本采集大量数字图像，并提取基于图像的数值特征，实现高通量的定量分析16。

此前，成像流式细胞术（IFC）已被用于研究多种细菌行为，例如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的抗生素产生以及双物种生物膜的组成18,19。尽管已有零星报道使用ImageStream流式细胞仪检测自发聚集现象20，但据信这是首次证明其在益生菌细菌研究中...

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致谢

本工作由以色列科学基金会（资助号 119/16）和 IMoh 资助项目 （3-15656）资助，资助对象为 IKG。R.S. 由 Kreitman 研究金支持。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
14 mL 培养管Falcon352051
15 mL 离心管Falcon352096
Bacto 琼脂Baeton,Dickinson and Company214010
Bacto 胰蛋白胨大豆肉汤Baeton,Dickinson and Company211825
D-(+)-葡萄糖SigmaG7021-1KG
D-(+)-棉子糖五水合物Sigma83400-25G
Difco 乳杆菌 MRS 肉汤Baeton,Dickinson and Company288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)FL medical23053
IDEAS 软件Amnis/EMD MilliporeN/A 详情请见：https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark IIAmnis/EMD MilliporeN/A 详情请见：https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS，3-(N-吗啉代)丙磺酸Fisher bioreagentsBP308-500
磷酸氢二钾Fisher Scientific, 174.18 g/molBP363-1
磷酸二氢钾Sigma, 136.09 g/molP0662-500G

参考文献

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