利用成像流式细胞术研究微生物自聚集

摘要

本方案描述了一种利用成像流式细胞术定量测定微生物自聚集的方法。

摘要

有益菌和益生菌在其宿主中发挥着至关重要的作用，可提供多种健康益处，包括增强对传染病的免疫力。乳杆菌科（Lactobacillaceae）由已确认具有益生特性的革兰氏阳性菌组成。本研究采用乳杆菌科物种作为模型，以展示单细胞高通量分析在研究细胞聚集方面的有效性，重点分析这些有益菌对饮食中简单碳水化合物的响应。

本研究展示了成像流式细胞术（IFC）如何克服益生菌在有无碳水化合物存在条件下其组装方式的根本差异。IFC 结合了传统流式细胞术的强大功能与高速性以及显微镜的空间分辨率，能够在一系列有益细菌菌株和不同条件下，以表型明确的方式进行高通量的复杂形态测量。本实验方案揭示了乳杆菌科细菌的自发聚集特性，并阐明了其对膳食碳水化合物的响应，有助于理解这些益生菌发挥有益作用的机制。

引言

细菌的自身聚集被认为是生物膜形成的第一步。在此过程中（有时也称为自身凝集或絮凝），同类型的细菌会形成多细胞团块，最终沉降到培养管底部，或附着于其靶组织或表面¹。

自聚集是一种广泛观察到的现象，目前已在多种革兰氏阴性病原菌中发现，例如机会性病原菌Acinetobacter baumannii²、牙源性病原菌Aggregobacter actinomycetemcomitans³以及新发传染病原菌Burkholderia pseudomallei⁴。自聚集现象也已在多种益生性革兰氏阳性菌株中被报道^5,6,7,8。在嗜酸乳杆菌（Lactobacillus (L.) acidophilus）中，自聚集部分由S层蛋白介导，并与木聚糖黏附能力相关⁷。类似地，我们发现葡萄糖依赖性自聚集与多种益生菌种的黏附特性增强之间存在相关性（通....

方案

以 Lacticaseibacillus rhamnosus GG（LGG）的模板为例，.ast 文件见于补充代码文件1。

1. 培养基制备

1. 按照生产商说明配制乳杆菌MRS肉汤（1 L去离子水中加入55 g）以及含1.5%（w/v）琼脂的乳杆菌MRS琼脂平板（参见材料表）。经高压灭菌后，培养基可直接使用，或保存于4 °C。
2. 配制50%（1 L去离子水中加入15 g）胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）（参见材料表），并在TSB中添加1%（w/v）D-(+)-葡萄糖和1%（w/v）D-(+)-棉子糖，随后进行高压灭菌。建议储存于4 °C以避免污染。
3. 对于含葡萄糖的缓冲培养基，配制TSB并添加1%（w/v）D-(+)-葡萄糖、5 mM磷酸二氢钾与磷酸氢二钾以及100 mM MOPS（3-(N-吗啉代)丙磺酸，参见材料表），调节pH至7，然后进行高压灭菌以灭菌培养基。

2. 样品制备

注意：此步骤涉及评估细胞在摄入可发酵或不可发酵糖后发生的聚集反应。样品制备过程的示意图见

结果

结果表明，该方法能够轻松检测膳食糖对乳酸菌（LAB）自聚集能力的影响差异。通过将单个细胞与聚集体分离，该方法可计算出在可发酵或不可发酵膳食糖作用下，发生聚集事件的细胞占所有细胞事件的百分比。此外，还可检测不同处理间聚集体群体平均大小是否存在差异。

图3中的代表性图像展示了每种乳酸菌的设门策略。在LGG和L. paracasei中，检测到了单细胞、小聚集体、大聚集体以及链状结构（图3）。然而，链状结构与较大的聚集体无法完全分离。

如图4所示，不同乳酸菌（LAB）菌株在可发酵或不可发酵糖作用下的聚集特性表现出显著差异，该差异通过聚集事件的群体百分比和平均聚集尺寸进行量化评估⁵。

讨论

流式细胞术是定量真核细胞荧光强度的常用方法，但由于细菌细胞体积较大或易形成微小聚集体，该方法可能无法对细菌细胞提供准确的测量结果。这些因素会显著影响在不同条件下自聚集现象及基础聚集体形成水平的精确定量。为解决这一问题，采用成像流式细胞术（IFC）以更清晰地解析碳水化合物如何影响益生菌的聚集行为⁵。IFC 结合了传统流式细胞术大样本量的统计学优势与常规显微镜的单细胞信息获取能力，通过为每个样本采集大量数字图像，并提取基于图像的数值特征，实现高通量的定量分析¹⁶。

此前，成像流式细胞术（IFC）已被用于研究多种细菌行为，例如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的抗生素产生以及双物种生物膜的组成^18,19。尽管已有零星报道使用ImageStream流式细胞仪检测自发聚集现象²⁰，但据信这是首次证明其在益生菌细菌研究中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14 mL 培养管	Falcon	352051
15 mL 离心管	Falcon	352096
Bacto 琼脂	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto 胰蛋白胨大豆肉汤	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-棉子糖五水合物	Sigma	83400-25G
Difco 乳杆菌 MRS 肉汤	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS 软件	Amnis/EMD Millipore	N/A	详情请见：https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	详情请见：https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS，3-(N-吗啉代)丙磺酸	Fisher bioreagents	BP308-500
磷酸氢二钾	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
磷酸二氢钾	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G