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方法文章

全面分析脑血栓细胞成分的方法

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DOI：

10.3791/65791

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2023年7月21日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Emergency Department, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, 2Medicine School, Huaqiao University, 3Department of Haematology, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, 4Department of Laboratory Medicine, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究介绍了一种通过溶解血栓、细胞染色和常规血液检查来快速有效地分析脑血栓细胞成分的方法。

摘要

脑血栓是指脑动脉或静脉中的血凝块，是最常见的脑梗死类型。研究脑血栓中细胞成分对于疾病的诊断、治疗和预后具有重要意义。然而，目前研究血栓细胞成分的方法主要依赖于原位染色技术，由于细胞被紧密包裹在血栓内部，该方法难以全面分析细胞成分。先前研究已成功从疣吻沙蚕（Sipunculus nudus）中分离出一种纤溶酶（sFE），该酶可直接降解交联的纤维蛋白，从而释放出其中包裹的细胞成分。本研究建立了一种基于sFE的综合性方法，用于分析脑血栓的细胞成分。该方案包括血栓溶解、细胞释放、细胞染色及常规血液学检查。通过该方法，可对血栓中的细胞成分进行定性和定量研究。本文展示了应用该方法所获得的代表性实验结果。

引言

脑血管疾病是威胁人类健康的三大主要疾病之一，其中缺血性脑血管疾病占比超过80%。目前最受关注的缺血性脑血管疾病为脑血栓形成和脑静脉血栓形成，主要由脑部血栓引起1,2。若治疗不当，患者出院后致残率和死亡率高，且复发率较高3。

近年来，越来越多的研究表明，脑血栓的细胞成分与脑血栓的诊断、治疗及预后密切相关4,5,6因此，血栓成分尤其是细胞成分的数据对于临床诊断和治疗具有重要意义。然而，目前可用的方法尚无法对血凝块成分进行定性和定量的全面分析。例如，基于马修斯猩红蓝（Martius Scarlett Blue）的 原位 染色仅能研究血凝块特定切片中的红细胞/白细胞7基于免疫组织化学（IHC） 原位 染色只能利用特定抗体研究血凝块某些切片中有限的血液成分8基于显微图像的方法仅关注血凝块的特定结构9此外，所有这些方法都费力且耗时10迄今为止，尚无关于定量和定性研究脑血栓细胞成分的实验方法报道。普遍认为，交联纤维蛋白紧密包裹着血栓中的血细胞11因此，交联纤维蛋白的特异性降解及完整细胞的释放对于细胞组分的准确分析至关重要。

既往研究从无管虫（Sipunculus nudus）中分离出一种纤溶酶（sFE），该酶可特异性且快速地降解纤维蛋白12。本文提出了一种基于sFE独特活性分析脑血栓细胞成分的方法。该方案首先利用sFE降解血栓中的纤维蛋白，随后通过瑞氏染色和常规血液检测分析细胞成分13,14。根据该方法，可对脑血栓的细胞成分进行定性和定量研究。这一简单而有效的方案也可应用于其他血栓的细胞成分分析。

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方案

研究遵循华侨大学医学伦理委员会的机构指南进行。脑部血栓在取得患者知情同意后，于福建医科大学附属泉州市第一医院通过手术切除并收集。

1. 血凝块预处理

  1. 将凝块置于洁净的培养皿中，用镊子加入 5 mL 生理盐水，轻轻摇动培养皿，然后用移液器吸除盐水。
    注意：重复洗涤三次。
  2. 用剪刀将凝块剪成更小的碎片（小于 5 mm × 5 mm × 5 mm）。加入 5 mL 生理盐水，轻轻摇动培养皿，然后用移液器吸除盐水。
    注意：重复洗涤三次。确保在洗涤过程中未吸入任何凝块碎片。
  3. 将凝块转移至另一洁净的 U 型板中。
    ​注意：此处可暂停实验流程（将培养板储存于 2–8 °C），之后可继续操作。

2. 溶栓治疗

  1. 用生理盐水将sFE的浓度调整至2000 U/mL，制备sFE工作液。
    注意：sFE的制备依据Tang实验室已建立的成熟方案15。
  2. 向预处理的血凝块中加入300 µL sFE工作液。
  3. 进行第一轮降解。
    1. 将sFE与血凝块的混合物在37 °C孵育0.5 h。
      注意：以生理盐水处理的对照组作为阴性对照。样品在摇床中孵育时不得旋转。
    2. 轻轻混匀样品，用洁净的移液器将液体部分转移至另一干净离心管中。
      注意：剩余的血凝块用于下一轮降解。
    3. 将液体部分在4 °C、200 × g条件下离心5 min。
    4. 用移液器将上清液转移至另一干净离心管，得到回收的sFE溶液。
    5. 用50 µL生理盐水轻轻重悬细胞沉淀。
      注意：细胞混合物储存于2–8 °C，以备后续使用。
  4. 进行后续降解。
    1. 用回收的sFE溶液（步骤2.3.4）在37 °C对剩余血凝块（步骤2.3.2）进行0.5 h的降解。
      注意：后续步骤与第一轮降解相同。降解过程持续至全部血凝块完全降解为止。
  5. 进行细胞收集。
    1. 通过收集每轮降解所得的细胞混合物，制备血细胞样品。

3. 瑞氏染色

  1. 进行细胞涂片。
    1. 将细胞调整至密度为 1 x 106 个细胞/mL。
    2. 取 5 µL 细胞悬液滴加到聚-L-赖氨酸包被的玻片上，然后用盖玻片涂抹均匀。
    3. 室温下自然蒸发干燥液体。
  2. 进行染色。
    1. 轻轻加入 200 µL 瑞氏染液（见材料表），再加入 600 µL 瑞氏B液，混匀，室温染色 10 分钟。
    2. 用清水轻轻冲洗染液。
      注意：染色后的细胞涂片可在室温下保存，以备后续使用。
  3. 进行显微成像。
    1. 使用光学显微镜（见材料表）观察染色后的细胞。

4. 常规血液检查

  1. 将细胞调整至密度为 1 x 106 个细胞/mL。
  2. 根据制造商说明书，使用全自动血液学分析仪分析血小板、红细胞、白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞以及幼稚粒细胞等细胞成分（参见 材料表）。

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结果

在降解过程的初始阶段，发现血凝块具有红色致密结构，而工作溶液无色。孵育30分钟后，工作溶液变为淡红色，表明交联的血细胞已释放到工作溶液中。当孵育时间延长至5小时后，大部分血凝块被溶解，工作溶液呈现淡红色。相反，即使孵育10小时后，生理盐水组（NC）也未见明显变化（图1）。这些结果表明，本方案能够成功释放血凝块中包裹的血细胞。

经瑞氏染色后，在光学显微镜下可清晰观察到细胞组分（图2A）。在所释放的血细胞中，可见大量表面呈轻微凹陷的圆盘状成熟红细胞。载玻片上还观察到大量形状不规则的紫红色小颗粒，即从血凝块中释放出的血小板。白细胞表现出较大的胞浆和浓缩的细胞核。同时还观察到多种类型的粒细胞，如成熟的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞。

借助全自动血细胞分析仪，对细胞成分进行了定量分析。在检测到的细胞中，血小板和红细胞分别占51.25%和45.24%。这些数据与瑞氏染色结果一致。其他血细胞，如白细胞、淋巴细胞、中性粒...

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讨论

sFE 是一种纤溶剂，可直接且有效地降解纤维蛋白12,16。本研究中，采用 sFE 降解脑血栓中的交联纤维蛋白，释放血栓内包裹的细胞，并对血栓中的细胞成分进行定性和定量分析。显微镜数据和常规血液检查表明，血栓内包裹的细胞已被成功释放。此外，经 sFE 处理后，所释放细胞的细胞类型和结构未受到显著影响。因此，首次建立了一种独特、简便且有效的方法，用于分析脑血栓的细胞成分。

由于释放的细胞在体外不如在凝块中稳定，因此需要优化降解条件以降低细胞破裂比例，例如温度、sFE 用量、旋转速度和降解时间。Wright 染色结果显示，10 小时降解组的背景比 5 小时降解组更浑浊。这些差异可能源于细胞碎片及其他细胞组分。此外，流式细胞术数据表明，细胞碎片随降解时间延长而增加（图 2B）。10 小时降解组的细胞碎片率（32.5%）显著高于 5 小时降解组（11.2%）。因此，尽快将释放的细胞从工作液中分离至关重要。为此，在本...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由厦门市科学技术局（3502Z20227197）和福建省科学技术厅（编号：2019J01070，编号：2021Y0027）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
凝集反应板ROTESTRTB-4003
全自动血液分析仪SYSMEXXNB2
自动立式压力蒸汽灭菌器 SANYOMLS-3750
离心管（1.5 mL）BiosharpBS-15-M
洁净工作台AIRTECHBLB-1600
恒温培养箱JINGHONGJHS-400
培养皿（100 mm）NEST704001
DHG系列电热恒温鼓风干燥箱 SENXINDGG-9140AD
电子分析天平DENVERTP-213
滤膜（0.22 µm）Millex GPSLGP033NK
微量冷冻离心机 CenceH1650-W
显微镜载玻片CITOGLAS01-30253-50
Milli-Q ReferenceMilliporeZ00QSV0CN
生理盐水CISENH37022337
光学显微镜NikonECLIPSE E100
Parafilm封口膜BemisPM-996
磷酸盐缓冲液BeyotimeC0221A
移液器吸头（1 mL）AxygeneT-1000XT-C
移液器吸头（200 µL）AxygeneT-200XT-C
移液器（1 mL）Thermo Fisher ScientificZY18723
移液器（200 µL）Thermo Fisher ScientificZY20280
手术刀MARTOR23111
小型旋涡振荡器Kylin-BellVORTEX KB3
镊子HysticHKQS-180
瑞氏染色液BeyotimeC0135-500ml

参考文献

  1. Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
  2. Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
  3. Sacco, R. L., et al. An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).
  4. Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).
  5. Mocsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).
  6. Dhanesha, N., et al. PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke. Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).
  7. Ducroux, C., et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
  8. Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography. Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).
  9. Daraei, A., et al. Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images. Biomolecules. 11 (10), 1536(2021).
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  14. Liou, G. Y., Byrd, C. J. Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need. Cancers (Basel). 15 (9), 2446(2023).
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