本研究介绍了一种通过溶解血栓、细胞染色和常规血液检查来快速有效地分析脑血栓细胞成分的方法。
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本文内容
摘要
摘要
脑血栓是指脑动脉或静脉中的血凝块，是最常见的脑梗死类型。研究脑血栓中细胞成分对于疾病的诊断、治疗和预后具有重要意义。然而，目前研究血栓细胞成分的方法主要依赖于原位染色技术，由于细胞被紧密包裹在血栓内部，该方法难以全面分析细胞成分。先前研究已成功从疣吻沙蚕（Sipunculus nudus）中分离出一种纤溶酶（sFE），该酶可直接降解交联的纤维蛋白，从而释放出其中包裹的细胞成分。本研究建立了一种基于sFE的综合性方法，用于分析脑血栓的细胞成分。该方案包括血栓溶解、细胞释放、细胞染色及常规血液学检查。通过该方法，可对血栓中的细胞成分进行定性和定量研究。本文展示了应用该方法所获得的代表性实验结果。
引言
脑血管疾病是威胁人类健康的三大主要疾病之一，其中缺血性脑血管疾病占比超过80%。目前最受关注的缺血性脑血管疾病为脑血栓形成和脑静脉血栓形成，主要由脑部血栓引起1,2。若治疗不当，患者出院后致残率和死亡率高，且复发率较高3。
近年来，越来越多的研究表明，脑血栓的细胞成分与脑血栓的诊断、治疗及预后密切相关4,5,6因此，血栓成分尤其是细胞成分的数据对于临床诊断和治疗具有重要意义。然而，目前可用的方法尚无法对血凝块成分进行定性和定量的全面分析。例如，基于马修斯猩红蓝（Martius Scarlett Blue）的 原位 染色仅能研究血凝块特定切片中的红细胞/白细胞7基于免疫组织化学（IHC） 原位 染色只能利用特定抗体研究血凝块某些切片中有限的血液成分8基于显微图像的方法仅关注血凝块的特定结构9此外，所有这些方法都费力且耗时
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方案
研究遵循华侨大学医学伦理委员会的机构指南进行。脑部血栓在取得患者知情同意后，于福建医科大学附属泉州市第一医院通过手术切除并收集。
1. 血凝块预处理
- 将凝块置于洁净的培养皿中，用镊子加入 5 mL 生理盐水，轻轻摇动培养皿，然后用移液器吸除盐水。
注意：重复洗涤三次。 - 用剪刀将凝块剪成更小的碎片（小于 5 mm × 5 mm × 5 mm）。加入 5 mL 生理盐水，轻轻摇动培养皿，然后用移液器吸除盐水。
注意：重复洗涤三次。确保在洗涤过程中未吸入任何凝块碎片。 - 将凝块转移至另一洁净的 U 型板中。
注意：此处可暂停实验流程（将培养板储存于 2–8 °C），之后可继续操作。
2. 溶栓治疗
- 用生理盐水将sFE的浓度调整至2000 U/mL，制备sFE工作液。
注意：sFE的制备依据Tang实验室已建立的成熟方案15。 - 向预处理的血凝块中加入300 µL sFE工作液。
- 进行第一轮降解。
- 将sFE与血凝块的混合物在37 °C孵育0.5 h。
注意：以生理盐水处理....
- 将sFE与血凝块的混合物在37 °C孵育0.5 h。
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结果
在降解过程的初始阶段，发现血凝块具有红色致密结构，而工作溶液无色。孵育30分钟后，工作溶液变为淡红色，表明交联的血细胞已释放到工作溶液中。当孵育时间延长至5小时后，大部分血凝块被溶解，工作溶液呈现淡红色。相反，即使孵育10小时后，生理盐水组（NC）也未见明显变化（图1）。这些结果表明，本方案能够成功释放血凝块中包裹的血细胞。
经瑞氏染色后，在光学显微镜下可清晰观察到细胞组分（图2A）。在所释放的血细胞中，可见大量表面呈轻微凹陷的圆盘状成熟红细胞。载玻片上还观察到大量形状不规则的紫红色小颗粒，即从血凝块中释放出的血小板。白细胞表现出较大的胞浆和浓缩的细胞核。同时还观察到多种类型的粒细胞，如成熟的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞。
借助全自动血细胞分析仪，对细胞成分进行了定量分析。在检测到的细胞中，血小板和红细胞分别占51.25%和45.24%。这些数据与瑞氏染色结果一致。其他血细胞，如白细胞、淋巴细胞、中性粒.......
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讨论
sFE 是一种纤溶剂，可直接且有效地降解纤维蛋白12,16。本研究中，采用 sFE 降解脑血栓中的交联纤维蛋白，释放血栓内包裹的细胞，并对血栓中的细胞成分进行定性和定量分析。显微镜数据和常规血液检查表明，血栓内包裹的细胞已被成功释放。此外，经 sFE 处理后，所释放细胞的细胞类型和结构未受到显著影响。因此，首次建立了一种独特、简便且有效的方法，用于分析脑血栓的细胞成分。
由于释放的细胞在体外不如在凝块中稳定，因此需要优化降解条件以降低细胞破裂比例，例如温度、sFE 用量、旋转速度和降解时间。Wright 染色结果显示，10 小时降解组的背景比 5 小时降解组更浑浊。这些差异可能源于细胞碎片及其他细胞组分。此外，流式细胞术数据表明，细胞碎片随降解时间延长而增加（图 2B）。10 小时降解组的细胞碎片率（32.5%）显著高于 5 小时降解组（11.2%）。因此，尽快将释放的细胞从工作液中分离至关重要。为此，在本.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由厦门市科学技术局（3502Z20227197）和福建省科学技术厅（编号：2019J01070，编号：2021Y0027）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 凝集反应板 | ROTEST | RTB-4003 | |
| 全自动血液分析仪 | SYSMEX | XNB2 | |
| 自动立式压力蒸汽灭菌器 | SANYO | MLS-3750 | |
| 离心管（1.5 mL） | Biosharp | BS-15-M | |
| 洁净工作台 | AIRTECH | BLB-1600 | |
| 恒温培养箱 | JINGHONG | JHS-400 | |
| 培养皿（100 mm） | NEST | 704001 | |
| DHG系列电热恒温鼓风干燥箱 | SENXIN | DGG-9140AD | |
| 电子分析天平 | DENVER | TP-213 | |
| 滤膜（0.22 µm） | Millex GP | SLGP033NK | |
| 微量冷冻离心机 | Cence | H1650-W | |
| 显微镜载玻片 | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| 生理盐水 | CISEN | H37022337 | |
| 光学显微镜 | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm封口膜 | Bemis | PM-996 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Beyotime | C0221A | |
| 移液器吸头（1 mL） | Axygene | T-1000XT-C | |
| 移液器吸头（200 µL） | Axygene | T-200XT-C | |
| 移液器（1 mL） | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| 移液器（200 µL） | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| 手术刀 | MARTOR | 23111 | |
| 小型旋涡振荡器 | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| 镊子 | Hystic | HKQS-180 | |
| 瑞氏染色液 | Beyotime | C0135-500ml |
参考文献
- Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
- Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T.
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