Ha-CoV-2假病毒在SARS-CoV-2变异株和中和抗体快速定量中的应用

截至 2023 年 5 月，目前已有超过 7.66 亿例 COVID-19 病例¹.尽管在全球范围内开展了疫苗接种运动，但 SARS-CoV-2 仍在不断传播并感染人们，这主要是由于 Delta （B.1.617.2） 和 Omicron （B.1.1.529） 等新变种的出现推动了新一波感染浪潮 ^2,3,4。鉴于 SARS-CoV-2 在不断发展，开发能够准确测量新变异株的传染性以及疫苗诱导的针对这些变异株的中和抗体的有效性的快速检测非常重要。这些检测对于大流行监测和确定疫苗及其变异株特异性加强针的功效至关重要。

由于 SARS-CoV-2 具有高度传染性，美国疾病控制与预防中心 （CDC） 要求在生物安全级别 （BSL） 3 设施中对 SARS-CoV-2 及其变体进行研究 ^5,6。BSL-3 的这一要求限制了在普通研究和临床实验室中使用活病毒来量化病毒变体及其中和抗体的传染性。此外，传统的 SARS-CoV-2 中和检测，例如使用具有复制能力的活病毒的基于斑块或细胞病变效应的检测，非常耗时且需要较长的潜伏期⁷。已经开发了几种刺突 （S） 蛋白假型 SARS-CoV-2 假病毒来量化中和抗体^{8、9、10、11、12} 的有效性。在 SARS-CoV-2 中，S 蛋白是介导病毒进入^{的主要蛋白质 13}，也是 SARS-CoV-2 疫苗中使用的主要抗原 9,10,14,15,16。S 蛋白假型病毒粒子，例如水泡性口炎病毒 （VSV-G） 或慢病毒的病毒粒子，已用于中和抗体的定量 17,18,19。然而，基于慢病毒的假病毒通常需要 2 到 3 天的感染才能量化报告基因信号。基于 VSV 的假病毒系统通常包含残留的 VSV 病毒，这可能导致高假阳性结果率，通常需要 24 小时的感染²⁰。

Hetrick 等人最近开发了一种新型 SARS-CoV-2 假病毒系统，即混合甲病毒-SARS-CoV-2 假病毒 （Ha-CoV-2）¹²。Ha-CoV-2 为在普通 BSL-2 实验室中快速定量病毒传染性和病毒对中和抗体的敏感性提供了一种新工具。在结构上，Ha-CoV-2 类似于 SARS-CoV-2 病毒粒子，由 SARS-CoV-2 结构蛋白组成，包括 S 蛋白 （S）、膜 （M）、核衣壳 （N） 和包膜 （E），并且没有来自其他病毒的结构蛋白。此外，Ha-CoV-2 颗粒含有来自甲病毒的快速表达 RNA 基因组，可在细胞中快速表达报告基因。Ha- CoV-2 已被证明可以快速测量接种疫苗和康复期个体血清中抗体的中和活性¹²。正如 Hetrick 等人所证明的那样，在时程测定中与基于慢病毒的 SARS-CoV-2 假病毒相比，Ha-CoV-2 早在感染后 2-4 小时表达 Luc 报告基因，而慢病毒假病毒在 24 小时¹² 后表达 Luc。此外，通过使用标准单克隆中和抗体 27BV（见 补充图 1）¹²，进一步证明了 Ha-CoV-2 变体在定量中和抗体方面的潜在应用。这项工作详细介绍了使用 Ha-CoV-2 平台快速量化 SARS-CoV-2 变体的传染性，以 Delta （B.1.617.2） 和 Omicron （B.1.1.529） 变体为例。此外，通过使用标准单克隆中和抗体 27BV¹²，进一步证明了 Ha-CoV-2 变体在定量中和抗体方面的潜在应用。

1. 病毒和病毒颗粒组装

1. 载体:以商业方式购买 SARS-CoV-2 M、E 或 N 以及 SARS-CoV-2 S（野生型，Wt）、Delta （B.1.617.2） 和 Omicron （B.1.1.529） 的表达载体。
   注意:表达载体的蛋白质序列在 补充文件1中提供。这些表达向量的供应商也可以在 材料表下找到。
2. 细胞和细胞培养:在含有 10% 热灭活胎牛血清 （FBS）、50 单位/mL 青霉素和 50 μg/mL 链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中维持 HEK293T 细胞。
   注意:所有细胞培养工作都需要在层流生物安全柜中完成。聚乙烯亚胺 （PEI） 转染通常需要 5-6 小时孵育。需要事先仔细考虑开始时间。
3. 病毒组装和基于 PEI 的共转染:通过HEK293T细胞共转染组装 Ha-CoV-2 颗粒。在共转染前一天，在 10 mL 完全 DMEM 培养基中将细胞接种在 10 cm 细胞培养皿（每个培养皿 4-5 x 10⁶ 个细胞）中。在这项研究中，使用三个培养皿分别用于接种用于组装 Ha-CoV-2 野生型、Delta 和 Omicron 的细胞。
4. 将培养皿在37°C的CO₂ 培养箱中孵育过夜。 第二天早上检查培养皿，确保细胞80%汇合。取出完全培养基，并用 9 mL DMEM 无血清培养基替换。
5. 对于每个培养皿，制备共转染混合物，其中包含 2.5 μg SARS-CoV-2 结构蛋白表达载体（N、E、M）、10 μg pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ（HaCoV2 基因组）和 2.5 μg S 蛋白表达载体（Delta 或 Omicron S 变体）和 45 μL 基于 PEI 的转染试剂。通过孵育 13 分钟（孵育时间不要超过 30 分钟）让共转染混合物形成复合物。
6. 孵育后，将共转染混合物缓慢地逐滴加入每个培养皿中。将培养皿置于37°C的CO₂ 培养箱中6小时。6小时后，除去无血清DMEM，并用完全DMEM培养基代替。共转染后48-60小时收获病毒。
7. 病毒收集和储存:共转染后 48 小时收获颗粒。通过在单层表面反复移液分离细胞，并从每个培养皿中收集细胞，放入15mL离心管中，并以400× g 离心5分钟。收集上清液并通过0.22μM过滤器。将Ha-CoV-2假病毒储存在-80°C。

2.病毒感染性测定

1. 细胞和细胞培养:在含有 10% 热灭活 FBS、50 单位/mL 青霉素和 50 μg/mL 链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中维持 HEK293T （ACE2/TMPRSS2） 细胞。
2. 接种 HEK293T （ACE2/TMPRSS2） 细胞:在病毒感染性测定的前一天，将 HEK293T（ACE2/TMPRSS2） 细胞接种在 96 孔板中的 50 μL 完全 DMEM 培养基中。对于每个 96 孔板，将 2.5 x 10⁴ 个细胞接种到每个孔中，一个板总共需要 2.5 x 10⁶ 个细胞。将96孔板置于37°C的CO₂ 培养箱中过夜。
3. HEK293T（ACE2/TMPRSS2）感染:使用Ha-CoV-2变体颗粒感染HEK293T（ACE2/TMPRSS2）细胞。在感染的早晨，从预先接种的 96 孔板中取出 50 μL DMEM。在37°C下用50μLHa-CoV-2野生型，Delta或Omicron替换培养基18小时。
   注意:可以在此处停止该方案，直到感染达到孵育18小时，并且板已准备好通过荧光素酶测定进行分析。感染的成功取决于由感染细胞中表达的荧光素酶报告基因产生的荧光素酶测定，因此产生的信号越多，Ha-CoV-2变体的感染就越成功。
4. 荧光素酶测定:孵育 18 小时后，将 7.5 μL 细胞裂解缓冲液直接加入每个孔中，并通过轨道振荡混合 2 分钟。在室温下将裂解细胞在裂解缓冲液中裂解至少5分钟。
5. 通过将D-荧光素溶液与萤火虫荧光素酶测定溶液以1:50的比例混合来制备萤火虫荧光素酶测定溶液。对于整个 96 孔板，将 3 mL 荧光素酶底物溶液与 60 μL D-荧光素溶液与 2940 μL Firefly 荧光素酶缓冲液混合。
6. 向细胞裂解物中加入25μL萤火虫荧光素酶测定溶液，并通过轨道振荡1分钟混合板。使用商业荧光素酶

3. Ha-CoV-2 的 RNA 提取和定量逆转录酶 PCR （RT-qPCR）

1. 病毒 RNA 提取:按照制造商的说明，使用商业病毒 RNA 提取试剂盒从 Ha-CoV-2 野生型和 Ha-CoV-2 Delta 和 Omicron 变体颗粒中提取病毒 RNA。将提取的病毒RNA储存在-80°C或立即用于RT-qPCR。
2. RT-qPCR:使用一步法预混液对病毒RNA进行RT-qPCR。在商用PCR机中进行反应。请注意，扩增的靶标是 Ha-CoV-2 的基因组 RNA。使用 Ha-CoV-2 载体 DNA 作为标准品，用于创建标准曲线并计算每个变体的 RNA 拷贝数。

4.中和抗体测定

1. 接种 HEK293T （ACE2/TMPRSS2） 细胞:在测定前一天，将 96 孔板中的 HEK293T （ACE2/TMPRSS2） 细胞接种在 50 μL 完整的 DMEM 培养基中。HEK293T（ACE2/TMPRSS2）电池是商业购买的。
2. 对于细胞计数，从含有 HEK293T（ACE2/TMPRSS2） 细胞的 T75 烧瓶中获取 20 μL 细胞，并与 20 μL 台盼蓝溶液混合。将 20 μL 该混合物加入细胞计数室并计数每 mL 的细胞数。要接种 96 孔板进行感染，每孔使用 2.5 x 10⁴ 个细胞，总共需要 2.5 x 10⁶ 个细胞。将96孔板置于37°C的CO₂ 培养箱中过夜。
3. 中和抗体测定:在无菌聚丙烯 96 孔板中，制备标准 27BV 中和抗体和 Ha-CoV-2 混合物。向板中加入 8 μL 27BV （45 mg/mL），并用 6 μL 无血清 DMEM 连续稀释抗体。
   注意:请务必在孔转移之间交换移液器吸头，并确保抗体和无血清培养基充分混合以产生准确的结果。
4. 向连续稀释的抗体中加入 54 μL Ha-CoV-2 颗粒，并将病毒和抗体混合。在37°C下以5%CO₂连续稀释的27BV预孵育Ha-CoV-2颗粒1小时。孵育 1 小时后，将 50 μL 抗体和 Ha-CoV-2 混合物施加到含有前一天接种的 HEK293T（ACE2/TMPRSS2） 细胞（每孔 2.5 x 10⁴ 个细胞）的 96 孔板上。
5. 对于对照，至少留出三个仅含有 HEK293T（ACE2/TMPRSS2） 细胞的孔。向这些孔中加入 50 μL 完全培养基，作为荧光素酶测定读数的背景信号的非感染孔。
   注意:可以在此处停止该方案，直到感染在37°C下达到孵育18小时，然后准备通过荧光素酶测定分析板。
6. 荧光素酶测定:孵育18小时后，将7.5μL裂解缓冲液直接加入每个孔中，并通过轨道振荡混合2分钟。在室温下将裂解细胞在裂解缓冲液中裂解至少5分钟。
7. 通过将D-荧光素溶液与萤火虫荧光素酶测定溶液以1:50的比例混合来制备萤火虫荧光素酶测定溶液。对于整个 96 孔板，将 3 mL 荧光素酶底物溶液与 60 μL D-荧光素溶液与 2940 μL 萤火虫荧光素酶缓冲液混合。
8. 向细胞裂解物中加入25μL萤火虫荧光素酶测定溶液，并通过轨道振荡1分钟混合板。使用商业荧光素酶

5. 量化和统计分析

1. 数据收集:如图所示，一式三份进行感染和荧光素酶测定（图1）。使用荧光素酶测定读数定量荧光素酶表达。平均值是三个荧光素酶测定读数的平均值。从该平均值中减去来自非感染孔的背景信号读数。标准偏差 （SD） 由荧光素酶测定读数的平均值确定。
2. 数据分析:绘制抗体中和活性图，并使用商业绘图软件计算ID₅₀ （50%抑制剂量）值。ID₅₀ 值定义为抗体抑制稀释度，在该稀释度下，HEK293T（ACE2/TMPRSS2） 细胞感染减少 50%（基于荧光素酶测定读数）。

Ha-CoV-2 颗粒使用五种不同的 DNA 载体组装，这些载体在HEK293T细胞中表达 Ha-CoV-2 RNA 基因组和 SARS-CoV-2 的结构蛋白（M、N、E 和 S）。S 蛋白载体因 S 变体而异。来自原始 Ha-CoV-2 武汉菌株（野生型，Wt）的 S 蛋白被用作阳性对照，并将其与其他两个变体的 S 蛋白一起组装:Delta （B.1.617.2） 或 Omicron （B.1.1.529）。所有变体都使用相同的 M、N、E。共转染后 48 小时收集 Ha-CoV-2（Wt） 和变异颗粒，然后用于感染 HEK293T（ACE2/TMPRSS2） 细胞。通过感染后 18 小时荧光素酶的表达来测量感染性。在该系统中，荧光素酶信号的较高表达水平反映了 Ha-CoV-2 对细胞的较高感染。荧光素酶信号通过RT-qPCR对每个变体的基因组RNA拷贝进行归一化。如 图 1 所示，Ha-CoV-2 Omicron 变体产生的信号比原始 Ha-CoV-2（Wt） 高 4 至 10 倍，表明传染性更高。

此外，还量化了 27BV 中和 HaCoV-2（Wt）、Delta 和 Omicron 变体的能力。27BV 是一种针对 SARS-COV-2 S1 蛋白的 RBD 结构域开发的兔单克隆抗体。对于中和测定，在 96 孔板中连续稀释 27BV，与 Ha-CoV-2 预孵育，然后加入 HEK293T（ACE2/TMPRSS2） 靶细胞。结果表明，27BV对所有测试的变体都具有中和活性（图2）。有趣的是，27VB 对 Omicron 的 ID50 的效力比 Ha-CoV-2（WT） 和 Ha-CoV-2（Delta;图2）。这些结果表明，Ha-COV-2平台可以作为一种快速方法，用于量化新变异株中疫苗诱导的中和抗体。

图 1.Ha-CoV-2变体的组装和定量。 （A） Ha-CoV-2和变异颗粒的组装图示。表达 Ha-CoV-2 报告基因基因组和结构蛋白（M、S、N 和 E）的载体在HEK293T细胞中共转染。共转染后 48 小时收获颗粒（用 Biorender.com 创建病毒粒子颗粒和HEK293T细胞的成像）。（B） Ha-CoV-2变异株传染性的量化。使用单个 Ha-CoV-2 （Luc） 变体的基因组 RNA 拷贝对两种变体（Delta 和 Omicron）的相对传染性进行量化和归一化。野生型是 Ha-COV-2 （Wt），用作比较的对照。进行感染和荧光素酶测定 3x. RU，相对单位。显示均值和标准差 （SD）。 请点击这里查看此图的较大版本.

图2.定量27BV对Ha-CoV-2（Luc）变异株的中和活性 在HEK293T（ACE2/TMPRSS2）细胞感染后18小时分析了27BV的中和活性。ID50 使用相对感染率（荧光素酶活性）与 27BV 浓度计算。 请点击这里查看此图的较大版本.

图3.Ha-CoV-2（GFP）感染HEK293T（ACE2/TMPRSS2）。 组装Ha-CoV-2（GFP）颗粒，然后用于感染HEK293T（ACE2/TMPRSS2）细胞。使用荧光显微镜观察感染后 48 小时的 GFP 表达。左边是受感染细胞的白场，右边是GFP成像。白色条代表 100 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

补充图 1.图形摘要。 Ha-CoV-2假病毒结构和应用。使用 Biorender.com 创建的图像。 请点击此处下载此文件。

补充文件 1.蛋白质序列。 SARS-CoV-2 S、M、N 和 E 蛋白的序列列表。S 蛋白序列还包括 SARS-CoV-2 变体 Omicron （B.1.1.529） 和 Delta （B.1.617.2）。 请点击此处下载此文件。

乔治梅森大学已申请专利，并授权给Virongy Biosciences Inc.进行产品开发。Y.W.是Virongy Biosciences的创始人和顾问委员会成员。B. H 目前是 Virongy Biosciences 的首席执行官兼首席科学官。作者没有其他利益冲突。