一种可自动创建稳定且可重复的无细胞间隙以提高细胞划痕愈合实验可靠性的工具

摘要

通过引入交互体验设计和用户需求分析，我们开发了一种创新的细胞刮刀，可在可重复性、可靠性、实用性、细胞完整性及用户体验方面显著提升细胞创伤愈合实验的效果。

摘要

在伤口愈合实验中，细胞迁移测量的可靠性常因普遍使用的方法学不稳定性（即移液枪头法）而受到削弱。我们介绍了一种旨在克服这些局限性的创新仪器。我们研发的新型细胞刮除器优于现有方法，能够产生更一致且稳定的无细胞间隙。重复的生物学实验表明，细胞刮除器产生的无细胞间隙相较于移液枪头法具有更平直的边缘以及更均匀的尺寸和形状（p < 0.05）。在产品设计方面，该细胞刮除器采用适合实验室环境的优化配色方案，有助于实验结果的观察，并可通过高压灭菌实现重复使用。值得注意的是，处理后细胞刮除器对细胞活力和增殖的影响极小（分别为97.31%和24.41%）。相比之下，移液枪头法导致的细胞活力（91.37%）和增殖水平（18.79%）均较低。本研究将细胞刮除器作为一种新型可重复使用的装置加以呈现，其能够在保持细胞活性的同时生成可重复的无细胞间隙，从而相较于现有技术显著提高了伤口愈合实验的可靠性。

引言

肿瘤具有多种显著特征，例如选择性生长优势、代谢重编程以及免疫调节，这些特征引人注目地促进了肿瘤细胞迁移能力的增强，而细胞迁移是肿瘤细胞关键的恶性行为之一。这一特性直接影响原发性肿瘤的远端转移，从而降低患者的长期生存率^1,2,3。选择性生长优势使癌细胞能够战胜正常细胞，而代谢重编程则通过改变能量代谢通路来支持这种快速增殖。同时，免疫调节使肿瘤能够逃避免疫系统的攻击。研究强调了这一问题的严重性，表明肺转移通常由增强的细胞迁移所致，是多种癌症患者死亡的终末事件⁴。例如，乳腺癌⁵、宫颈癌⁴和骨肉瘤⁶分别占此类病例的20%、9%和30%。因此，评估肿瘤细胞的迁移能力已成为当前肿瘤学研究的重要组成部分，进一步凸显了肿瘤进展的多面性。

细胞伤口愈合实验是一种易于使用的测量方法 体外 细胞迁移，常用于肿瘤学研究⁷大多数实验人员使用移液器吸头手动制造细胞伤口⁸尽管这种方法能够快速、便捷地形成细胞伤口，但在评估细胞迁移时仍存在诸多影响可重复性和准确性的局限性。首先，使用移液器枪头手动划痕时，操作者的操作角度、力度和速度会显著影响结果，从而降低该方法的重复性。⁸其次，移液枪头产生的细胞缺陷通常具有锯齿状边缘而非直线边缘，因为移液枪头是具有一定弹性的塑料制品⁹一些研究通过将预制的培养插件直接放入细胞培养板中，以限制细胞增殖范围，从而形成伤口¹⁰该方法克服了基于针尖技术的局限性，例如边缘不规则和可重复性差等问题。然而，即使使用生物相容性材料，嵌入物与细胞的长期共存仍然会影响细胞生长。¹¹此外，包埋还可能因接触受限而导致边缘区细胞发生表观遗传学改变¹²此外，由生物相容性材料制成的接触式插件价格昂贵且难以重复使用，限制了其应用可行性¹³因此，需要一种新型、可重复且实用的工具，以方便地进行定量分析 体外 细胞迁移

该方法的主要目标是引入一种用于定量分析的创新工具 体外 肿瘤学研究中的细胞迁移，旨在解决现有技术的局限性，并提高细胞迁移评估的可重复性和准确性。

该技术的开发原理在于评估肿瘤细胞迁移在肿瘤学中的关键重要性。肿瘤具有多种显著特征，包括选择性生长优势、代谢重编程以及免疫调节，这些因素共同促进了细胞迁移能力的增强，而细胞迁移是癌症恶性程度的基本特征之一。本方法旨在提供一种更为可靠的细胞迁移研究手段，从而加深对肿瘤行为的理解。

该方法相较于现有技术具有显著优势。手动划痕实验易受操作者主观因素干扰，而细胞培养插件可能影响细胞生长和基因表达。相比之下，该方法具有更高的重复性、准确性和实用性，为测量提供了一种经济高效的解决方案 体外 肿瘤学研究中的细胞迁移。该工具满足了研究多种癌症类型中细胞迁移现象对可靠且易于获取手段的迫切需求，因而成为该领域一项重要的补充。

方案

所有参与者均提供了完整的书面知情同意书。由于本研究未涉及动物或人体组织样本，因此无需伦理审批。

1. 调查用户群体的需求

1. 向从事细胞伤口愈合实验的生物学家/实验人员发放问卷，并收集填写完成的问卷用于本研究。在本研究中，从2021年10月12日至2022年2月3日，共向100名生物学家发放了100份问卷，回收率为97%。
2. 请受访者回答诸如“哪一次细胞划痕实验对您的困扰最大？”以及“进行细胞划痕时使用了哪种工具？”等问题，并通过后续子问题追溯其原因。
3. 调查实验人员对移液器吸头和细胞培养插入物等工具在细胞伤口愈合实验中的使用感受。通过问卷部分基于阶梯技术的手段-目的链理论^14,15，了解并收集他们选择某一工具而非其他工具的原因。
   ​注：阶梯法分为两种类型：一种是采用深度访谈的软性阶梯法，另一种是采用问卷或纸笔测验的硬性阶梯法¹⁶。本研究主要采用硬性阶梯法。手段-目的链理论认为，目标用户所持有的显性知识是表层且具体的，而隐性知识则是深层且抽象的^17,18,19。

2. 设计与三维建模

1. 根据先前问卷调查所获得的见解绘制草图，并启动设计流程。将此初步草图作为基础蓝图。
   1. 在建模软件中使用 Dim、DimRadius 和 DimDiameter 功能，详细说明各个组件的尺寸与布局。
   2. 使用精度为 0.02 mm 的游标卡尺对实际的 6 孔板进行测量，以确定细胞刮刀的最终尺寸。确认其长度为 42.1 mm，宽度为 42.1 mm，高度为 18.5 mm。在设计阶段需特别关注细节，尤其是产品高度及其与孔板的适配性，以促进更顺畅的组装。
2. 构建三维模型并进行渲染。
   1. 在软件中通过创建基本模型开始三维设计。点击 ExtrudeCrv 按钮进行拉伸，Loft 按钮进行造型。优化模型后，点击 FilletEdge 以获得平滑边缘。
      注：其他常用功能按钮包括：Lines — 用于绘制直线段，Polylines — 用于创建由多个线段组成的连续线，Rectangles — 用于绘制矩形，Circles — 用于绘制圆形，Arcs — 用于绘制弧形或椭圆形，Points — 用于放置单个点标记，Text — 用于添加文本标签，Dimensions — 用于为模型添加测量尺寸，Array — 用于创建对象的复制图案，Rotate — 用于将对象旋转至所需角度，Move — 用于将对象移动到新位置，Scale — 用于放大或缩小对象，Trim/Extend — 用于修剪或延伸对象以与其他几何体对齐，Boolean Union/Difference/Intersection — 用于合并、减去或求取对象的交集，Layers — 用于在不同图层上组织对象，Render — 用于生成带有材质和光照的渲染视图，以及 Export — 用于将模型几何体导出为其他文件格式。
   2. 将模型导入三维渲染软件。应用塑料、海绵和钢等材质，然后调整光照以实现逼真的渲染效果。
      注：通用功能按钮列表包括：Drag & Drop — 通过从材质库中拖动材质并将其放置在实时视图中的目标组件上来直接应用材质，Right-click — 右键点击材质库中的材质时，通常会看到以下选项：Apply to Selection — 将材质应用于实时视图中选定的部件，Edit Material — 调整材质属性，Material Properties（选择材质后）— 用于访问并修改材质的特定属性，如颜色、粗糙度、折射率及其他属性，搜索栏 — 通过输入材质名称或相关关键词快速查找材质，Categories/Folders — 用于浏览金属、塑料、玻璃等不同类别的材质或文件夹，Add to Favorites — 将某些材质标记为收藏，以便在后续会话中快速访问，Hotkeys — 某些操作可通过快捷键访问。例如，M 通常是快速调出所选部件材质属性的快捷键。
   3. 最后，在图像与设计软件中增强图像对比度（+56）和饱和度（鲜艳度 +19，饱和度 +7），并添加背景元素（文字信息及从白色到浅灰色渐变的背景），以提供上下文，确保呈现高质量且逼真的产品图像。
      1. 使用 图像 > 调整，亮度/对比度 来调整图像对比度。使用 图像 > 色相/饱和度 来修改图像的饱和度。使用 文字工具（T 图标） 向图像中添加文字信息。
         ​注：通用功能按钮列表包括 椭圆工具（U） — 用于绘制点或圆。将工具设置为绘制形状，选择所需的填充颜色，然后按住 Shift 键点击并拖动（以保持完美的圆形）来创建点。直线工具（U） — 用于在图像上绘制直线。选择该工具，设置所需的线宽，然后点击并拖动以绘制直线。画笔工具（B） — 绘制点和线的另一种方式。选择画笔的大小和形状，然后点击（绘制点）或点击并拖动（绘制线）。
3. 完成三维模型后，通过研磨与组装方法生产细胞刮刀^20,21,22。

3. 生产

1. 在本研究中应用色彩、材料、表面处理（CMF）理论来设计细胞刮刀的原型。CMF理论作为一种设计方法论，广泛应用于科学研究中，可提升产品的可用性、塑造用户感知，并指导材料的选择^23,24,25。
   1. 从标准色卡系统中选择用于细胞刮刀的颜色，包括黑6C、冷灰6C和11-0601TPG^26,27。
   2. 为制造符合实验室标准的细胞刮刀，需选用合适的材料，如聚丙烯（PP）、海绵和高碳钢。在制作实体原型时，首先使用3D打印机打印出结构框架，随后利用连接件或粘合剂完成刮刀的组装。
      ​注意：为制备细胞刮刀的实体产品，需对所需材料进行打磨与组装。整个过程中必须遵守安全操作规程，以确保最终产品安全且有效。
   3. 进入表面处理阶段，该过程可能包括切割、打磨、抛光、冲压或其他相关工艺。首先使用中等粒度的120目砂纸对模型进行打磨，以去除所有毛刺和粗糙边缘。
   4. 接着使用细粒度的220目砂纸进一步打磨，以获得光滑的表面。
   5. 打磨完成后，进一步修整表面，并确保插接式或内置连接件能够准确匹配。
   6. 使用连接件（固定杆）将滑片I和II牢固连接，以确保细胞刮刀结构的稳固性和耐久性。通过机械紧固与粘结相结合的方式实现细胞刮刀的最终固定形态。采用特定的紧固结构（如榫卯结构），利用机械力将各部件固定在一起；同时，为增强整体结构强度，还需涂抹粘合剂（胶水）以进一步粘合组件。
   7. 将刮刀在121.3 °C条件下高压灭菌30分钟，以确保其保持原有的形状和物理性能。

4. 细胞培养

1. 在添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的最低必需培养基中培养HOS细胞。在37 °C、5% CO₂条件下进行培养。
2. 每2天更换一次培养基。
3. 当细胞生长超过80%融合度时，加入1 mL含0.25% EDTA的胰蛋白酶，消化60秒。随后，将细胞在300 x g条件下离心5分钟进行传代。弃去上清液，加入培养基，使最终浓度为每孔5 x 10⁴个细胞。使用自动细胞计数仪进行细胞计数。

5. 评估细胞刮铲和基于尖端方法的细胞损伤潜力

1. 准备所有用于划痕实验的材料，并通过紫外线照射30分钟进行灭菌处理。
2. 灭菌后，在6孔板中对100%融合的HOS细胞进行划痕操作，每孔细胞浓度为5 × 10⁴个细胞，可采用细胞刮法或移液枪头法。
   1. 对于移液枪头法，使用100 µL枪头，在含细胞的培养基中水平方向划1次，垂直方向划1次。
   2. 对于细胞刮法，将刮板原型放入其中一个孔中，借助镊子轻轻按压一次，完成细胞划痕。每个划痕实验均需设置三个重复。
3. 使用数字显微镜系统和成像软件对所有细胞划痕进行分析。

6. 细胞活力与细胞增殖的测定

1. 按照CCK-8试剂盒提供的说明书进行所有细胞活力检测。
2. 在37 °C条件下，将细胞与CCK-8溶液共同孵育2小时，然后使用酶标仪在450 nm处测定其吸光度，以定量细胞活力。
3. 设计5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入实验，以准确量化DNA复制并直接测定细胞增殖比率。根据先前发表文献²⁸中所述的实验方案，利用EdU实验确定不同方法制造细胞划痕对细胞增殖的影响。
4. 对细胞进行染色，并使用数字显微镜系统成像。确保每项实验均设三个重复。

结果

解析用户对细胞损伤生成工具的需求
目前用于生成细胞损伤的实验方法仍需进一步改进，以解决诸多影响细胞损伤修复实验生物学可重复性、稳健性、经济性及用户体验的问题。我们采用硬性阶梯法（hard laddering method），通过问卷调查分析参与生物学实验的用户需求²⁹（图1A）。问卷中涉及的个人信息（如姓名）均经过匿名化处理，以保护受访者隐私。问卷的具体内容见表1。在为期6周、面向100人的调查中，共收到97份完整有效的问卷，3份可疑或无效问卷被排除，问卷回收率为97.00%。

结果表明，细胞划痕实验中最突出的问题是划痕边缘呈锯齿状（非直线）以及划痕宽度或面积不稳定，分别占55.67%和29.90%。这些问题的发生率显著高于细胞生长速率低、细胞污染及其他选项，后者的比例分别为3.09%、5.15%和6.19%（p < 0.001，图1B）。在创建划痕所用工具的选择方面，移液器枪头的使用远比细胞培养插入物普遍（图1C）。这主要归因于细胞培养插入物价格昂贵且不可重复使用（图1D），而移液器枪头成本低廉，并具有实验可重复性（6.59%）和较高的细胞存活率（20.88%，图1E）。重要的是，高达69.23%的用户认为细胞培养插入物的价格超出其预算（图1D）。相比之下，仅有6名用户选择了细胞培养插入物，其中仅16.67%认为其价格可以接受（图1F）。最后，在面对用于产生细胞划痕的创新工具时，86.60%的用户持乐观态度，仅有少数用户表示不愿意使用（4.12%，图1G）。

随后，对用户迫切需要的产品特性进行了剖析^30,31,32。这些特性包括直线型伤口、稳定的伤口宽度和面积、高重复性以及可接受的价格。据此，开展了后续的设计工作。

细胞刮设计要素及所用材料的选择依据
上述数据表明，常规生物学研究中使用的实验耗材必须严格无菌，以避免细胞污染³³。因此，所设计的细胞刮应具备无菌性。尽管一次性工具可通过环氧乙烷灭菌，但实验成本将不可避免地增加^34,35,36。因此，我们建议不采用一次性材料，而是选用可重复使用且能耐受高压蒸汽灭菌（121.3 °C）的材料来制造细胞刮，以降低成本，并在不同应用场景下提高使用的灵活性³⁷。为满足这些要求，制造细胞刮所用材料必须具备一定的物理和化学特性，包括耐热性、耐高压性以及抗水蒸气腐蚀性。

细胞刮刀在满足制作边缘整齐的划痕等基本功能的同时，还应具备吸引人的设计和颜色，以符合其预期用途。在造型方面，考虑到其目标应用领域，整体风格应与实验室环境相协调。外观不应过于张扬，以免妨碍实验人员观察实验进程。此外，其尺寸应适用于六孔板，表面应设有凸起结构，以便镊子能够稳定夹取。

设计中的CMF是影响产品外观美感和用户体验的关键设计要素。色彩选择影响情感反应，材料选择影响功能性和可持续性，表面处理则决定触感和视觉吸引力。CMF设计师综合协调这些要素，结合市场趋势与品牌特性，创造出能够引起用户共鸣的产品。

根据CMF理论，颜色、材料和表面处理工艺这三个关键因素被考虑用于确定它们对功能和视觉效果的影响²⁴。首先进行颜色选择。在此语境下，颜色指的是固有颜色，即物体或物质在标准光照条件下本身所呈现的颜色，不受外部光源或反射光的影响。由于六孔板由聚丙烯（PP）制成且表面透明，因此选择深灰色作为其固有颜色。这一选择有利于识别与操作，因为深灰色在叠加其他颜色时能提供最佳的对比度和可见性。此外，深灰色与其他颜色组合时不易引起色彩失真，这对观察同样至关重要。主要功能部件则进一步用黑色加以区分（图2A）。

由于商业配色系统在各个行业中被广泛接受和使用，因此被选为颜色选择的标准。该研究选用该系统，是因为该公司具备在不同介质上重现一致颜色的能力，这对于确保颜色呈现的准确性和一致性至关重要。

材料的选择基于上述问卷调查的结果。刮刀的外壳和部件由耐热塑料聚丙烯（PP）制成，以满足通过高压灭菌进行消毒的要求，如图2B所示。高碳钢适用于弹簧，因其在高温和低温以及耐腐蚀的实验室环境中均具有良好的稳定性。高密度海绵用于缓冲，并置于载玻片的末端。

最后，开发了表面处理工艺。由于细胞刮铲经常使用且容易被污染，而其表面质量又会影响灭菌效果，因此细胞刮铲宜具有光滑且有光泽的表面，这有助于使用者快速识别污染来源并及时处理，给人以洁净感。刮铲尖端经过局部打磨，以避免对培养皿底部造成损伤，从而防止影响培养环境并导致细胞增殖受限³⁸。

细胞刮设计与原型
基于上述结果，设计了三种细胞刮原型（图3A）。研究表明，细胞培养板中最常用的细胞划痕为十字形³⁹，而原型I采用矩形划痕，与此差异较大；因此原型I被弃用（图3A）。尽管原型II和III均能产生十字形无细胞区域，但原型II的滑轨难以在细胞培养皿中固定，且其结构较为复杂（图3A）。经过审慎讨论，最终选定原型III作为细胞刮的定型方案。

值得注意的是，由于尖端的形状会直接影响无细胞区域的边缘和尺寸，因此设计了三种草图供选择。草图 I 具有尖锐的顶端，可提供非常整齐的边缘；然而，如果尖端过于尖锐，可能会损伤允许细胞增殖的培养界面（图 3B）。草图 II 采用方形顶端，可能避免对细胞培养板造成损伤；但由于尖端与培养板底部的接触面为方形，使用时稳定性较差（图 3B）。草图 III 采用钝圆形尖端，有效避免了上述问题（图 3C），因此被选为最终设计方案。

该设计在三个方面进行了优化：固定器的固定方式、内置缓冲海绵以及夹持的便捷性。首先，预期的产品固定方式包括卡扣⁴⁰、榫卯⁴¹和铰接⁴²。考虑到实际生产成本和操作性，在十字形固定器下方设计了一个爪状结构，以方便夹紧孔板边缘。此外，在细胞划痕愈合实验中，我们观察到由于推片长度和硬度固定，在接近末端接触孔壁时，推片尖端会发生回弹，从而影响划痕状态。因此，我们在推片末端添加了缓冲海绵，以稳定尖端的运动（图 3A、C）。最后，在凸起部分增加了表面凹陷，以便于使用镊子夹持。

进一步使用三维设计软件构建了三维模型，其渲染图如图4A所示。爆炸图详细展示了细胞刮刀的内部结构，体现了前述必要特性（图4B）。此外，为实现刮头尖端和直边平滑滑动的目标，采用了内部机械传动结构。整个细胞刮刀的功能单元由控制部分组成。在实际操作中，细胞刮刀内部的连杆机构与顶部按钮相连，施加压力后末端向下移动，使末端卡扣动作触发；滑块内部的弹簧释放，推动刮头移动；最终刮头在带有窄缝的海绵处停止，完成刮取操作，再次使用时可切换复位（图5A）。同时，易于学习和操作便捷是生物学家评估产品质量的重要标准。因此，在产品外观设计上，表面布局遵循对称与整洁的原则^43,44，通过不同深浅的黑、白、灰色调区分并突出不同组件（图5A）。

在实际应用中，细胞刮刀法优于移液枪头刮擦法
采用研磨与组装方法制备了细胞刮刀的实体产品（图5B）。如预期所示，该细胞刮刀与六孔板高度匹配，其上部十字形固定架紧密贴合于孔板边缘，实现了牢固固定（图5C）。此外，刮刀头部与六孔板底部精确贴合，有利于顺利形成无细胞区域。最后，对细胞刮刀进行了高压灭菌处理，以检测其是否可重复使用。如图5D所示，该细胞刮刀即使在121.3 °C下高压灭菌30分钟后，仍保持原有的形状和物理性能。

在基准测试中，细胞刮除器在细胞划痕制备方面优于现有的细胞损伤创建方法。经过多次重复实验，细胞刮除器在制备划痕时表现出高度的稳定性和可重复性，各划痕区域波动较小，边缘接近直线，无细胞区域的标准差为483.73，边缘直线偏差为5041.33 ± 2420.00。相比之下，使用移液器枪头制备的划痕区域波动较大，无细胞区域的标准差为3905.80，边缘直线偏差为19562.33 ± 1068.39（图6A-C）。

最后，评估了细胞损伤后对细胞活力的影响（图6D）。结果显示，在细胞损伤完成12小时后，细胞刮刀组的细胞活力略高，且显著高于移液器枪头组。为进一步验证这些结果并明确不同细胞损伤制备方法对细胞增殖（即DNA复制）的影响，进行了EdU检测。EdU检测结果表明，损伤后12小时，细胞刮刀组的增殖细胞比例（24.41% ± 0.48）显著高于移液器枪头法组（18.79% ± 1.46）（图6E、F）。

这些数据充分证明，目前的细胞损伤发生器在稳定性和生物学可重复性方面优于现有的细胞损伤制备方法。该方法对细胞活力和增殖的影响较小。细胞损伤发生器所具备的这些显著优势，证实了其在提升现有细胞损伤检测方面的潜力，可确保所得数据的可靠性和可重复性。

图 1：用户需求分析。（A）桑基图展示了基于问卷调查实验人员的工作流程。（B）至（G）展示了问卷调查结果，包括问题1至问题6。请点击此处查看此图的放大版本。

图2：产品设计所用的颜色与材料。 （A）颜色选择。（B）生物学实验中使用的高压灭菌器。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：详细结构的产品设计。（A）细胞刮铲的三个原型候选方案。（B）三种吸头设计的草图。（C）选定的原型III的三视图，展示其整体设计以及物理和空间参数。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：三维模型渲染图及内部结构展示。 （A）三维模型渲染图。（B）爆炸图展示所提出的细胞刮刀内部结构。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：细胞刮的工作原理。（A）示意图展示细胞刮的工作方式。（B）细胞刮的实物图。（C）细胞刮可适配于6孔板中。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：细胞刮刀的实验验证。（A）不同方法产生的细胞划痕及其分组比较结果分别显示在（B）和（C）中，比例尺为100 µm。（D）细胞活力检测结果。（E）和（F）EdU实验结果，比例尺为50 µm。统计分析采用t检验进行组间比较，并通过Holm-Bonferroni法对原始p值进行校正，以避免假阳性结果。请点击此处查看该图的放大版本。

I) 在细胞划痕实验中，以下哪一项对您来说是最令人困扰的问题？

A) 划痕边缘不整齐

B) 划痕宽度不稳定

C) 细胞增殖缓慢

D) 细胞污染

E) 其他

II) 您使用哪些工具来制造细胞伤口？

A) 移液器吸头（请转至问题 III）

B) 细胞培养插入物（请转至问题 IV-V）

III) 您为什么不选择细胞培养插入物？

A) 细胞活力

B) 不可重复使用

C) 成本

D) 其他

IV) 您为何选择细胞培养插入物？

A) 成本

B) 可重复性

C) 其他

V) 您认为细胞培养插入物最严重的问题是什么？

A) 细胞状态

B) 不可重复使用

C) 价格昂贵

D) 其他

E) 满意

VI) 如果有一种价格低廉、可重复使用（可高压灭菌）、高度可重复的划痕工具，您购买并使用它的意愿如何？

A) 非常愿意

B) 愿意

C) 不确定

D) 不愿意

表1：本研究中使用的问卷包含六个问题，旨在了解生物学家在进行细胞伤口愈合实验时所遇到的情况。

讨论

本研究旨在开发一种用于细胞划痕愈合实验的自动机械化工具。据我们所知，这是首次尝试通过机械化驱动结构实现一键式自动创建细胞划痕。该工具旨在解决传统移液枪头法存在的可重复性低、划痕状态不稳定等缺点。得益于积极的实验结果以及用户群体的鼓励性反馈，该细胞刮刀有望为实验人员提供一种高效且稳定的细胞划痕制备替代方案，从而显著提高实验分析结果的可信度。

使用当前的细胞刮刀时，用户应执行以下步骤：1）按照与传统方法（如移液枪头法）类似的方式，将细胞以特定密度接种到六孔板中，准备形成无细胞间隙；2）等待细胞汇合率达到> 90%；3）将无菌细胞刮刀放入孔板的一个孔中，按下如图5所示的按钮，无细胞间隙将在1-2秒内自动形成。

细胞划痕愈合实验已广泛用于测量细胞迁移能力。通常，实验人员使用移液器枪头制造细胞划痕。例如，Tariq 等人使用移液器枪头制造细胞划痕以评估细胞迁移能力⁴⁵；Rahimi 等人也在实验中使用移液器枪头观察 PC3 细胞的迁移能力⁴⁶；在小鼠间充质细胞迁移实验中，Cormier 等人同样使用了移液器⁴⁷；Pinto 等人在证明砷对皮肤细胞迁移影响的研究中，使用移液器枪头进行垂直刮擦⁴⁸，等等。

然而，如前所述，使用移液头制造细胞伤口存在若干问题，例如无细胞区域大小不一、边缘不规则，以及对操作者施加的力度和划痕角度的依赖性，导致重复性较低⁴⁹。本研究的问卷调查结果也证实，基于移液头的方法在价格、细胞存活率和工具可重复使用性方面相较于细胞培养插件具有更明显的优势。相比之下，细胞培养插件成本过高且难以重复使用，而两种工具均存在缺陷。因此，用户群体总体持乐观态度，愿意尝试创新性工具。本研究设计并开发了一种新型的无细胞区域制备工具，以促进并稳定细胞伤口的创建。

本研究最重要的贡献在于细胞刮刀的开发及其实验验证。与以往研究相比，本细胞刮刀的改进主要体现在以下三个方面。1）细胞划痕的制备更加稳定且操作便捷。本研究表明，与传统的移液枪头法相比，本细胞刮刀制造的细胞划痕边缘平直，在重复实验中可产生相似的划痕，显著提高了细胞划痕愈合实验的可重复性与可靠性。2）本细胞刮刀对细胞状态的影响更小。其对细胞活力和增殖（DNA扩增）无明显影响，显著优于基于枪头的方法。因此，该细胞刮刀有望在常规实验中进一步降低外界因素对细胞划痕愈合检测的干扰。3）本细胞刮刀较好地满足了用户群体的实际需求。此前问卷调查结果显示，用户对新型细胞划痕工具的主要需求包括划痕宽度均一、可重复性高、操作简便以及价格适中，这些要求已在本细胞刮刀中得以实现。此外，该细胞刮刀采用中性色调设计，以传达产品简洁、实用的设计理念；同时，强烈的黑白对比有效突出了其功能区域。整体造型由曲面圆润衔接形成十字交叉形状，既参考了传统划痕的形态，也暗示了产品的功能用途。通过简化操作流程并设计手动复位功能，进一步降低了操作难度。综上所述，研究结果表明该细胞刮刀是一种有前景的替代工具，可帮助实验人员以一键式、自动化且稳健的方式制备细胞划痕，从而提升科研结果的可重复性。

本研究存在局限性，需予以说明。问卷调查的样本量有限，限制了本研究结果的普适性；因此，我们将在后续研究中进一步扩大样本量，以改进细胞刮刀。其次，还需将细胞刮刀纳入一项针对更多使用者的周密研究中，以便更全面地评估该细胞刮刀的性能。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CCK-8试剂盒	Beyotime Company, 中国	C0037
数字显微镜系统	Olympus	IX81
胎牛血清	Gibco, 美国	16000044
HOS	Procell Life Science & Technology Co., Ltd	CL-0360
Image-Pro Plus	Media Cybernetics	版本 6.0
KeyShot	Luxion	版本 11.0	3D渲染软件
酶标仪	BioTek, 德国	ELX808
最低必需培养基	Gibco, 美国	11095080
Pantone配色系统	Pantone		商业配色系统
青霉素-链霉素	Beyotime Company, 中国	ST488
Photoshop	Adobe		图像处理与设计软件
Rhinoceros 3D	Robert McNeel & Associates	版本 7.0	3D设计软件
TC20全自动细胞计数仪	Bio-Rad	TC20
胰蛋白酶	Cytiva HyClone, 美国	SH30042.01