在本研究中，一种新型 在植株中 由基因表达和基因编辑方法介导的 农杆菌 在竹子中开发了该方法。该方法显著提高了竹子基因功能验证的效率，对加速竹子育种进程具有重要意义。
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摘要
摘要
一种新型的 在植株内 一种避免了耗时且劳动密集型的愈伤组织诱导与再生过程的竹子基因转化方法已被开发，该方法包括 农杆菌介导的基因表达 通过 竹苗的创伤与真空处理。该方法成功展示了外源基因（如 RUBY 报告基因和 Cas9 基因，在竹叶中。甜菜红素在竹叶中积累的最高转化效率 RUBY 使用GV3101菌株对幼苗进行转化，感染后转化率达到85.2%。尽管外源DNA未整合到竹子基因组中，该方法在表达外源基因方面仍具有较高效率。此外，利用该方法还成功构建了基于内源报告基因的基因编辑系统，由此获得了一个 原位 由编辑后的竹子紫黄质脱环氧化酶基因产生的突变体（PeVDE竹叶中，突变率为17.33%。该突变的 PeVDE 在强光下导致非光化学淬灭（NPQ）值降低，该变化可通过荧光仪准确检测。这使得编辑后的 PeVDE 一种可用于竹子中外源和内源基因的潜在天然报告基因。使用该报告基因的 PeVDE，肉桂酰辅酶A还原酶基因成功被编辑，突变率达到8.3%。该操作避免了组织培养或愈伤组织诱导过程，在竹子中外源基因表达和内源基因编辑方面具有快速高效的优势。该方法可提高基因功能验证的效率，有助于揭示竹子关键代谢途径的分子机制。
引言
竹子基因功能的研究对于深入理解竹子生物学特性以及挖掘其遗传改良潜力具有重要意义。实现这一目标的有效途径是通过以下过程 农杆菌介导的感染将含有外源基因的T-DNA片段导入竹叶细胞，进而导致这些基因在叶片细胞中表达。
竹子是一种宝贵的可再生资源，在制造、艺术和科研领域具有广泛的应用。竹子具有优异的木材特性，如高强度、高韧性、适中的刚度和柔韧性1，目前已被广泛用于各类家用和工业用品，包括牙刷、吸管、纽扣、一次性餐具、地下管道以及用于火力发电的冷却塔填料。因此，竹子育种在获取具有优良木材特性的竹子品种方面发挥着关键作用，不仅可用于替代塑料、减少塑料使用、保护环境和应对气候变化，还能产生显著的经济价值。
然而，传统的竹子育种由于营养生长期较长且开花期不确定，面临诸多挑战。尽管分子育种技术已开发并应用于竹子育种，但竹子基因转化过程因愈伤组织诱导和再生步骤而耗时、费力且操作复杂2,3,4,5稳定的遗传转化通常需要 农杆菌介导的方法，涉及愈伤组织诱导和再生等组织培养过程。然而，竹子的愈伤组织再生能力较弱，极大地限制了稳定遗传转化在竹子中的应用。此后 农杆菌 侵染植物细胞后，T-DNA片段进入植物细胞，其中大部分T-DNA片段在细胞内保持未整合状态，从而实现瞬时表达。仅有少量T-DNA片段随机整合到染色体中，导致稳定表达。瞬时表达水平呈现积累曲线，不同基因的表达量可能有所不同。 农杆菌-递送的T-DNA。大多数情况下，表达水平在侵染后3-4天达到最高，随后在5-6天后迅速下降6,7先前的研究表明，在未施加抗性选择压力的情况下获得的基因编辑植物中，超过1/3的突变来源于CRISPR/Cas9的瞬时表达，而其余不足2/3的突变则来源于DNA整合到基因组后的稳定表达。8这表明T-DNA整合到植物基因组中对于基因编辑并非必需。此外，对抗性施加的选择压力会显著抑制非转基因细胞的生长，直接影响感染外植体的再生过程。因此，通过在竹子中采用无需抗性选择压力的瞬时表达，可实现外源基因的非整合表达，并直接在植物器官中研究基因功能。由此，有望建立一种简便且省时的竹子外源基因表达与编辑方法。9.
所开发的外源基因表达与基因编辑方法具有操作简便、成本低廉的特点，且无需昂贵的设备或复杂的操作流程9。在该方法中，以竹子内源的紫黄质脱环氧化酶基因（PeVDE）作为无筛选压力条件下的外源基因表达报告基因。这是因为竹叶中经编辑的PeVDE会降低高光强下的光保护能力，并表现出非光化学淬灭（NPQ）值的下降，该变化可通过叶绿素荧光成像进行检测。为验证该方法的有效性，研究中利用该系统对另一个竹子内源基因——肉桂酰辅酶A还原酶基因（PeCCR5）9进行了敲除，并成功获得了该基因的突变体。该技术可用于研究在竹叶中发挥功能的基因。通过在竹叶中瞬时过表达这些基因，可提高其表达水平；或通过基因编辑实现基因表达的下调，从而研究下游基因的表达水平、叶片表型及产物含量。这为竹子基因功能研究提供了更高效且可行的技术路径。该技术适用于在竹叶中行使功能的基因的功能鉴定。通过在竹叶中瞬时过表达这些基因，可增强其表达水平；或通过基因编辑实现其表达的敲低，进而研究下游基因表达水平、叶片表型和产物含量。此外，值得注意的是，由于竹子基因组经历了广泛的多倍化过程，大多数具有重要经济价值的基因均以多个拷贝形式存在，导致遗传冗余。这为在竹子中开展多重基因组编辑带来了挑战。在应用稳定的遗传转化或基因编辑技术之前，快速验证基因功能至关重要。针对基因多拷贝的问题，一种策略是分析转录组表达谱，以鉴定在特定发育阶段活跃表达的基因。此外，通过靶向这些基因拷贝中的保守功能结构域，可设计共有的靶序列，或将多个靶位点整合至同一CRISPR/Cas9载体中，从而实现对多个基因的同步敲除。这为竹子基因功能研究提供了更加高效和可行的途径。
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方案
1. 竹苗的准备
- 使用采自中国广西桂林的毛竹（Phyllostachys edulis）种子培育幼苗。首先将种子在水中浸泡2-3天，期间需每日换水。接着按3:1的比例混合土壤与蛭石，制成栽培基质。
- 将浸泡后的种子播种于基质中以促使其萌发。在实验室条件下培养幼苗，保持温度在18-25 °C之间，并设置16小时光照/8小时黑暗的光周期，光照期间光强维持在250-350 µmol/m2/s。
- 保持相对湿度约60%。用于农杆菌侵染的幼苗应为15日龄、株高2-10 cm，此阶段最适于转化。
注意：由于竹子开花不可预测，种子并非每年均可获得。种子通常在干燥环境中于4 °C保存2-3年，仍可保持超过20%的发芽率。
2. 质粒的制备与 农杆菌
- 质粒：为验证瞬时表达效果，使用含有由CaMV 35S启动子驱动的可见报告基因的pHDE-35S::RUBY构建体10。进行基因编辑时，使用携带由玉米Ubi启动子驱动的Cas9基因的pCambia1300-Ubi::Cas9构建体11。将PeVDE及其他目标基因的sgRNA引导序列插入pCambia1300-Ubi::Cas9构建体的两个AarI位点之间9。
- 将CRISPR/Cas9引导RNA序列插入pCambia1300-Ubi::Cas9构建体的两个AarI限制性内切酶位点之间，包括PeVDE和PeCCR5目标基因。
- 在20个核苷酸序列的5'端添加GGCA，并合成一条单链DNA序列；将该20个核苷酸序列反向互补后在5'端添加AAAC，再合成另一条单链DNA序列。
- 将两条单链DNA序列用稀释水稀释至浓度为10 nM/L，充分混匀后于95 °C加热5分钟。让混合物冷却至室温，形成双链接头。
- 利用T4 DNA连接酶将接头与经AarI内切酶消化的线性pCambia1300-Ubi::Cas9片段连接，并对构建的CRISPR/Cas9载体进行测序，以获得所需的目的基因靶向构建体。
- 采用冻融法将质粒转化至Agrobacterium中：取1 µL质粒（浓度：10 - 1,000 ng/µL）与100 µL感受态Agrobacterium细胞（转化效率：> 1 x 104 菌落形成单位/µg）混合，轻轻混匀。将混合物置于冰上5分钟，随后转移至液氮中5分钟。
- 在37 °C水浴中解冻5分钟。向混合物中加入500 µL LB（Luria-Bertani）培养基，在28 °C、200 rpm条件下于摇床中培养2–3小时。对于pHDE-35S::RUBY质粒，分别将其导入农杆菌Agrobacterium tumefaciens（A. tumefaciens）的AGL1、GV3101、LBA4044和EHA105菌株中12。对于CRISPR/Cas9质粒，则将其导入A. tumefaciens的GV3101菌株中。
- 在YEP（酵母提取蛋白胨）培养基（每升含10 g牛肉膏、10 g酵母提取物和5 g NaCl）中，加入相应抗生素（35S::RUBY使用壮观霉素，CRISPR/Cas9使用卡那霉素），于28 °C培养Agrobacterium。培养36–48小时后可观察到单菌落。
- 挑取菌落并转移至含相应抗生素的液体YEP培养基中继续培养。培养24–36小时后，使用RUBY-F和RUBY-R引物（表1）进行PCR，确认质粒已成功转入Agrobacterium。
- 将1 mL成功转化的Agrobacterium接种至100 mL新鲜液体YEP培养基（含相应抗生素）中，于28 °C过夜培养至OD600为0.8。
- 在4 °C条件下以4,000 x g离心5分钟收集菌体，用渗透缓冲液（10 mM MgCl2和10 mM MES-KOH [pH 5.6]）洗涤菌体沉淀一次，再次离心。将菌体沉淀重悬于渗透缓冲液中，调节OD600至0.6，用于竹子转化。
3. 农杆菌 介导的 在植株内 转化系统
- 准备转化；小心地将带土的幼苗从基质中取出，确保根部保持完整。用锡箔纸包裹幼苗以保持水分并防止土壤脱落图1A).
- 将包裹好的幼苗转移至高湿度环境（相对空气湿度 >90%）和较低光照（强度低于50 µmol/m2/秒）持续2小时。
- 使用注射器的锋利针头，对竹苗卷曲的未成熟叶片上部（距顶端约1-2 cm处）进行一次或两次穿刺处理（如红色三角所示） 图1A).
- 随后，将幼苗受伤的上部浸入农杆菌悬浮液中 农杆菌从创伤处理到浸入 农杆菌 迅速操作，因为新鲜的伤口可提高接种效率。
- 立即将幼苗转移至真空室，在25–27 mmHg压力下处理2分钟（图1B).
- 抽真空后，小心地解开幼苗并将其重新种植到基质中。将幼苗置于弱光或黑暗条件下<50 µmol/m2/s）且高湿度（RH>90%）在室温（18–25 ℃）下 °C）培养2天。随后将幼苗置于正常生长条件下培养，每5-7天浇水一次。观察其表型，为后续实验提供材料。
4. 设计用于基因编辑的单导向RNA（sgRNA）
- 在目标基因序列的特定且保守结构域附近确定一个原间隔序列邻近基序（PAM）位点。确保在此CRISPR/Cas9系统中，特定的PAM序列为NGG。通过在竹子基因组数据库中进行BlastN比对，验证所选序列的靶向特异性。确保sgRNA序列具有唯一性，特别是在其上游区域及靠近PAM的区域9,11。
注：该比对可有效减少基因编辑过程对基因组中潜在脱靶位点的影响。 - 在PeVDE基因的第一外显子上设计两条sgRNA（sgRNA-1和sgRNA-2）13。在sgRNA-1的PAM上游包含AgeI限制性酶切位点，在sgRNA-2的PAM上游包含XbaI限制性酶切位点。在编码KNWYCYGK保守基序的PeCCR5基因第四外显子上设计一条sgRNA。该基序对CCR酶的催化功能至关重要14。
- 在PAM位点旁设计一段20个核苷酸的间隔序列。该间隔序列将引导Cas9酶至目标位点，实现DNA切割及后续的基因编辑。
注：建议选择位于PAM位点内切酶切割位点上游的靶区域，以利于基因编辑效率的验证。
5. 引物设计与PCR
- 手动设计特异性引物以扩增 PeVDE 和 PeCCR5 片段。上游和下游引物应设计在靶位点外至少 100 bp 处，长度差异应超过 100 bp，以便在电泳时实现条带的清晰分离。针对 RUBY 基因的前 500 bp 区域设计扩增引物。表 1 中列出了所用全部引物的序列。
- 使用高保真 DNA 聚合酶进行 PCR。本实验采用具有高保真性和高效扩增能力的 DNA 聚合酶用于基因克隆。
- 按如下组分配制 PCR 反应体系：5x 缓冲液（含 Mg2+）：4 µL；dNTP 混合物（各 2.5 mM）：1.6 µL；正向和反向引物（各 10 pmol）：各 1 µL；竹子基因组 DNA（约 50 ng）；DNA 聚合酶（2.5 U/µL）：0.2 µL；加水至总体积为 20 µL。
- PCR 运行条件如下：98 °C 预变性 5 min；98 °C 变性 10 s；56 °C 退火 5 s；72 °C 延伸 30 s；变性至延伸步骤循环 32 次；72 °C 最终延伸 5 min；4 °C 保存。
注意：PCR 条件仅为示例，可能需要根据具体应用或靶标进行优化。
6. DNA 提取、内切酶消化及测序
- 使用剪刀从新鲜的竹叶叶片中分离出由成像-PAM 荧光仪（参见步骤 7.4）鉴定出的 NPQ 值较低的区域。用液氮速冻叶片样品，并将冷冻的叶片样品转移至研钵中。用研杵将样品研磨成细粉，在研磨过程中加入足量液氮。此步骤有助于释放细胞内容物，包括 DNA。
- 采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法从粉末状叶片中提取基因组 DNA。将 50 mg 叶片粉末样品加入 800 µL 的 2% CTAB 溶液中。充分混匀样品，并在 65 °C 下孵育 30 分钟，每 5 分钟轻轻振荡一次。
- 加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1, v/v），剧烈振荡混合物。在 8,000 g 下离心 8 分钟后，将上清液转移至新管中。
- 加入等体积的氯仿/异戊醇，重复步骤 6.3。加入等体积的预冷异丙醇，反复倒置管子数次，然后置于 -20 °C 下 30 分钟。在 8,000 x g 下离心 5 分钟后，弃去上清液。
- 用 75% 乙醇在 4 °C 下洗涤 DNA 沉淀两次，然后溶解于 50 µL 水中。
- 按照步骤 5.4 中的方案，对野生型和Agrobacterium感染的竹叶中包含目标基因靶位点的基因组 DNA 进行扩增。
- 对 PCR 产物进行内切酶消化。选择能够识别扩增 DNA 片段内特定位点的特异性酶。使用 AgeI 和 XbaI 内切酶进行消化。
- 配制反应体系：加入 AgeI 或 XbaI（20 单位/µL）1 µL、1 µg PCR 产物、10x 缓冲液 5 µL，并加水至总体积为 50 µL。在 37 °C 下孵育 1 小时。
- 通过凝胶电泳分析被消化 DNA 片段的比例。比较野生型与Agrobacterium感染样品的消化片段，以评估基因编辑效率。
- 在扩增 PeVDE 和 PeCCR5 片段时，分别在正向和反向引物的 5' 端添加转座酶接头序列 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG 和 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG9,15。采用步骤 5.4 中所述方案进行扩增。将 PCR 产物（消化前）制备用于深度测序。
7. 叶片中非光化学淬灭（NPQ）值的叶绿素荧光测定
- 测量前，将竹子幼苗暴露于1200 µmol/m2/s的高光强条件下2小时。此处理可增加叶片吸收的光量子数量，并激活叶片中的光保护系统。
- 使用成像-PAM叶绿素荧光仪测量竹叶的体内 PS II叶绿素荧光。设定作用光强度为800 µmol/m2/s，进行6分钟的荧光测量。在此期间，每30秒施加一次饱和脉冲，以获得叶绿素荧光曲线。曲线的稳定值将用于计算13。
- 使用以下公式计算非光化学淬灭（NPQ）：
NPQ = (Fm - Fm') / Fm'
其中Fm表示暗适应状态下的最大荧光，Fm'表示任意光适应状态下的最大荧光。 - 通过成像软件的可视化界面监测NPQ值。该软件支持对荧光数据（包括NPQ值）进行实时分析和显示。
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结果
农杆菌介导的 在植株中 竹叶中的基因表达
的 RUBY 报告基因已被证明在可视化瞬时基因表达方面具有显著效果，因其能够利用酪氨酸合成鲜明的红色甜菜素10在本研究中， 农杆菌介导的转化被用于瞬时表达外源基因 RUBY 竹叶中的基因（图1）。在第3rd 感染后数天，未成熟的卷曲叶片出现红色着色，且在第5天时颜色变得更加鲜艳th 叶片展开后每天一次（蓝色三角形， 图1C。这些结果表明 农杆菌 成功介导了外源基因的表达 RUBY 竹叶中的基因及甜菜红素的合成发生。
此外，四种菌株 农杆菌 （AGL1、LBA4404、EHA105 和 GV3101）进行比较后发现，GV3101 菌株在侵染竹叶后引起的...
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讨论
与传统遗传转化方法相比，该方法显著缩短了所需时间（传统方法通常需要1-2年），可在5天内实现外源基因的瞬时表达以及内源基因的基因编辑。然而，该方法存在局限性，仅能转化少量细胞，且经基因编辑的叶片为嵌合体，无法再生为完整植株。尽管如此，这种活体（in planta）基因表达与基因编辑技术为竹子内源基因的功能验证提供了一种强有力的手段。
目前， 在植株中 基因表达与基因编辑技术只能在未成熟（卷曲）叶片中进行，而无法在成熟叶片中实现。随着叶片展开并增大，经历分裂的基因编辑细胞数量增加，从而使得特定叶区域能够实现基因编辑。然而， 农杆菌介导的转化方法不会导致外源T-DNA插入竹子染色体，因此难以在竹子中使用稳定的标记基因6,9因此，确定这些区域的精确位置具有挑战性。为解决这一问题， PeVDE 基因被编辑后，编辑区域在高光处理下表现出光保护能力下降，这通过较低的非光化学淬灭（NPQ）值得以体现，且可利用...
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
作者感谢国家重点研发计划（项目编号：2021YFD2200502）、国家自然科学基金（项目编号：31971736）提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 35S::RUBY | Addgene，美国 | 160908 | 质粒构建体 |
| Agrobacterium GV3101、EHA105、LBA4404 和 AGL1 感受态细胞 | Biomed，中国 | BC304-01、BC303-01、BC301-01 和 BC302-01 | 用于农杆菌侵染 |
| CTAB | Sigma-Aldrich，美国 | 57-09-0 | DNA 提取 |
| 成像-PAM 荧光仪 | Walz，德国埃菲尔特里希 | 检测竹叶叶绿素荧光 | |
| ImagingWin | Walz，德国埃菲尔特里希 | 成像-PAM 荧光仪配套软件 | |
| Paq CI 或 Aar I | NEB，美国 | R0745S | 将目标序列插入 CRISPR/Cas9 载体 |
| PrimeSTAR Max DNA 聚合酶 | Takara，日本 | R045Q | 用于基因克隆 |
| T4 DNA 连接酶 | NEB，美国 | M0202V | 将目标序列插入 CRISPR/Cas9 载体 |
参考文献
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