在植株中毛竹叶片的基因表达与基因编辑

摘要

在本研究中，一种新型 在植株中 由基因表达和基因编辑方法介导的 农杆菌 在竹子中开发了该方法。该方法显著提高了竹子基因功能验证的效率，对加速竹子育种进程具有重要意义。

摘要

一种新型的 在植株内 一种避免了耗时且劳动密集型的愈伤组织诱导与再生过程的竹子基因转化方法已被开发，该方法包括 农杆菌介导的基因表达 通过 竹苗的创伤与真空处理。该方法成功展示了外源基因（如 RUBY 报告基因和 Cas9 基因，在竹叶中。甜菜红素在竹叶中积累的最高转化效率 RUBY 使用GV3101菌株对幼苗进行转化，感染后转化率达到85.2%。尽管外源DNA未整合到竹子基因组中，该方法在表达外源基因方面仍具有较高效率。此外，利用该方法还成功构建了基于内源报告基因的基因编辑系统，由此获得了一个 原位 由编辑后的竹子紫黄质脱环氧化酶基因产生的突变体（PeVDE竹叶中，突变率为17.33%。该突变的 PeVDE 在强光下导致非光化学淬灭（NPQ）值降低，该变化可通过荧光仪准确检测。这使得编辑后的 PeVDE 一种可用于竹子中外源和内源基因的潜在天然报告基因。使用该报告基因的 PeVDE，肉桂酰辅酶A还原酶基因成功被编辑，突变率达到8.3%。该操作避免了组织培养或愈伤组织诱导过程，在竹子中外源基因表达和内源基因编辑方面具有快速高效的优势。该方法可提高基因功能验证的效率，有助于揭示竹子关键代谢途径的分子机制。

引言

竹子基因功能的研究对于深入理解竹子生物学特性以及挖掘其遗传改良潜力具有重要意义。实现这一目标的有效途径是通过以下过程 农杆菌介导的感染将含有外源基因的T-DNA片段导入竹叶细胞，进而导致这些基因在叶片细胞中表达。

竹子是一种宝贵的可再生资源，在制造、艺术和科研领域具有广泛的应用。竹子具有优异的木材特性，如高强度、高韧性、适中的刚度和柔韧性¹，目前已被广泛用于各类家用和工业用品，包括牙刷、吸管、纽扣、一次性餐具、地下管道以及用于火力发电的冷却塔填料。因此，竹子育种在获取具有优良木材特性的竹子品种方面发挥着关键作用，不仅可用于替代塑料、减少塑料使用、保护环境和应对气候变化，还能产生显著的经济价值。

然而，传统的竹子育种由于营养生长期较长且开花期不确定，面临诸多挑战。尽管分子育种技术已开发并应用于竹子育种，但竹子基因转化过程因愈伤组织诱导和再生步骤而耗时、费力且操作复杂^2,3,4,5稳定的遗传转化通常需要 农杆菌介导的方法，涉及愈伤组织诱导和再生等组织培养过程。然而，竹子的愈伤组织再生能力较....

方案

1. 竹苗的准备

1. 使用采自中国广西桂林的毛竹（Phyllostachys edulis）种子培育幼苗。首先将种子在水中浸泡2-3天，期间需每日换水。接着按3:1的比例混合土壤与蛭石，制成栽培基质。
2. 将浸泡后的种子播种于基质中以促使其萌发。在实验室条件下培养幼苗，保持温度在18-25 °C之间，并设置16小时光照/8小时黑暗的光周期，光照期间光强维持在250-350 µmol/m²/s。
3. 保持相对湿度约60%。用于农杆菌侵染的幼苗应为15日龄、株高2-10 cm，此阶段最适于转化。
   注意：由于竹子开花不可预测，种子并非每年均可获得。种子通常在干燥环境中于4 °C保存2-3年，仍可保持超过20%的发芽率。

2. 质粒的制备与  农杆菌

1. 质粒：为验证瞬时表达效果，使用含有由CaMV 35S启动子驱动的可见报告基因的pHDE-35S::RUBY构建体¹⁰。进行基因编辑时，使用携带由玉米Ubi启动子驱动的Cas9基因的pCambia1300-Ubi::Cas9

结果

农杆菌介导的 在植株中 竹叶中的基因表达
的 RUBY 报告基因已被证明在可视化瞬时基因表达方面具有显著效果，因其能够利用酪氨酸合成鲜明的红色甜菜素¹⁰在本研究中， 农杆菌介导的转化被用于瞬时表达外源基因 RUBY 竹叶中的基因（图1）。在第3^rd 感染后数天，未成熟的卷曲叶片出现红色着色，且在第5天时颜色变得更加鲜艳^th 叶片展开后每天一次（蓝色三角形， 图1C。这些结果表明 农杆菌 成功介导了外源基因的表达 RUBY 竹叶中的基因及甜菜红素的合成发生。

此外，四种菌株 农杆菌 （AGL1、LBA4404、EHA105 和 GV3101）进行比较后发现，GV3101 菌株在侵染竹叶后引起的.......

讨论

与传统遗传转化方法相比，该方法显著缩短了所需时间（传统方法通常需要1-2年），可在5天内实现外源基因的瞬时表达以及内源基因的基因编辑。然而，该方法存在局限性，仅能转化少量细胞，且经基因编辑的叶片为嵌合体，无法再生为完整植株。尽管如此，这种活体（in planta）基因表达与基因编辑技术为竹子内源基因的功能验证提供了一种强有力的手段。

目前， 在植株中 基因表达与基因编辑技术只能在未成熟（卷曲）叶片中进行，而无法在成熟叶片中实现。随着叶片展开并增大，经历分裂的基因编辑细胞数量增加，从而使得特定叶区域能够实现基因编辑。然而， 农杆菌介导的转化方法不会导致外源T-DNA插入竹子染色体，因此难以在竹子中使用稳定的标记基因^6,9因此，确定这些区域的精确位置具有挑战性。为解决这一问题， PeVDE 基因被编辑后，编辑区域在高光处理下表现出光保护能力下降，这通过较低的非光化学淬灭（NPQ）值得以体现，且可利用.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35S::RUBY	Addgene，美国	160908	质粒构建体
Agrobacterium GV3101、EHA105、LBA4404 和 AGL1 感受态细胞	Biomed，中国	BC304-01、BC303-01、BC301-01 和 BC302-01	用于农杆菌侵染
CTAB	Sigma-Aldrich，美国	57-09-0	DNA 提取
成像-PAM 荧光仪	Walz，德国埃菲尔特里希		检测竹叶叶绿素荧光
ImagingWin	Walz，德国埃菲尔特里希		成像-PAM 荧光仪配套软件
Paq CI 或 Aar I	NEB，美国	R0745S	将目标序列插入 CRISPR/Cas9 载体
PrimeSTAR Max DNA 聚合酶	Takara，日本	R045Q	用于基因克隆
T4 DNA 连接酶	NEB，美国	M0202V	将目标序列插入 CRISPR/Cas9 载体