用于疼痛研究的早产大鼠模型

摘要

在这里，我们提出了一个创建早产大鼠模型的简明方案，促进了早期产后疼痛管理的研究。该方法包括在预产期前 3 天进行剖宫产，通过子宫切除术提取早产大鼠幼崽，并将它们与代孕母鼠的生物后代整合。

摘要

本研究深入探讨了持续针刺刺激对早产后代的影响，以确定其对疼痛敏感性的长期影响。该方案的主要目的是使用早产大鼠模型研究新生儿针刺刺激对生命后期疼痛阈值的影响。通过建立这个模型，我们旨在推进理解和管理与早产相关的早期产后疼痛的研究。这项研究的结果表明，虽然机械刺激的基线阈值不受影响，但在成年大鼠完全注射弗氏佐剂 （CFA） 后，机械超敏反应显着增加。有趣的是，与雄性大鼠相比，雌性大鼠表现出更高的炎症超敏反应。值得注意的是，母体行为、窝产仔体重和后代的生长轨迹在刺激下保持不变。新生儿疼痛刺激后成年期伤害性反应改变的表现可能表明感觉处理和糖皮质激素受体功能的变化。然而，需要进一步的研究来了解所涉及的潜在机制，并针对成人早产和新生儿疼痛的后果制定干预措施。

引言

在新生儿期，伤害感受途径经历了显着的结构和功能成熟，组织损伤和相关疼痛的存在对体感加工的发展具有深远的影响¹。

利用动物模型可以对非人类动物进行受控的实验操作，从而能够更深入地理解新生儿疼痛对以后生活行为的影响，同时减轻潜在的混杂变量 ^2,3。一个常见的结果是新生儿疼痛对成年期疼痛敏感性增加的影响 ^2,4,5。在新生儿重症监护病房 （NICU） 中，新生儿疼痛是一个非常普遍的压力来源，早产儿通常每天接受 10 次侵入性手术的中位数⁶。NICU 中的早产儿会遇到一系列压力源，包括疼痛、产妇接触受限、听觉刺激和过度照明 ^7,8,9。

动物模型的利用对于促进我们对这些过程中涉及的潜在机制的理解和促进该领域的新进展至关重要。特别是，在研究中采用早产动物模型可以极大地促进扩大早产儿的知识体系，并为早产新生儿的疼痛管理干预提供有价值的见解¹⁰。

目前，专门针对早产儿的啮齿动物模型数量有限，其中大多数研究主要调查早产儿对大脑¹¹、肺发育¹²、坏死性小肠结肠炎¹³ 或免疫营养研究¹⁴ 的影响。然而，这些模型都没有检查疼痛系统的成熟度，这在早产儿的情况下特别脆弱。

早产及其对产后早期疼痛管理的影响仍然是关键的研究领域。因此，本研究旨在通过建立早产大鼠模型来为文献做出贡献。该模型提供了对新生儿针刺刺激对生命后期疼痛阈值影响的见解，增强了我们对早产相关疼痛的理解。

方案

所有实验程序均遵循阿尔费纳斯联邦大学动物实验伦理委员会通过的实验动物护理和使用指南（第 32/2016 号协议）。

1. 动物

1. 从 Alfenas 联邦大学的中央动物设施获得成年雄性和未产妇 Wistar 雌性大鼠（约 8 周龄）。
2. 将大鼠置于受控的温度和湿度条件下，在 12:12 小时光照:黑暗循环中，并在物理治疗动物设施学院（阿尔费纳斯联邦大学）随意喂食食物和水。

2. 检查怀孕

1. 1 个月，每天早上 8:00 至 9:00 之间，将每个动物笼运送到实验室。要进行阴道清洗，请小心地将含有 10 μL 0.9% NaCl 溶液的塑料移液管引入大鼠的阴道中。确保浅插入以避免深渗透，然后轻轻抽出以收集阴道分泌物。
2. 将收集的阴道液放在单独的载玻片上，为每个动物笼分配一个单独的载玻片。
   1. 使用干净的移液器吸头从每只大鼠身上获得一滴未染色的材料。使用 10 倍和 40 倍物镜在光学显微镜下检查材料，而不使用聚光镜。
   2. 根据其特征识别三种不同的细胞类型:圆形和有核上皮细胞、没有细胞核的不规则角质化细胞以及小而圆的白细胞¹⁵。
3. 将具有强烈角化和阴道脱屑的雌性 Wistar 大鼠暴露于交配，这是发情周期的特征，表明雄性接受性增加。通过在每个笼子中放置 2 只雌性和 1 只雄性来与大鼠交配。通过检查阴道涂片中是否存在精子和发情期细胞来确定妊娠第 0 天。

3. 妊娠母鸡及其后代的分类和管理

1. 根据妊娠阶段处理三种类型的妊娠母乳（每个 2 个母乳）:早产母乳、足月母乳和代孕母乳。让 Term 怀孕母羊在妊娠第 22 天自然分娩，并将其窝产仔数用于 Term 组。
2. 在妊娠第 19 天，对早产母马进行剖宫产，即预产期前 3 天。将这些垫料用于早产儿组。鉴于此手术不利于母亲的生存，请将早产幼崽委托给代孕母马，该母马在早产母马剖宫产前 2 天自然分娩。
3. 将代孕母犬的幼崽留在身边几个小时，让它们的气味与早产仔猪混合在一起。在此期间之后，引入早产仔猪并取出代孕者的原始幼崽，随后通过高剂量吸入异氟醚来牺牲它们。
   注意:此步骤对于确保代孕母犬已经刺激其乳腺分泌乳汁至关重要，使它们能够有效地喂养早产儿¹⁶。

4. 剖宫产手术

1. 用 2% 异氟醚部分麻醉早产妊娠母细胞，并在预产期前 3 天使用宫颈脱位对其进行安乐死。安乐死后，通过子宫切除术将后代一一提取出来。
2. 在下腹部中线切开 3 厘米，然后纵向切开 2 厘米。从这些切口中，沿着每个子宫管中间部分的肠系膜边界做一个切口。
3. 通过子宫切除术轻轻提取大鼠幼崽和胎盘^17,18。立即逐个提取后代。

5. 幼犬的术后护理和收养准备

1. 使用收养程序来防止手术的母亲因外科手术和潜在的疼痛而表现出不当行为，这可能会影响幼犬的成年行为。
2. 出生后用纸巾清理老鼠幼崽的气道。通过给老鼠幼崽洗澡来清洁它们，以防止替代水坝自相残杀。在 28 °C 的水中清洗大鼠幼崽并晾干。
3. 去除任何血迹，将幼崽放在加热红外照明下的培养皿中，保持约 28 °C 的温度，直到它们的呼吸变得正常。
4. 剪断胎盘正下方的脐带，并使用浸泡在 H₂O₂ 中的棉花来止住脐带的出血。最后，将它们提供给养母收养。

6. 养母互动和早产儿后代的收养

1. 将每个养母和他们的猫砂安置在单独的塑料笼子里。在转移之前，从寄养的手中标记每个学期的小狗。这种标记对于随后的母体行为分析至关重要。在整个收养过程中保持养母笼子的完整性。
2. 最初，将早产幼崽放在巢外。这种策略使代孕母亲能够在中立的领土上识别并熟悉新幼崽的气味。此外，选择一两只养母自己的幼崽，将它们与早产幼崽一起放在巢外。这种混合促使代孕母亲收集自己的幼崽和早产幼崽，从而促进新幼崽的接受和融入她的巢穴。
3. 最初将收养后代与亲生后代混合。确认有效采用。将养母的幼崽从巢中取出并献祭它们¹⁹.
   注意:在这项研究中，早产大鼠的存活率为 100%，并且它们没有被代孕母鼠排斥。

7. 垫料标准化

1. 在所有代孕幼崽组中保持每窝 8 只幼崽的窝产仔数，其中 4 只雄性和 4 只雌性。标准化后处死剩余的幼鼠。

8. 实验设计和协议实现

注意:该协议的目的是获得可行的早产幼崽，用于开发以下实验程序。

1. 总共使用 20 个怀孕母犬进行手术。将它们分为两个实验组，每个组由 10 个水坝组成。
   1. 用从 PND 2 到 PND 15 的针刺刺激第一组 PP 组的幼崽。
   2. 将第二组指定为 CC 组，作为对照，该组中的幼崽未接受针刺刺激。
   3. 在此期间，认真监测母鼠的母体行为和幼崽的重量。

9. 断奶后评估和行为测试

1. 在 PND 22 给后代断奶。按性别对它们进行分类，并将它们关在笼子里，每个笼子最多可容纳 4 只动物，直到它们达到大约 8 周大。
2. 之后，使用电子 von Frey 测试让这些动物接受对疼痛刺激的敏感性评估。特别关注 CFA 引起的炎症引起的疼痛。
3. 为了减轻任何潜在的与垫料相关的影响，从每个实验组的每窝中选择 1 只雄性和 1 只雌性大鼠，在成年期进行行为测试。
4. 在单个实验中使用每种动物，以避免激素因子干扰雌性后代大鼠的伤害性反应。具体来说，确保在发情周期的发情期对雌性进行测试。

10. 反复新生儿疼痛诱导

1. 使用类似于先前研究中描述的针刺技术诱发反复的新生儿疼痛²⁰。从出生后第 2 天 （PND 2） 开始对大鼠幼崽进行每日针刺刺激，并继续这种做法直到 PND 15。
2. 小心地将 22 G 针头插入右后爪的足底中部区域。
   1. 确保插入足以刺激而不会造成不应有的伤害。校准仪表以防止更深的插入，考虑到它在这个年龄完全穿过爪子的风险。
   2. 如果发生出血，请立即使用棉签止血;通常，这种干预只持续几秒钟。施用刺激 4 次，每次间隔 2 分钟，每天总共 8 次。
3. 为了尽量减少与母体分离和新生儿处理相关的潜在混杂因素，将大鼠幼崽与它们的母鼠分开最多 5 分钟。对控制组应用相同的分离持续时间。在每组刺激之后，立即将大鼠幼崽送回它们的母鼠 ^5,21,22。

11. 产妇行为评价

1. 为了评估产妇的行为，评估从 PND 2 到 PND 15 的两个实验组 （每组 n = 10） 中水坝的行为。分两次进行评估:一次在早上，在对大鼠幼崽进行针刺刺激之前（08:00 至 09:30 之间），另一次在下午，在对大鼠幼崽进行针刺刺激之后（15:00 至 16:30 之间）。
2. 在这些会议期间，每 3 分钟认真观察、记录和评分每位母亲的行为，每天每个时期进行 30 次观察。这累积到每位母亲每天总共 60 次观察。

12. 记录母亲和非母亲的行为

1. 记录产妇行为参数，包括梳理或舔舐（在身体或肛门生殖器区域）、哺乳、躺在幼崽身上保持弓形背部呈"毯子"状姿势、哺乳时被动地仰卧或侧卧、筑巢和产妇自我梳理（包括通过自我清洁刺激乳房）。
2. 记录非产妇行为参数，包括喂食、探索笼子外壳、不探索以及没有产妇自我梳理等行为。
3. 将数据表示为总产妇行为和非产妇行为的百分比。将记录的目标行为观察数除以观察总数，然后将结果乘以 100 ^5,23,24。

13. 窝重评估

1. 在整个针刺刺激阶段 （PND 2-15），监测 PP 和 CC 组的窝数，每组包括 8 窝。
2. 在针刺刺激阶段 （PND 2-15），持续检查 PP 组和 CC 组的窝产重量，每组由 8 窝组成。

14. 机械阈值测试

1. 在本实验中，对 PP 和 CC 组的大鼠（8 周龄）注射生理盐水或 CFA，每次注射体积为 100 μL。之后，在测试前 42-15 分钟将它们单独放置在带有金属丝网地板的丙烯酸笼（42 厘米× 24 厘米× 15 厘米）中，以评估机械痛觉过敏。
2. 在测试中，使用配备 0.5 mm² 聚丙烯尖端（电子 von Frey）的手持式力传感器诱导后爪屈曲反射。
   1. 逐渐将尖端涂抹在右后爪的五个远端脚垫之间，增加压力，直到观察到反应。
      注意:当爪子缩回时，刺激会自动停止，并记录其强度。测试以明显的畏缩反应结束，然后是爪子撤回。CFA 的皮下给药会引起长时间的炎症，在 24 小时达到峰值并持续至少 7 天²⁵。
3. 在施用生理盐水或 CFA⁴ 之前和之后 4 小时、7 小时、10 小时和 24 小时对动物进行测试。以戒断阈值表示结果，以克 （g） 为单位，并通过平均三次测量来计算。
4. 为防止潜在的荷尔蒙因子干扰女性后代的伤害性反应，请确保仅在发情周期的发情期进行测试。

15. 数据分析

1. 使用统计分析软件处理数据，并将其表示为平均值±平均值的标准误差 （SEM）。为了确定组间具有统计学意义的差异，应用双向方差分析 （ANOVA） 和重复测量，考虑母体与非母体参数评估和窝产仔体重评估等因素。
2. 具体来说，分析 PND 和针刺刺激的母体参数和 von Frey:CFA 和针刺刺激进行窝产仔体重评估。需要时，使用 Bonferroni 检验进行事后分析。

结果

在这项研究中，母亲之间的母体或非母体行为没有差异，无论她们的后代是在新生儿期接受了针刺实验，还是早产或足月（图 1）。关于早产儿后代养母的母体行为，双向方差分析显示 PND（产后日）有影响，但针刺刺激或两个因素之间的任何交互作用对评估上午 8 点观察到的产妇行为没有影响 [PND 因子:F_{（13， 140）} = 6.31，p < 0.001;针刺刺激因子: F_{（1， 140）} = 1.04， p = 0.30;针刺刺激 x PND 相互作用:F_{（13， 140）} = 0.55，p = 0.88; 图 1A];或在下午 3 点 [PND 因子:F_{（13， 140）} = 16.97， p < 0.001;针刺刺激因子:F_{（1， 140）} = 3.27，p = 0.07;针刺刺激 x PND 交互作用:F_{（13， 140）} = 1.82，p = 0.04; 图 1C]。就非产妇行为而言，PND 有明显的影响，但上午 8 点针刺刺激或这两个因素之间的相互作用没有显着影响 [PND 因子:F_{（13， 140）} = 6.31，p < 0.001;针刺刺激因子:F_{（1， 140）} = 1.04，p = 0.30;针刺刺激与 PND 之间的相互作用: F_{（13， 140）} = 0.55， p = 0.88;参见 图 1B]。同样，虽然 PND 效应持续存在，但针刺刺激的影响及其与 PND 的相互作用在下午 3 点没有统计学意义 [PND 因子:F_{（13， 140）} = 16.97，p < 0.001;针刺刺激因子:F_{（1， 140）} = 3.27，p = 0.07。双向方差分析揭示了 PND 的显着影响，重要的是，在下午 3:00 针刺刺激和 PND 之间存在显着交互作用（PND 因子:F（13， 182） = 13.82，p < 0.001;针刺刺激因子:F（1， 182） = 3.78，p = 0.05;PND x 针刺刺激相互作用:F（13， 182） = 1.82，p = 0.04;参见 图 1D]。这种相互作用强调了针刺刺激对非产妇行为的明显影响，在下午的评估中尤为明显。

图 1:新生儿期针刺 （PND 2-15） 对早产后代养母产妇行为的影响。 （A） 上午 8:00 评估的记录的产妇行为数量 （B） 上午 8:00 评估的记录的非产妇行为数量 （C） 下午 3:00 评估的记录的产妇行为数量 （D） 下午 3:00 评估的记录的非孕产行为数量每个点代表 SEM ±平均值。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2 显示了在应用针刺刺激期间早产窝的体重增加 （PND 2-15）。CC （对照） 组和 PP （针刺） 组之间未观察到窝重变化。双向方差分析显示 PND 有显著影响，但针刺刺激或两个因素之间的相互作用对窝重没有显着影响 [PND 因子:F_{（13， 140）} = 247.5，p < 0.001;针刺刺激因子:F_{（1， 140）} = 0.89，p = 0.34;针刺刺激× PND 交互作用:F_{（13， 140）} = 0.05，p = 1.00]。

图 2 - 新生儿期针刺 （PND 2-15） 对早产窝重量（克）的影响。 每个点代表 8 只动物的平均 ± SEM。 请单击此处查看此图的较大版本。

观察到针刺刺激和 CFA 对爪撤阈值的显着主效应，与 CC/Sal 和 PP/Sal 组相比，CC/CFA 和 PP/CFA 组的雄性幼崽在所有时间点均显着降低 （p < 0.001）（图 3A）。这强调了针刺刺激和 CFA 对雄性幼崽伤害性反应的强烈影响。值得注意的是，在 CFA 注射后 4 小时，与 CC/CFA 组相比，PP/CFA 组观察到 PWT 显着降低 （p < 0.001） [CFA 因子:F_（4,112） = 13.12，p < 0.001;针刺刺激因子:F_（3,112） = 14.45，p < 0.05;CFA x 针刺刺激相互作用:F_（12,112） = 5.14，p < 0.05]。关于雌性幼崽（图 3B），与 CC/Sal 和 PP/Sal 组相比，CC/CFA 和 PP/CFA 组在所有时间点的戒断阈值 （p < 0.001） 均有所降低。具体来说，CFA 注射后 4 小时，与 CC/CFA 组相比，PP/CFA 组观察到戒断阈值 （p < 0.05） 显著降低 [CFA 因子:F_（4,112） = 31.16，p < 0.001;针刺刺激因子:F_（3,112） = 18.22，p < 0.01;CFA x 针刺刺激相互作用:F_（12,112） = 58.13，p < 0.01]。从 4 h 开始的所有时间点，男性和女性成虫均表现出 PP/CFA 组和 CC/CFA 组之间的缩爪阈值降低。

图 3 - 根据足底内 CFA 或生理盐水注射前后的 von Frey 试验，早产窝新生儿期 （PND 2-15） 针刺对伤害感受的影响。 （A） 雄性大鼠或 （B） 雌性大鼠的爪子退出阈值，以克为单位。每个点代表 8 只动物的平均 ± SEM。* p < 0.05 和 *** p < 0.001 与对照组和 PP/CFA 组相比;# p < 0.01，将对照 CFA 组与 PP/CFA 组进行比较。BASAL 代表足底内注射 CFA 或生理盐水之前测得的伤害感受阈值。箭头表示足底内注射 CFA 或生理盐水的时间。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

在这项调查中，我们观察到母亲的母体和非母体行为不受新生儿针刺实验的影响。这种趋势也延伸到非母亲的行为。此外，在针刺刺激期间，早产窝的体重增加在对照组和针刺组之间没有显著差异。爪子退出阈值分析显示，与对照组相比，针刺组和 CFA 组的雄性和雌性幼崽均显着减少。特别引人注目的是观察到与对照组/CFA 组相比，针刺/CFA 组在 CFA 注射后 4 小时撤爪阈值进一步降低。这些细微差别的结果强调了新生儿针刺刺激对产妇行为、窝产体重增加和后代伤害性反应的多方面影响，强调了在解释结果时考虑早产和足月条件的重要性。

我们对伤害性反应的探索与 de Carvalho 等人的发现一致并扩展了 ²⁶ 的发现，他们报告了早产儿重复针刺刺激导致成年期伤害性反应和炎症超敏反应的改变。这种结果的趋同强调了新生儿经历对伤害感受途径的持久影响，强调了这些结果在研究中的稳健性。在受到新生儿针刺刺激的雄性和雌性幼崽中观察到的对有害刺激的敏感性增加，这表明伤害性反应的调节趋势一致，进一步有助于我们理解早期生活压力源的长期后果。

这项研究的结果也与 Gieré 等人的工作一致²⁷，他们探讨了新生儿母体分离后成年大鼠的伤害性超敏反应。他们的研究表明伤害性超敏反应的核心起源，强化了早期生活压力源可以诱导疼痛处理机制发生持久变化的概念。结果的趋同强调了早期生活事件和伤害性反应之间的复杂相互作用，进一步强调了全面了解导致疼痛敏感性长期改变的中心机制的必要性。

Chang 等人²⁸ 的研究结果进一步支持了早期生活经历对伤害感受通路的影响，他们研究了早期生活疼痛经历后大鼠体感和内侧前额叶皮层功能性疼痛连接的改变。他们的工作强调了早期生活压力源诱导的疼痛处理机制的长期变化，强调了了解伤害性反应的神经相关性的重要性。将这些结果与对接受新生儿针刺刺激的早产儿对有害刺激的高度敏感性的观察相结合，有助于更全面地了解早期疼痛经历对成人疼痛回路的持久影响。

此外，van den Hoogen 等人²⁹ 证明，新生儿期的反复触摸和针刺刺激增加了成人脊髓感觉神经元的基线机械敏感性和损伤后超敏反应。目前的发现与之前的研究一致，强调了新生儿疼痛经历对伤害感受途径的持久影响。这些研究共同强调了认识到早年生活经历对成人疼痛敏感性的长期影响的重要性，有助于全面理解新生儿刺激和伤害感受反应之间复杂的相互作用。

通过将早产与新生儿期暴露于痛苦刺激相结合，我们开发了一种模型，该模型与人类早产儿的早期生活经历非常相似，解释了早产儿对重症监护的迫切需求。然而，该模型的转化相关性，特别是与早产儿的 NICU 经历有关，需要进一步阐明。值得注意的是，未发现采用与本研究中使用的模型类似的早产儿模型的研究。然而，当将生命的最初几天 （1-2） 视为早产的代表时，先前的研究表明，在这个关键时期，男性比女性更易受到伤害性刺激的影响。这种脆弱性通过成年期应用的伤害感受测试得到证实，为本研究的观察结果提供了部分理由³⁰。

本研究率先使用妊娠 19 天剖宫产所生的早产儿来评估成年期的伤害感受阈值。这种研究早产新生儿疼痛的新模型为这一人群提供了独特的视角。该模型提出了关于两性成年动物的伤害感受测试的新问题，例如 von Frey 测试，以及这些动物的伤害感受阈值所涉及的所有方面，无论是在新生儿期还是在成年期。

虽然目前的研究主要集中在新生儿针刺刺激对生命后期疼痛阈值的影响，但有一条有希望的途径可以将这项研究扩展到干预措施和产后镇痛策略。未来的研究可以评估早产大鼠模型中各种疼痛管理干预措施的疗效，探索减轻新生儿疼痛长期影响的潜在途径。这可能包括研究新的镇痛方法，评估所需干预措施的持续时间和强度，以及探索影响这些干预措施有效性的潜在机制。

总之，本研究进行的综合调查旨在剖析新生儿针刺刺激、产妇行为和早产条件对后代伤害感受反应的错综复杂的相互作用。对母体行为的细致分析，加上排除了潜在的混杂因素，如早产和收养照顾，再次证实了母体行为对所施用的伤害性刺激的适应能力。早产仔猪的体重增加不受影响，这表明在成年期观察到的伤害性反应的变化更有可能归因于早期的针刺刺激，而不是母体护理或后代发育。这项研究的结果与关于新生儿疼痛经历的持久后果的文献一致，强调成年后对有害刺激的高度敏感。此外，对潜在机制理论的探索，包括神经加工和糖皮质激素受体功能的改变，为导致伤害性感受改变的潜在途径提供了有价值的见解。总之，这里介绍的结果和以前的研究结果强调了伤害感受途径中早期生活经历的复杂性，阐明了新生儿刺激对成人疼痛回路的持久影响。虽然需要进一步的研究来阐明所涉及的细微潜在机制，但这项研究有助于不断增长的知识体系，旨在揭示早期生活事件对成年后代伤害感受反应的长期影响。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% NaCl 溶液	Concare， 巴西
亚克力笼（42 cm × 24 cm × 15 cm），带金属丝网地板	Insight Equipamentos，巴西
完全弗氏佐剂 （CFA）	Sigma Aldrich，巴西
Electronic von Frey，Insight	Equipamentos，巴西
H2O2（过氧化氢）	ACS Cientifica，巴西
红外照明	Carci，巴西
异氟烷 （2%）	Cristália， 巴西
正置显微镜	尼康， 巴西	10 倍和 40 倍物镜	ECLIPSE Ei