本文介绍了一种建立早产大鼠模型的简明方案，以促进新生儿期疼痛管理的研究。该方法包括在预产期前3天进行剖宫产手术，通过子宫切除术取出早产仔鼠，并将其与代孕母鼠的亲生仔鼠混合哺育。
本文内容
摘要
摘要
本研究深入探讨了持续性针刺刺激对早产子代的影响，以确定其对疼痛敏感性的长期后果。本实验方案的主要目的是利用早产大鼠模型，研究新生儿期针刺刺激对生命后期疼痛阈值的影响。通过建立该模型，我们旨在推动对早产相关早期产后疼痛的理解与管理研究。研究结果表明，尽管机械刺激的基础阈值未受影响，但在成年大鼠注射完全弗氏佐剂（CFA）后，机械性痛觉过敏显著增强。有趣的是，与雄性大鼠相比，雌性大鼠表现出更强的炎症性痛觉过敏。值得注意的是，母鼠行为、仔鼠窝重以及子代生长轨迹均未因刺激而改变。新生儿期疼痛刺激后在成年期出现的伤害感受反应改变，可能提示感觉信息处理及糖皮质激素受体功能发生了变化。然而，仍需进一步研究以阐明其潜在机制，并为早产及新生儿期疼痛在成年期带来的后果开发干预措施。
引言
在新生儿期，伤害性感受通路经历显著的结构和功能成熟过程，而组织损伤及其相关疼痛的存在对躯体感觉处理的发育具有深远影响1。
利用动物模型可以对非人类动物进行受控的实验性操作，从而在减少潜在混杂因素的情况下，更深入地理解新生儿期疼痛对个体后期行为的影响2,3。一个常见的观察结果是，新生儿期疼痛会导致成年期疼痛敏感性升高2,4,5。在新生儿重症监护室（NICU）中，新生儿疼痛是一种高度普遍的应激源，早产儿通常每天平均接受10项侵入性操作6。NICU中的早产新生儿会遭遇多种应激因素，包括疼痛、母体接触受限、听觉刺激以及过度照明7,8,9。
动物模型的使用对于深入理解这些过程的潜在机制以及推动该领域的最新进展至关重要。特别是，在研究中采用早产动物模型，可显著拓展关于早产儿的知识体系，并为早产新生儿的疼痛管理干预措施提供有价值的科学依据10。
目前，专门针对早产的啮齿类动物模型数量有限，其中大多数研究主要探讨早产对大脑11、肺部发育12、坏死性小肠结肠炎13或免疫营养研究14的影响。然而，这些模型均未考察疼痛系统的成熟过程，而该系统在早产情况下尤为脆弱。
早产及其对出生后早期疼痛管理的影响仍是研究的关键领域。因此，本研究旨在通过建立早产大鼠模型，为相关文献做出贡献。该模型有助于深入了解新生儿期针刺刺激对生命后期疼痛阈值的影响，从而增进对早产相关性疼痛的理解。
方案
所有实验操作均遵循阿尔法纳斯联邦大学动物实验伦理委员会（方案编号32/2016）通过的《实验动物护理和使用指南》。
1. 动物
- 从阿尔法enas联邦大学中心动物实验中心获取成年雄性及未产过仔的Wistar雌性大鼠（约八周龄）。
- 将大鼠饲养在温度和湿度受控的环境中，保持12小时光照：12小时黑暗的循环，并提供标准饲料和水 随意摄取 在阿尔法纳斯联邦大学物理治疗学院动物实验中心。
2. 检测妊娠
- 连续1个月，每天上午8:00至9:00之间，将每只动物的笼子转移至实验室内。进行阴道冲洗时，小心地将含有10 µL 0.9% NaCl溶液的塑料移液管插入大鼠阴道内。确保插入深度较浅，避免深入，然后轻柔回抽以收集阴道分泌物。
- 将收集的阴道液体分别置于不同的玻璃载玻片上，每笼动物使用单独的载玻片。
- 使用洁净的移液器吸头从每只大鼠获取一滴未染色样本，利用光学显微镜在10x和40x物镜下观察样本，不使用聚光镜。
- 根据细胞形态特征识别三种不同类型的细胞：圆形且有核的上皮细胞、无细胞核的不规则角化细胞，以及体积小且呈圆形的白细胞15。
- 将表现出明显角化和阴道脱落的大鼠（此为动情周期的特征，提示雌性接受交配意愿增强）用于交配实验。每笼放入2只雌鼠和1只雄鼠进行交配。通过检查阴道涂片中是否存在精子及动情期细胞来确定妊娠第0天。
3. 孕鼠及其后代的分类与管理
- 根据妊娠阶段处理三类妊娠母鼠（每类2只）：早产组、足月组和代孕母鼠组。让足月妊娠母鼠在妊娠第22天自然分娩，并将其产下的仔鼠用于足月组。
- 在妊娠第19天对早产妊娠母鼠实施剖宫产手术，此时距离其预期分娩日期提前3天。将手术获得的仔鼠用于早产组。由于该手术不利于母鼠存活，需将早产仔鼠交由代孕母鼠抚养，这些代孕母鼠应在早产母鼠剖宫产手术前2天已自然分娩。
- 将代孕母鼠亲生的仔鼠与其共同饲养数小时，使其气味与早产仔鼠相互混合。此后，引入早产仔鼠并移除代孕母鼠原有的亲生仔鼠，随后通过吸入高剂量异氟烷将其处死。
注意：此步骤至关重要，可确保代孕母鼠乳腺已开始分泌乳汁，从而能够有效哺育早产仔鼠16。
4. 剖宫产手术
- 使用2%异氟烷对早产妊娠母鼠进行部分麻醉，并在预期分娩日期前3天通过颈椎脱位法实施安乐死。安乐死后，通过剖宫术逐一取出仔鼠。
- 在下腹部正中做3 cm切口，随后做2 cm纵向切口。从这些切口处开始，沿每侧输卵管无血管缘的中段进行切开。
- 通过剖宫术轻柔地取出新生大鼠及胎盘17,18。应立即逐一取出仔鼠。
5. 术后护理及仔鼠收养前的准备
- 采用领养程序，以防止手术母鼠因手术操作及潜在疼痛而出现异常行为，从而影响幼鼠成年后的行为表现。
- 幼鼠出生后，使用纸巾清理其呼吸道。通过给幼鼠洗澡进行清洁，以防止代孕母鼠发生食仔行为。用28 °C的水清洗幼鼠，随后将其擦干。
- 清除幼鼠身上任何血迹，并将其置于培养皿中，在约28 °C的加热红外灯下保温，直至呼吸规律。
- 在胎盘下方剪断脐带，并用浸有H2O2的棉球止住脐带出血。最后将幼鼠交给养母进行哺育。
6. 早产子代的养母互动与收养
- 将每只代孕母犬与其幼崽一同饲养在独立的塑料笼中。在转移前，需用手标记每只早产幼崽。此标记对于后续的母性行为分析至关重要。在整个收养过程中，须保持代孕母犬笼具的完整性。
- 最初，将早产幼崽放置于巢穴外。该策略可使代孕母犬在中立区域识别并熟悉新幼崽的气味。同时，选取一至两只代孕母犬自身的幼崽，与早产幼崽一同置于巢穴外。这种混合方式会促使代孕母犬将自身幼崽与早产幼崽一同叼回巢中，从而促进其对新幼崽的接受与整合。
- 最初将收养的后代与亲生后代混合放置，以确认收养是否有效。随后将代孕母犬的亲生幼崽从巢中移出并处死19。
注意：在本研究中，早产大鼠的存活率为100%，且未被代孕母鼠排斥。
7. 幼崽标准化
- 所有代孕饲养的幼崽组均维持每窝8只幼崽，其中4只为雄性，4只为雌性。标准化后处死剩余的幼鼠。
8. 实验设计与方案实施
注意：本方案的目的是获得可存活的早产幼崽，以用于后续实验操作的开发。
- 实验共使用20只怀孕母鼠，将其分为两个实验组，每组各10只母鼠。
- 对第一组（即PP组）的幼鼠在出生后第2天至第15天（PND 2至PND 15）期间施加针刺刺激。
- 将第二组定为对照组（CC组），该组幼鼠不接受针刺刺激。
- 在此期间密切监测母鼠的母性行为及幼崽体重变化。
断奶后的评估与行为学测试
- 在出生后第22天（PND 22）对子代进行断奶。按性别分组，每笼饲养不超过4只，直至其达到约8周龄。
- 随后，使用电子 von Frey 试验对这些动物进行疼痛刺激敏感性评估，重点检测由CFA诱导的炎症性疼痛。
- 为减少可能的窝别效应影响，从每窝中各选取1只雄性和1只雌性大鼠，分配至各实验组，用于成年期的行为学测试。
- 每只动物仅用于单次实验，以避免激素因素对雌性子代痛觉反应的干扰。具体而言，确保在雌性大鼠动情周期的动情间期进行测试。
10. 新生儿期重复性疼痛诱导
- 采用类似于先前研究中描述的针刺技术诱导新生大鼠反复疼痛20。从出生后第2天（PND 2）开始，对幼鼠每日施加针刺刺激，并持续至出生后第15天（PND 15）。
- 将一支22 G针头小心插入右侧后肢足底中部，深度宜浅。
- 确保刺入深度仅足以引发刺激，避免造成过度损伤。应校准针刺深度以防止过深穿刺，尤其需考虑此年龄段幼鼠足垫较薄，存在针头完全穿透的风险。
- 若出现出血，应立即使用棉签压迫止血；通常该处理仅需数秒即可完成。每次共施加4次刺激，每次间隔2 min，每日总计8次针刺。
- 为尽量减少因母鼠分离和新生幼鼠操作可能带来的混杂因素，每次将幼鼠与其母鼠分离的时间不得超过5 min，并对对照组采用相同的分离时长。每次刺激结束后，应立即将幼鼠放回母鼠身边5,21,22。
11. 母性行为的评估
- 为评估母体行为，需在实验组和对照组（每组 n = 10）中分别于出生后第2天（PND 2）至第15天（PND 15）期间观察母鼠的行为。每日进行两次观察：一次在上午，在对仔鼠实施针刺刺激之前（08:00 至 09:30 之间）；另一次在下午，在对仔鼠实施针刺刺激之后（15:00 至 16:30 之间）。
- 在每次观察期间，应每3分钟系统地观察、记录并评分每只母鼠的行为，使每个时间段每日获得30次观察数据，总计每只母鼠每日完成60次观察。
12. 母性与非母性行为的记录
- 记录涵盖以下行为的母性行为参数：对幼崽身体或肛周区域进行理毛或舔舐、哺乳、保持弓背姿势 "毯子" 通过伏卧在幼崽身上、哺乳时被动地仰卧或侧卧、筑巢行为以及母体自我理毛（包括通过自我清洁刺激乳房）等方式表现出类似母性姿态。
- 记录非母性行为参数，包括进食、探索笼舍、不探索以及缺乏母体自我理毛等行为。
- 将数据表示为母性行为和非母性行为占总行为的百分比。用记录到的目标行为次数除以观察总次数，再将结果乘以100。5,23,24.
13. 胎盘重量评估
- 在针刺刺激阶段（出生后第2-15天），监测针刺组（PP组）和对照组（CC组）每窝幼仔的体重，每组包含8窝。
- 在针刺刺激阶段（出生后第2-15天），持续监测针刺组（PP组）和对照组（CC组）每窝幼仔的体重，每组由8窝组成。
14. 机械阈值测试
- 在本实验中，向PP组和CC组的大鼠（8周龄）分别注射生理盐水或CFA，每只注射体积为100 µL。注射后，将大鼠单独置于带金属丝网格地板的亚克力笼子（42 cm × 24 cm × 15 cm）中，适应15–30分钟，随后进行机械性痛觉过敏的评估。
- 在测试中，使用配备有0.5 mm的 handheld force transducer 诱导后肢足底屈肌反射2 聚丙烯探头（电子 von Frey）
- 逐渐将探头施加于右后足的五个远端足垫之间，持续增加压力直至观察到反应。
注意：当出现足爪回缩时，刺激会自动停止，并记录其强度。测试以明显的畏缩反应伴随足爪回缩为结束。皮下注射CFA可诱导持续性炎症，炎症在24小时达到高峰，并持续至少7天。25.
- 逐渐将探头施加于右后足的五个远端足垫之间，持续增加压力直至观察到反应。
- 在给予生理盐水或CFA前及给药后4 h、7 h、10 h和24 h对动物进行检测4以克（g）为单位表示结果，即撤退阈值，并通过取三次测量值的平均值进行计算。
- 为避免雌性子代伤害感受反应中潜在激素因素的干扰，应确保实验仅在其动情周期的动情间期进行。
15. 数据分析
- 使用统计分析软件处理数据，并以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。为确定组间具有统计学意义的差异，采用重复测量的双因素方差分析（ANOVA），考虑诸如母体与非母体参数比较以及仔鼠体重评估等因素。
- 具体而言，对母体参数分析出生后天数（PND）和针刺刺激数据，对仔鼠体重评估分析von Frey：CFA以及针刺刺激数据。必要时采用Bonferroni检验进行事后分析。
结果
本研究中，无论其后代在新生儿期是否接受过针刺实验，或为早产或足月出生，母亲之间的母性行为和非母性行为均无差异（图1）。关于早产后代的收养母亲的母性行为，双因素方差分析显示，在上午8点观察到的行为中，出生后天数（PND）具有显著效应，但针刺刺激因素及其与PND的交互作用均无显著影响 [PND因素：F(13, 140) = 6.31，p < 0.001；针刺刺激因素：F(1, 140) = 1.04，p = 0.30；针刺刺激 × PND交互作用：F(13, 140) = 0.55，p = 0.88；图1A]；在下午3点的观察中同样发现PND具有显著效应，针刺刺激因素无显著影响，且两因素间无显著交互作用 [PND因素：F(13, 140) = 16.97，p < 0.001；针刺刺激因素：F(1, 140) = 3.27，p = 0.07；针刺刺激 × PND交互作用：F(13, 140) = 1.82，p = 0.04；图1C]。在非母性行为方面，上午8点时PND具有明显效应，但针刺刺激及其与PND的交互作用均无统计学意义 [PND因素：F(13, 140) = 6.31，p < 0.001；针刺刺激因素：F(1, 140) = 1.04，p = 0.30；针刺刺激与PND的交互作用：F(13, 140) = 0.55，p = 0.88；见图1B]。类似地，在下午3点时，尽管PND效应仍然存在，针刺刺激及其与PND的交互作用仍无统计学显著性 [PND因素：F(13, 140) = 16.97，p < 0.001；针刺刺激因素：F(1, 140) = 3.27，p = 0.07]。双因素方差分析揭示了PND的显著效应，并且在下午3:00时，针刺刺激与PND之间存在显著交互作用（PND因素：F(13, 182) = 13.82，p < 0.001；针刺刺激因素：F(1, 182) = 3.78，p = 0.05；PND × 针刺刺激交互作用：F(13, 182) = 1.82，p = 0.04；参见图1D）。该交互作用凸显了针刺刺激对非母性行为的独特影响，尤其在下午评估中更为明显。
图1：新生儿期（PND 2-15）针刺对早产子代养母母性行为的影响。（A）上午8:00评估的记录母性行为次数。（B）上午8:00评估的记录非母性行为次数。（C）下午3:00评估的记录母性行为次数。（D）下午3:00评估的记录非母性行为次数。每个数据点代表均值 ± 标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。
图2展示了在施加针刺刺激期间（出生后第2-15天）早产仔鼠窝的体重增长情况。在CC（对照）组与PP（针刺）组之间，仔鼠窝的体重未观察到显著变化。双因素方差分析显示出生后天数（PND）具有显著效应，但针刺刺激因素及其与PND的交互作用对仔鼠窝体重均无显著影响[PND因素：F(13, 140) = 247.5，p < 0.001；针刺刺激因素：F(1, 140) = 0.89，p = 0.34；针刺刺激 × PND交互作用：F(13, 140) = 0.05，p = 1.00]。
图 2 - 新生期（出生后第 2-15 天）针刺刺激对早产仔鼠体重（单位：克）的影响。 每个数据点代表 8 只动物的平均值 ± 标准误。 请点击此处查看该图的放大版本。
针刺刺激和完全弗氏佐剂（CFA）对雄性幼鼠的爪退缩阈值具有显著的主效应，与CC/Sal组和PP/Sal组相比，CC/CFA组和PP/CFA组雄性幼鼠在所有时间点均表现出显著降低（p < 0.001）的阈值（图3A）。这凸显了针刺刺激和CFA对雄性幼鼠伤害性反应的强烈影响。值得注意的是，在CFA注射后4小时，PP/CFA组的退缩阈值较CC/CFA组显著降低（p < 0.001）[CFA因素：F(4,112) = 13.12，p < 0.001；针刺刺激因素：F(3,112) = 14.45，p < 0.05；CFA × 针刺刺激交互作用：F(12,112) = 5.14，p < 0.05]。在雌性幼鼠中（图3B），与CC/Sal组和PP/Sal组相比，CC/CFA组和PP/CFA组在所有时间点均观察到退缩阈值的显著下降（p < 0.001）。具体而言，在CFA注射后4小时，PP/CFA组的退缩阈值较CC/CFA组显著降低（p < 0.05）[CFA因素：F(4,112) = 31.16，p < 0.001；针刺刺激因素：F(3,112) = 18.22，p < 0.01；CFA × 针刺刺激交互作用：F(12,112) = 58.13，p < 0.01]。雄性和雌性成年动物均在CFA注射后4小时起，在所有时间点上表现出PP/CFA组相较于CC/CFA组更低的爪退缩阈值。
图3 - 新生期（出生后第2-15天）对早产仔鼠进行针刺处理对福尔马林足底注射前后冯·弗雷测试中伤害感受的影响。 足底缩足阈值（单位：克），在（A）雄性大鼠或（B）雌性大鼠中的结果。每个数据点代表8只动物的平均值±标准误（SEM）。* p < 0.05，*** p < 0.001，表示对照组和PP/生理盐水组与对照组和PP/CFA组之间的比较；# p < 0.01，表示对照CFA组与PP/CFA组之间的比较。BASAL表示足底注射CFA或生理盐水前测得的伤害感受阈值。箭头表示足底注射CFA或生理盐水的时间点。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本研究中，我们观察到母亲的母性行为和非母性行为均未受到新生期针刺实验的影响。这一趋势同样延伸至非母性行为。此外，在针刺刺激期间，早产幼崽窝的体重增长在对照组与针刺组之间无显著差异。爪退缩阈值分析显示，与对照组相比，针刺组和CFA组的雄性和雌性幼崽均表现出显著降低的爪退缩阈值。尤为显著的是，在注射CFA后4小时，针刺/CFA组幼崽的爪退缩阈值较对照/CFA组进一步降低。这些细致的结果凸显了新生期针刺刺激对母体行为、幼崽窝体重增长以及子代伤害性感受反应的多方面影响，强调了在解释实验结果时需同时考虑早产和足月条件的重要性。
我们对伤害性反应的研究结果与de Carvalho等人26的发现一致并有所拓展，后者报道了早产子代在新生儿期反复受到针刺刺激后，成年期的伤害性反应和炎症性痛觉过敏发生改变。这些结果的趋同凸显了新生儿期经历对伤害性通路的持久影响，强调了此类结果在不同研究中具有高度稳健性。在接受新生儿期针刺刺激的雄性和雌性幼鼠中，均观察到对有害刺激的敏感性增加，表明伤害性反应的调节存在一致的趋势，进一步加深了我们对生命早期应激源长期后果的理解。
本研究的结果还与Gieré等人27的研究一致，后者探讨了新生期母体分离后成年大鼠的伤害性感觉过敏现象。他们的研究表明，伤害性感觉过敏具有中枢起源，进一步支持了生命早期应激可导致疼痛处理机制发生持久改变的观点。这些结果的汇聚凸显了生命早期事件与伤害性感受反应之间复杂的相互作用，进一步强调了全面理解中枢机制在长期疼痛敏感性改变中所起作用的必要性。
Chang 等人28的研究进一步支持了早期生活经历对伤害性感受通路的影响，他们探讨了大鼠在经历早期疼痛后，体感皮层和内侧前额叶皮层中功能性疼痛连接的改变。该研究揭示了早期应激因素所诱导的疼痛处理机制的长期变化，强调了理解伤害性感受反应神经相关性的必要性。将这些结果与早产子代在新生儿期经受针刺刺激后对有害刺激敏感性增强的观察结果相结合，有助于更全面地认识早期疼痛经历对成年期疼痛环路的持久影响。
此外，van den Hoogen 等人29证明，在新生儿期反复进行触碰和针刺刺激会增加成年期脊髓感觉神经元的基础机械敏感性以及损伤后的超敏反应。当前的研究结果与既往研究一致，凸显了新生儿期疼痛经历对伤害性感觉通路所产生的持久影响。这些研究共同强调了认识生命早期经历对成年期疼痛敏感性长期影响的重要性，有助于全面理解新生儿刺激与伤害性反应之间复杂的相互作用。
通过将早产与新生儿期疼痛刺激暴露相结合，我们建立了一个 closely 模拟人类早产儿早期生命经历的模型，该模型考虑了早产所必需的重症监护的迫切需求。然而，该模型的转化相关性，特别是与早产儿在新生儿重症监护病房（NICU）经历的相关性，仍需进一步阐明。值得注意的是，目前尚未发现采用与本研究相似的早产模型的研究。然而，若将生命最初数日（1-2日）视为早产的代表，则既往研究已表明，在这一关键时期，雄性对伤害性刺激的易感性高于雌性。这种易感性通过成年期施加的伤害性测试得以证实，为本研究观察到的结果提供了部分依据30。
本研究首次采用妊娠19天经剖宫产出生的早产动物，来评估其成年期的伤害感受阈值。这一用于研究早产新生儿疼痛的新型模型，为此类群体提供了独特的研究视角。该模型引发了关于成年期两性动物伤害感受测试（如von Frey试验）的新问题，同时也涉及这些动物在新生儿期或成年期伤害感受阈值相关的各个方面。
尽管本研究主要关注新生儿期针刺刺激对生命后期痛觉阈值的影响，但将该研究拓展至干预措施和出生后镇痛策略方面具有广阔前景。未来的研究可评估多种疼痛管理干预措施在早产大鼠模型中的有效性，探索减轻新生儿期疼痛长期影响的潜在途径。这可能包括研究新型镇痛方法、评估干预措施所需的作用持续时间和强度，以及探究影响这些干预效果的潜在机制。
综上所述，本研究开展的全面调查旨在剖析新生期针刺刺激、母体行为以及早产条件对子代伤害性感受反应之间复杂的相互作用。通过对母体行为进行细致分析，并排除早产和寄养照护等潜在混杂因素的影响，研究再次证实了母体行为对所施加的伤害性刺激具有较强的稳定性。早产仔鼠的体重增长未受影响，表明成年期观察到的伤害性感受反应改变更可能归因于生命早期的针刺刺激，而非母体照料或子代发育因素。本研究结果与现有文献一致，均强调了新生期疼痛经历对成年期有害刺激敏感性升高的长期影响。此外，对潜在机制理论的探讨，包括神经处理方式的改变和糖皮质激素受体功能的变化，为理解导致伤害性感受改变的内在通路提供了有价值的见解。本研究结果与既往研究共同凸显了生命早期经历在伤害性感受通路中的复杂性，揭示了新生期刺激对成年疼痛环路的持久影响。尽管仍需进一步研究以阐明其中精细的潜在机制，但本研究增进了人们对生命早期事件对成年子代伤害性感受反应长期影响的认识。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本工作由阿尔法enas联邦大学（UNIFAL-MG）和巴西高等教育人员进修协调机构（CAPES 奖学金，Laura Pereira Generoso；Natalie Lange Candido 和 Maria Gabriela Maziero Capello）资助——资助代码 001。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% NaCl 溶液 | Concare，巴西 | ||
| 丙烯酸笼具（42 cm × 24 cm × 15 cm），带金属网底 | Insight Equipamentos，巴西 | ||
| 完全弗氏佐剂（CFA） | Sigma Aldrich，巴西 | ||
| 电子 von Frey 仪 | Insight Equipamentos，巴西 | ||
| H2O2（过氧化氢） | ACS Cientifica，巴西 | ||
| 红外照明设备 | Carci，巴西 | ||
| 异氟烷（2%） | Cristália，巴西 | ||
| 直立式显微镜 | Nikon，巴西 | ECLIPSE Ei | 配备 10x 和 40x 物镜的显微镜 |
参考文献
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