用于研究跟腱撞击力学生物学的小鼠后肢离体模型

Brian C. Wise; Keshia E. Mora; Whasil Lee; Mark R. Buckley

doi:10.3791/65801

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方法文章

用于研究跟腱撞击力学生物学的小鼠后肢离体模型

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DOI：

10.3791/65801

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2023年12月8日

Brian C. Wise¹^,² , Keshia E. Mora¹^,² , Whasil Lee¹^,²^,³ , Mark R. Buckley¹^,²

¹Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, ²Department of Orthopaedics, Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center, ³Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester Medical Center

本文内容

摘要

我们介绍一种定制的实验平台和组织培养方案，该方案可重现由跟腱止点撞击引起的纤维软骨变性，同时在小鼠后肢离体组织中维持细胞长期存活，为探索腱组织撞击的力学生物学机制提供了一个合适的模型。

摘要

肌腱在骨面上的挤压会产生一种多轴力学应变环境，其中横向压缩应变显著升高，从而引发局部纤维软骨表型，其特征为富含糖胺聚糖（GAG）的基质积聚以及胶原网络的重塑。尽管纤维软骨是健康肌腱受挤压区域的正常结构特征，但GAG过度沉积和胶原网络紊乱却是肌腱病的典型病理表现。因此，临床上已将挤压视为肌腱病发生与发展的重要外在因素。然而，肌腱挤压背后的力学生物学机制仍研究不足。以往探究肌腱挤压过程中细胞反应的研究，多采用对细胞或离体肌腱组织施加单轴压缩载荷的方法。体外然而，分离的细胞缺乏对力学响应至关重要的三维细胞外环境，且两者体外且外植体研究无法重现肌腱撞击所产生的多轴应变环境体内，这取决于受压区域的解剖学特征。此外，体内肌腱撞击模型难以控制机械应变环境。为克服这些局限性，我们提出一种新型的小鼠后肢离体模型，适用于研究跟腱撞击的力学生物学机制。该模型可维持跟腱原位以保留局部解剖结构，并在被动施加踝关节背屈时，重现跟腱止点与跟骨撞击所产生的多轴应变环境，同时使细胞保持在其原始微环境中。我们描述了该模型所必需的组织培养方案，并提供了数据证明离体组织在7天内维持持续的活性。代表性结果表明，由于撞击作用，糖胺聚糖（GAG）组织学染色增强，胶原纤维排列减少，提示纤维软骨形成增加。该模型可轻松用于研究不同的力学加载方案，并允许调控特定分子通路，以鉴定跟腱在撞击刺激下发生表型改变的潜在机制。

引言

多种肌腱（包括跟腱和肩袖肌腱）由于正常的解剖位置关系，会受到骨性撞击的影响¹^,²^,³^,⁴。肌腱撞击会产生垂直于肌腱纤维纵轴的横向压缩应变⁵^,⁶^,⁷。在发生肌腱撞击的区域，会出现一种独特的纤维软骨表型，其特征是细胞体积缩小、呈圆形（即纤维软骨细胞），嵌于结构紊乱的胶原网络中，且糖胺聚糖（GAG）含量显著增加²^,³^,⁴^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴。既往研究表明，肌腱撞击所形成的特殊力学环境可通过促进大量聚集型蛋白聚糖（尤其是聚集蛋白聚糖aggrecan）的沉积，维持这种富含GAG的基质，但其潜在机制尚不明确¹^,³^,¹²^,¹³^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰^,³¹^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷^,³⁸^,³⁹。尽管纤维软骨是健康肌腱中受撞击区域的正常结构特征，但与过度纤维软骨形成相关的蛋白聚糖代谢异常是肌腱病的典型特征；肌腱病是一种常见且致残的疾病，在长期受撞击的肌腱中尤为高发¹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴^,⁴⁵^,⁴⁶^,⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹。因此，临床上已将肌腱撞击视为驱动多种常见肌腱病的重要外在因素，包括肩袖疾病和插入性跟腱病（IAT）⁵⁰^,⁵¹^,⁵²。目前，肌腱病的治疗效率较低。例如，在插入性跟腱病患者中，约有47%的患者在接受保守治疗失败后需要手术干预，但术后疗效存在较大差异⁵³^,⁵⁴^,⁵⁵^,⁵⁶。尽管肌腱撞击与肌腱病之间存在明显的关联，但关于受撞击肌腱中的细胞如何感知并响应其力学环境的力学生物学机制仍缺乏充分描述，这阻碍了对肌腱病发病机制的理解，并导致治疗手段不足。

外植体模型是研究肌腱力学生物学的有用工具⁵⁷^,⁵⁸为理解肌腱受压的力学生物学机制，已有若干先前研究探讨了对细胞或离体肌腱组织施加单轴压缩后细胞的响应。²⁷^,²⁹^,³⁰^,³¹^,³²^,³³^,³⁴^,³⁹。然而，细胞体外缺乏促进应变传递的细胞外和细胞周基质，无法螯合机械形变所释放的重要生长因子和细胞因子，也不能为在机械转导中起作用的黏着斑复合物提供附着底物⁵⁷^,⁵⁹。此外，两者均体外且外植体研究无法重现肌腱撞击所产生的多轴向力学应变环境体内，这取决于受压区域的解剖学特征⁵^,⁶在跟腱止点受压的情况下，这包括周围组织，如跟骨后滑囊和Kager脂肪垫⁶⁰^,⁶¹^,⁶²^,⁶³相反，体内肌腱撞击模型²⁵^,²⁸^,³⁶^,³⁷^,³⁸^,⁶⁴^,⁶⁵^,⁶⁶ 对直接施加于肌腱的负荷大小和频率的调控能力有限，这是公认的一个局限性体内用于研究肌腱力学生物学的模型⁵⁷^,⁵⁸^,⁶⁷^,⁶⁸^,⁶⁹^,⁷⁰. 鉴于测量肌腱应变存在挑战体内这些模型内部产生的应变环境通常表征不足。

在本论文中，我们介绍了一种定制的实验平台，该平台可在完整的小鼠后肢离体组织中重现跟腱止点对跟骨的撞击。当与本组织培养方案结合使用时，该平台可在离体培养中维持组织活力超过7天，并允许研究跟腱撞击所引发的生物学继发效应。该平台基于一个3D打印的聚乳酸（PLA）底座，为夹具和3D打印的PLA体积减少插件提供安装基础。夹具用于夹持小腿和膝关节近端，位置位于跟腱肌腱结合部近侧，后肢尾侧朝上，从而允许通过超声探头或倒置显微镜从上方对跟腱进行成像（图1A）。体积减少插件沿底座上的轨道滑动，可减少组织培养基所需的体积。一根编织线缠绕在后足掌，并通过底座设计和一个3D打印的PLA夹扣引出平台外。通过拉动该绳线，可使后足背屈，从而使跟腱止点撞击跟骨，产生升高的横向压缩应变⁵^,⁶（图1A）。整个平台置于一个丙烯酸浴槽内，确保后肢离体组织完全浸没在组织培养基中。使用胶带将拉紧的绳线固定在浴槽外部，以维持踝关节背屈状态，从而实现跟腱止点的静态撞击。所有3D打印部件的CAD文件以多种格式提供（补充文件1），可导入多种商业或免费开源的CAD软件中，便于根据实验需求进行修改。若无法自行使用3D打印机制造，也可将CAD文件提交至在线3D打印服务，以低成本完成打印并邮寄部件。

重要的是，腓肠肌-跟腱肌肉肌腱复合体跨越膝关节和踝关节⁷¹^,⁷²^,⁷³。因此，跟腱内的拉伸应变受膝关节屈曲的影响。膝关节伸展会使跟腱处于张力状态，而膝关节屈曲则会降低张力。通过先伸展膝关节，再被动背屈踝关节，可在受压的止点处将压缩应变叠加于拉伸应变之上。相反，在膝关节屈曲状态下被动背屈踝关节，则可降低拉伸应变，而压缩应变保持不变。本实验方案探讨了三种此类条件：1）对于静态受压状态，足部相对于胫骨背屈至<110°，以造成止点受压，同时膝关节屈曲以降低张力；2）对于基础张力组，膝关节伸展，踝关节背屈超过145°，在止点处主要产生拉伸应变；3）对于无载荷组，离体样本在培养皿中培养，膝关节和踝关节均处于中立位置，且无外部施加负荷。上述角度是通过摄影测量法相对于一个坐标系确定的，该坐标系中足部与胫骨平行时为180°，垂直时为90°。

本实验方案的关键步骤包括：1）后肢外植体的解剖，并仔细去除皮肤和足底肌腱；2）经48小时地塞米松预处理后的外植体培养；3）组织切片与组织学染色；以及4）彩色图像分析以评估纤维软骨的形成。解剖完成后，每只小鼠的后肢外植体均在培养基中进行48小时的预处理，培养基中添加地塞米松⁷⁴。每只小鼠的对侧肢体被分配至不同的实验组，用于成对比较，以帮助控制生物学变异。预处理后，外植体按上述方法放置于培养平台中，继续培养7天（图1B）。此外，还将结果与预处理组（第0天组）进行额外比较，该组外植体在完成48小时预处理后立即取出。

外植体培养后，后肢组织经修剪，用福尔马林固定，脱钙并包埋于石蜡中。以矢状面进行连续切片，可从肌腱-肌肉连接处至跟骨附着点完整观察跟腱结构，同时能够追踪整个肌腱的切片深度。采用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP缺口标记法（TUNEL）检测继发于细胞凋亡的DNA损伤，以评估细胞活性。通过甲苯胺蓝组织学染色及定制的彩色图像分析，定量分析糖胺聚糖（GAG）染色的变化。甲苯胺蓝染色的组织切片进一步用于二次谐波成像（SHG），以表征胶原纤维排列结构的改变（图1B）。

所提供的代表性结果表明，在该模型中，持续7天的静态受压导致富含糖胺聚糖的基质出现异常的组织学染色，以及细胞外胶原网络结构紊乱。该模型可用于探索受压诱导纤维软骨变性的分子机制。

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方案

所有动物实验均已获得罗切斯特大学动物资源委员会的批准。

1. 组织培养基的制备

将所有外植体置于含1% v/v 青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（1x DMEM）中培养，并 200 µM L-抗坏血酸在培养箱中 37 °C 和 5% CO₂在最初的48小时预处理期间，将每个外植体培养于70 mL添加了100 nM地塞米松的培养基中⁷⁴预处理后，在不含地塞米松的培养基中继续培养肢体7天，每48–72小时更换一次培养基。
注意：根据 Wunderli、Blache 和 Snedeker 提供的建议，不推荐在培养基中添加血清，如胎牛血清⁵⁷简而言之，无血清条件更能代表肌腱内无血管、营养匮乏的微环境体内此外，在特定培养条件下，血清补充可能促进组织降解。⁷⁵ 并促进细胞增殖和迁移出组织，这两者均为肌腱病变的特征⁵⁷.
对于未加负载组，每个外植体在70 mL培养基中进行培养。对于基础张力组和静态撞击组，每个平台需要约125 mL培养基以保持肢体完全浸没。该体积可能因大腿在夹具中的位置以及3D打印参数（主要是填充密度）而有所变化。

2. 外植体解剖及地塞米松预处理

通过吸入 CO₂ 并辅以颈椎脱位处死小鼠，或根据机构指南进行操作。本方案使用年龄小于 1 年的 C57BL/6 小鼠。后肢尺寸随年龄增长而增大，可能难以适配夹具。
在解剖前，于无菌生物安全柜（BSC）中将 70 mL 预热至 37 °C 的培养基转移至直径 100 mm、高 25 mm 的培养皿中。加入地塞米松，使其工作浓度达到 100 nM。
解剖可在实验台面上进行，使用吸水垫衬底，并在将后肢组织块转移至 BSC 前迅速完成解剖操作。准备本解剖所需的手术器械，包括平头直型精细镊子、带锯齿的直型精细镊子以及直型锋利精细剪刀。
为获取后肢组织块，将小鼠仰卧放置，定位髋关节。使用精细剪刀在大腿近端和前侧（头侧）皮肤上做一个 5–10 mm 的小切口。
拉开切口以扩大暴露区域，用手指捏住暴露的大腿部分，小心向远端牵拉皮肤，使后肢从踝关节水平完全脱套。轻柔地将剪刀一侧刀片插入足背侧皮下，沿足背剪开至脚趾。继续向远端牵拉皮肤，彻底去除。
调整小鼠体位，以便观察跟腱在踝关节附近跟骨后侧（尾侧）的附着点。在跟腱附着点近端，跖肌腱紧邻跟腱内侧边界，沿跟骨后方斜向远端延伸至足底。
为分离跖肌腱，小心将平头精细镊子的一侧尖端插入两条肌腱之间，向内侧伸入并滑至跖肌腱下方。将镊尖向近端拉动，撕离跖肌。使用带锯齿的精细镊子夹住已游离的跖肌腱近端，向远端牵拉以完整取出。
在髋关节处，使用精细剪刀剪断骨盆，分离后肢。用剪刀撬下残留的骨盆组织，暴露股骨头。
将后肢组织块转移至 BSC 内含地塞米松培养基的培养皿中。将培养皿放入培养箱，预处理 48 小时。

3. 外植体培养与加载平台

当48小时预处理结束时，预热足量的培养基（第1节）。此后，培养基中不再添加地塞米松。此时，可将预处理组（第0天）的肢体样本进行固定、脱钙，并包埋于石蜡中，以备后续切片、染色和分析。
对于未加载组，吸除预处理培养基，将组织块转移至新的培养皿中，每皿加入70 mL新鲜培养基，然后放回培养箱。
对于基础张力组和静态嵌压组，准备组织块承载平台。裁剪与夹具压板尺寸相近的砂纸片。对于静态嵌压组，剪取约18英寸长的编织线，并在线段中点处预先打一个松散的单结。撕取铝箔覆盖每个亚克力浴槽，并用70%乙醇（EtOH）喷洒消毒。将上述准备好的装置转移至生物安全柜（BSC）中。
每个平台包括一个亚克力浴槽、底座、体积减少插入件、夹片和夹具。每个夹具包含两个压板及三种不同类型的螺丝：一枚M5 × 0.8 mm螺纹 × 10 mm长的螺丝用于将夹具固定在底座上；两枚M6 × 1 mm螺纹 × 20 mm长的螺丝用于推动压板以夹紧组织；四枚M3 × 0.5 mm螺纹 × 14 mm长的螺丝配合四个压缩弹簧，使压板回缩从而打开夹具。
将所有组件放入可容纳泄漏培养基的次级容器中，浸入浓度≥10%的次氯酸钠溶液中浸泡至少1小时。用自来水冲洗干净（必要时进行高压灭菌），然后转移至生物安全柜中。
注意：若出现污染问题，可考虑对所有自来水进行高压灭菌或使用纯化水。有关应对污染的更多建议，请参见讨论部分。
使用M3螺丝和压缩弹簧将压板安装到夹具上，用M5螺丝将夹具固定在底座上，并插入M6螺丝使其与压板接触。使用双面胶将砂纸粘附于压板表面，然后闭合夹具以促进砂纸牢固粘贴。对所有平台重复此操作。
准备加载平台时，先完全打开夹具，用镊子将大腿和膝关节置于压板之间，使跟腱浅面朝上（图1A），然后轻轻闭合夹具以初步固定。
用镊子夹住暴露的股骨头或足部，边缓慢闭合夹具边调整膝关节屈曲角度以确保位置稳定。对于基础张力组，按前述方法伸展膝关节；当夹具在膝关节伸展状态下收紧时，踝关节应自然伸展。对于静态嵌压组，则按前述方法在夹具间屈曲膝关节。
对于静态嵌压组，将绳结套在远端足掌周围并拉紧。将绳子穿过底座下方组织块位置处的槽口，再穿过夹片孔。将底座放入亚克力浴槽中，并将夹片固定在浴槽顶部边缘（图1A）。
拉动绳子使足部背屈至至少110°（相对于胫骨），并用永久性记号笔在绳子穿过夹片处做标记。拍摄此时组织块的照片，以便后续量化背屈角度（图1A）。
取下底座，沿底座轨道滑入体积减少插入件。将已连接插入件的底座重新放回亚克力浴槽中，并将夹片重新固定在浴槽顶部边缘。根据标记拉动绳子，恢复至原始背屈角度，并用胶带将绳子固定在浴槽外侧，以维持静态背屈状态。
对于基础张力组，在组织块就位后，直接将带有体积减少插入件的底座放入亚克力浴槽中，并拍摄照片用于背屈角度的量化。
向每个平台中加入125 mL预热至37 °C的培养基，完全浸没组织块。用铝箔覆盖浴槽顶部，放入次级容器后转移至培养箱中。继续培养7天，每48–72小时更换一次培养基。
注意：在浴槽顶部横贴胶带可防止聚乳酸（PLA）部件漂浮。

4. 固定、脱钙与石蜡包埋

外植体培养后，使用剪刀修剪趾甲或远端脚趾，并切除跟腱肌腱结合部近端的上部腿部组织。将每只修整后的踝关节放入内衬泡沫活检垫的处理盒中。将踝关节推入盒角，使其保持约90°背屈位置，然后合上盒盖固定。
用10%中性缓冲福尔马林（NBF）固定3天，随后在pH值调至7.4–7.6（用冰醋酸调节）的含14%乙二胺四乙酸（EDTA）的蒸馏水（diH₂O）中脱钙2周。
为去除盐分，先将样本在1×磷酸盐缓冲液（PBS）中彻底冲洗3次，每次5分钟，再用diH₂O冲洗3次，每次5分钟。按常规进行石蜡组织学样本处理：梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡浸润。将样本定向包埋，以获得经跟腱由内侧至外侧走向的矢状切面，具体方法见下文第5节（图1B）。

5. 组织切片

使用切片机小心修整样本，直至切面与包埋块表面平行。从关节内侧大致修整踝关节样本，直至接近跟腱止点内侧边界前停止。
将样本转移至冰块上以调节温度和湿度，并更换刀片（或切换至当前刀片的新刃口区域）。继续以 10 µm 厚度对样本进行切片，并在明场显微镜下仔细辨认进入跟腱止点的位置。一旦确定位置，即开始连续切片，并记录切片编号（即组织深度），贯穿整个跟腱止点区域。

6. 脱蜡/复水及切片选择

针对以下每项检测，从每对对侧肢体中选取水平匹配的组织切片。染色前，将切片置于载玻片架上，依次经过3次二甲苯、2次100%乙醇、2次95%乙醇和1次70%乙醇处理，每次5分钟。最后在去离子水（diH₂O）中完成再水化。

7. 通过TUNEL评估跟腱活力

进行TUNEL染色时，按照试剂盒制造商的说明书操作。在室温下用20 µg/mL蛋白酶K孵育20分钟，然后用去离子水（diH₂O）冲洗。加入50 µL TUNEL染色液（含5 µL酶溶液和45 µL标记溶液），在37 °C孵育1小时。用去离子水（diH₂O）冲洗。使用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片。
使用配备4倍物镜的荧光显微镜对跟腱止点进行成像。应包括DAPI通道（激发/发射波长 = 360/460 nm）以显示所有细胞核，TUNEL（TMR Red）通道（激发/发射波长 = 540/580 nm）以显示凋亡细胞核，如有可能，还包括明场通道。
进行图像分析时，将图像导入适用于基于感兴趣区域（ROI）处理的图像分析软件，例如FIJI/ImageJ或MATLAB。定义一个感兴趣区域（ROI），勾画出视野中整个跟腱的轮廓（图2A），但需排除腱外膜中的细胞，这些细胞在解剖过程中以及组织被置于培养环境时因环境条件突然改变而极易发生死亡。
为此，在MATLAB中导入明场图像，并使用drawpolygon()函数绘制并封闭跟腱边界，完成ROI的选择。MATLAB将为该ROI创建一个多边形对象，随后可将其应用于DAPI和TUNEL通道图像，通过createMask()函数屏蔽ROI以外的像素强度数据，从而仅分析跟腱内部的细胞核。
导入DAPI和TUNEL通道图像，并通过将荧光强度归一化至在组织切片中偶然捕获的非活性组织（如骨、肌肉或脂肪）中凋亡细胞核的最大荧光强度，确定用于定义凋亡细胞核（TUNEL+）的荧光强度阈值。图像经掩膜处理后，计算跟腱内凋亡细胞核所占比例（TUNEL+细胞核数 / DAPI细胞核数）。

8. 通过甲苯胺蓝组织学染色表征纤维软骨形成

一旦重悬（第6节），将来自对侧配对外植体的水平匹配组织切片的载玻片架转移至含0.4% w/v 甲苯胺蓝O的0.1 M 醋酸钠缓冲液中（用冰醋酸调节pH至4.0）。室温孵育10分钟，随后用去离子水冲洗3次₂O，每次30秒。
通过三次95%乙醇和两次100%乙醇脱水，每次30秒。经三次二甲苯透明，每次1分钟。用二甲苯基底封片介质封片。
获取跟腱止点的24位红-绿-蓝（RGB）彩色图像。例如，在本方案中，使用适配器将数码彩色相机连接至配备4倍物镜的简易明场显微镜目镜。
量化压缩性肌腱软骨（CTF）中甲苯胺蓝染色的差异¹⁶ 在跟腱止点处（图3A，B），将RGB图像导入能够定义和管理多个感兴趣区域（ROI）的图像分析软件中。可选工具包括FIJI/ImageJ中的选择工具和ROI管理器，或MATLAB中的图像处理工具箱。首先设置像素/长度比例尺。
注意：软件选择由研究人员自行决定，并不仅限于 MATLAB 或 FIJI/ImageJ。作者已提供 MATLAB 代码（补充文件 2），描述实施过程的文档（补充文件 3），以及一个样本图像（补充文件 4）。我们鼓励研究人员根据需要或偏好将此代码翻译成其他编程语言，以便在其他软件中使用。
在所选软件中显示图像后，确定跟腱深部边界与跟骨的交界处。从此处开始向近端追踪 800 µm 沿着深部肌腱边界以确定 CTF 的深部边界。例如，使用 MATLAB 中的 drawpolyline() 函数在 RGB 图像上交互式绘制折线。MATLAB 将创建一个包含该折线顶点的 Polyline 对象，该对象可被进一步处理并裁剪至指定长度 800 µm.
从此位置出发，通过绘制一条与局部纤维走向垂直并连接至浅层肌腱边界的线段，以确定CTF的近端边界。
回到深部肌腱边界与跟骨的交界处，通过绘制一条线段连接至浅表肌腱边界，从而界定CTF的远端边界，该线段应沿明确的潮线（tidemark）绘制，此潮线将CTF与附着区纤维软骨（AZF）分隔开来。¹⁶ (图3A，B最后，通过追踪浅层肌腱边界并将其闭合，生成CTF的浅层边界。
为描述插入区中GAG染色的空间变化，将总CTF分为4个象限（图3A，B）。连接深部与浅层CTF边界的中点，形成一条线段，作为远端/近端边界。通过该边界中点，沿纤维走向连接远端与近端CTF边界的中点，形成浅层/深部边界。
这6个边界提供的信息可用于定义代表整个CTF的感兴趣区域（ROI），以及将CTF划分为4个象限的子区域。例如，在MATLAB中，可将定义各独立ROI（CTF及第1–4象限）边界的顶点编译为向量，并使用images.roi.Polygon()为每个ROI生成封闭的多边形对象。
定义感兴趣区域（ROIs）后，使用 FIJI 中的颜色转换插件、MATLAB 中的 rgb2hsv() 函数，或其他应用适当转换方程的软件，将 RGB 像素数据转换为色调-饱和度-明度（HSV）颜色空间⁷⁶随后可将 HSV 数据投影到二维色调-饱和度空间，其中每种色调与饱和度的组合对应一种特定颜色（图3C).
在每个感兴趣区域（ROI）内，计算描述该区域内平均染色颜色的平均色调和饱和度。例如，在 MATLAB 中，可通过使用定义每个 ROI 的多边形对象，调用 createMask() 函数对图像进行掩膜处理，从而专门分析各 ROI 内的色调-饱和度像素数据。
在骨膜纤维软骨（PF）内定义另一个较小的感兴趣区域¹⁶ (图 3A，B）并计算平均色调与饱和度。然后，计算CTF中每个ROI的平均颜色与PF对应颜色之间的欧氏距离（图3C).

注意：欧氏距离计算用于描述感兴趣区域（ROI）的平均颜色与PF（一种典型的纤维软骨组织）平均颜色之间的相似程度¹⁶^,¹⁷^,⁷⁷较小的欧氏距离表明该感兴趣区域（ROI）的颜色更接近纤维软骨外观。
利用该距离计算纤维软骨评分，当感兴趣区域（ROI）颜色与PF颜色完全相同时，评分为最大值1；当ROI颜色与PF颜色在色调-饱和度色彩空间中达到最大分离时，评分为最小值-1。
对每条肢体各组织切片中每个ROI内的色调、饱和度和纤维软骨评分取平均值。对同体对侧肢体组之间进行配对统计学比较。

9. 利用SHG成像研究胶原网络结构的变化

使用配备20倍物镜的合适显微镜系统，对甲苯胺蓝染色切片进行二次谐波成像（SHG），获取贯穿跟腱止点组织厚度的z轴层扫图像，并根据需要进行拼接扫描，以完整覆盖跟腱止点区域。
将SHG图像导入首选的图像分析软件，并参照第8节中甲苯胺蓝图像分析的方法，在跟腱止点处定义包含并细分跟腱止点纤维软骨区（CTF）的感兴趣区域（ROI）（图4A、B）。
若将SHG图像导入MATLAB，请采用第8节所述的MATLAB中定义CTF感兴趣区域（ROI）的方法。定义ROI后，通过将ROI顶点从MATLAB导出为.txt文件，并使用FIJI中的文件 > 导入 > XY坐标功能导入，将ROI坐标转移至FIJI。叠加所选区域并发送至ROI管理器以进行后续分析。
为量化胶原排列情况，使用FIJI中的Directionality插件，该插件通过对ROI内多个小窗口进行傅里叶频谱分析，计算纤维取向分布。该分布的离散程度（即“分散度”）与纤维排列的有序性呈负相关。
注意：由于跟腱整体曲率的影响，CTF不同窗口中的胶原纤维可能呈现不同的取向，而非真正缺乏排列或组织性。为了更准确地区分胶原组织结构变化与止点处跟腱整体曲率的影响，有必要定义更小的感兴趣区域（ROI）。
将SHG图像导入FIJI并设置像素/长度比例尺。将最大像素强度数据投影为一幅二维合成图像，并将ROI添加至ROI管理器。依次将每个CTF的ROI叠加到图像上，并在每个ROI内绘制10个大小一致的小型子ROI（sub-ROI），并将这些子ROI添加至ROI管理器。
在每个子ROI内运行FIJI的Directionality插件以计算纤维分散度。对每个CTF ROI内的所有子ROI的分散度数据取平均值，并进一步对来自同一离体样本各切片的CTF ROI分散度数据进行平均。对同体对侧肢体组间进行配对统计学比较。

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结果

TUNEL染色组织切片的代表性图像显示，在不同实验组中，跟腱组织经过7天离体培养后，其内部的凋亡细胞核极少（图2A）。对这些图像进行定量分析表明，在不同力学加载条件下，该组织培养方案在离体培养7天后仍可维持跟腱组织平均高达78%的细胞活力（图2B）。

定性来看，与未加负载的对照组相比，静态撞击7天后甲苯胺蓝染色增强（图3A，B），尤其在邻近跟骨的深层象限区域更为明显，该区域正是我们先前测得横向压缩应变最大的位置⁵^,⁶。对这些甲苯胺蓝染色的组织切片进行定量分析表明，与对侧未加负载的离体样本相比，静态撞击7天后色相（图3D）、饱和度（图3E）...

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讨论

本研究所描述的实验性小鼠后肢离体培养平台结合组织培养方案，为研究跟腱止点处由机械撞击驱动的纤维软骨形成的力学生物学提供了一个合适的模型。通过代表性实验结果展示了该离体模型的有效性，结果显示在持续7天的静态撞击后，细胞活力得以维持，同时甲苯胺蓝染色出现显著且空间分布不均的变化。这些发现提示，机械撞击继发导致富含糖胺聚糖（GAG）的基质分子代谢发生改变，这与其他模型及临床研究结果一致³^,⁴^,⁹^,¹³^,²³^,²⁵^,²⁸^,²⁹^,³⁰^,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢罗切斯特大学肌肉骨骼研究中心组织学、生物化学与分子成像（HBMI）核心实验室的 Jeff Fox 和 Vidya Venkatramani 提供的支持与协助，该核心实验室部分由 P30AR06965 项目资助。此外，作者还感谢罗切斯特大学医学中心光显微镜与纳米成像中心（CALMN）在多光子显微镜技术方面提供的帮助。本研究由 R01 AR070765 和 R01 AR070765-04S1，以及 1R35GM147054 和 1R01AR082349 项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
吸水垫	VWR	82020-845	用于实验台解剖
丙烯酸浴槽	Source One	X001G46CB1	用于容纳浸没在培养基中的组织外植体平台
高压灭菌桶	Thermo Scientific	13-361-20	用作二级 containment，可容纳两个平台
底座	-	-	根据作为补充文件提供的CAD文件进行3D打印
编织线	KastKing	30lb test	用于缠绕足部并施加踝关节背屈
夹子	-	-	根据作为补充文件提供的CAD文件进行3D打印
盖玻片	Fisherbrand	12-541-034	矩形，No. 2，50 mm × 24 mm
Cytoseal XYL	VWR	8312-4	以二甲苯为基础的封片介质，用于甲苯胺蓝染色组织切片的封片
地塞米松	MP Biomedical LLC	194561	CAS#50-02-2
无水二甲基亚砜（DMSO）	Invitrogen by ThermoFisher	D12345	CAS#67-68-5，用于将地塞米松溶解为高浓度储备液
双面胶带	Scotch Brand	34-8724-5195-9	用于将砂纸固定在夹具压板上
杜尔贝科改良伊格尔培养基（1X DMEM）	Gibco by ThermoFisher	11965092	高葡萄糖，不含丙酮酸钠，含谷氨酰胺
乙二胺四乙酸四钠盐二水合物	Thermo Scientific Chemicals	J15700.A1	CAS#10378-23-1，用于配制14% EDTA溶液以进行样本脱钙
乙醇，200 proof	Thermo Scientific	T038181000	CAS#64-17-5，1 L装
泡沫活检垫	Leica	3801000	与处理盒配合使用，在固定和脱钙过程中帮助保持踝关节处于所需位置
镊子，#SS Standard Inox	Dumont	11203-23	直头，光滑，细尖端
镊子，Micro-Adson 4.75"	Fisherbrand	13-820-073	直头，细尖端带锯齿
石榴石砂纸，50-D 粒度	Norton	M600060 01518	或其他粗粒度砂纸
冰醋酸	Fisher Chemical	A38S-500	CAS#64-19-7，用于调节甲苯胺蓝组织学所用的醋酸钠缓冲液以及14% EDTA脱钙溶液的pH值
夹具	ADMET	GV-100NT-A4	包含协议中描述的不锈钢台钳夹具、螺丝和弹簧
Histobond 黏附性载玻片	VWR	16005-108	后肢外植体的矢状切片在所有染色流程中均能可靠地黏附于这些载玻片上
原位细胞死亡检测试剂盒，TMR Red	Roche	12156792910	TUNEL检测
标签胶带	Fisherbrand	15-959	或任何其他偏好的标签胶带
L-抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A4544-100G	CAS#50-81-7，用于培养基配制
中性缓冲福尔马林，10%	Leica	3800600	用于样本固定，5加仑装
Nunc 培养皿	Sigma-Aldrich	P7741-1CS	直径100 mm × 高25 mm，按协议描述在70 mL培养基中保持外植体浸没状态
青霉素-链霉素（100X）	Gibco by ThermoFisher	15140122	每500 mL 1X DMEM中加入5 mL，得到1% v/v（1X）工作浓度
聚乳酸（PLA）1.75 mm线材	Hatchbox	-	选择与您的3D打印机挤出机兼容的线材直径，颜色可自选
组织处理盒	Leica	3802631	用于固定、脱钙和石蜡包埋
含DAPI的Prolong Gold抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen by ThermoFisher	P36931	TUNEL染色后组织切片的封片介质
蛋白酶K	Fisher BioReagents	BP1700-50	CAS#39450-01-6，用于TUNEL协议中的抗原修复
精细剪刀	FST	14094-11	直头，锋利
12孔载玻片染色套装	Mercedes Scientific	MER 1011	含12个染色缸和载玻片架，用于甲苯胺蓝组织学染色
无水乙酸钠	Thermo Scientific Chemicals	A1318430	CAS#127-09-3，用于配制甲苯胺蓝组织学染色缓冲液
Tissue-Tek Accu-Edge 低剖面切片机刀片	VWR	25608-964	用于石蜡切片
甲苯胺蓝O	Thermo Scientific Chemicals	348601000	CAS#92-31-9
体积减少插件	-	-	根据作为补充文件提供的CAD文件进行3D打印
二甲苯	Leica	3803665	4加仑装，用于组织学染色

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