用于研究跟腱撞击力学生物学的小鼠后肢离体模型

摘要

我们介绍一种定制的实验平台和组织培养方案，该方案可重现由跟腱止点撞击引起的纤维软骨变性，同时在小鼠后肢离体组织中维持细胞长期存活，为探索腱组织撞击的力学生物学机制提供了一个合适的模型。

摘要

肌腱在骨面上的挤压会产生一种多轴力学应变环境，其中横向压缩应变显著升高，从而引发局部纤维软骨表型，其特征为富含糖胺聚糖（GAG）的基质积聚以及胶原网络的重塑。尽管纤维软骨是健康肌腱受挤压区域的正常结构特征，但GAG过度沉积和胶原网络紊乱却是肌腱病的典型病理表现。因此，临床上已将挤压视为肌腱病发生与发展的重要外在因素。然而，肌腱挤压背后的力学生物学机制仍研究不足。以往探究肌腱挤压过程中细胞反应的研究，多采用对细胞或离体肌腱组织施加单轴压缩载荷的方法。 体外然而，分离的细胞缺乏对力学响应至关重要的三维细胞外环境，且两者 体外 且外植体研究无法重现肌腱撞击所产生的多轴应变环境 体内，这取决于受压区域的解剖学特征。此外， 体内 肌腱撞击模型难以控制机械应变环境。为克服这些局限性，我们提出一种新型的小鼠后肢离体模型，适用于研究跟腱撞击的力学生物学机制。该模型可维持跟腱 原位 以保留局部解剖结构，并在被动施加踝关节背屈时，重现跟腱止点与跟骨撞击所产生的多轴应变环境，同时使细胞保持在其原始微环境中。我们描述了该模型所必需的组织培养方案，并提供了数据证明离体组织在7天内维持持续的活性。代表性结果表明，由于撞击作用，糖胺聚糖（GAG）组织学染色增强，胶原纤维排列减少，提示纤维软骨形成增加。该模型可轻松用于研究不同的力学加载方案，并允许调控特定分子通路，以鉴定跟腱在撞击刺激下发生表型改变的潜在机制。

引言

多种肌腱（包括跟腱和肩袖肌腱）由于正常的解剖位置关系，会受到骨性撞击的影响^1,2,3,4。肌腱撞击会产生垂直于肌腱纤维纵轴的横向压缩应变^5,6,7。在发生肌腱撞击的区域，会出现一种独特的纤维软骨表型，其特征是细胞体积缩小、呈圆形（即纤维软骨细胞），嵌于结构紊乱的胶原网络中，且糖胺聚糖（GAG）含量显著增加^{2,3,4,8,9,10,11,12,}<....

方案

所有动物实验均已获得罗切斯特大学动物资源委员会的批准。

1. 组织培养基的制备

1. 将所有外植体置于含1% v/v 青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（1x DMEM）中培养，并 200 µM L-抗坏血酸在培养箱中 37 °C 和 5% CO₂在最初的48小时预处理期间，将每个外植体培养于70 mL添加了100 nM地塞米松的培养基中⁷⁴预处理后，在不含地塞米松的培养基中继续培养肢体7天，每48–72小时更换一次培养基。
   注意：根据 Wunderli、Blache 和 Snedeker 提供的建议，不推荐在培养基中添加血清，如胎牛血清⁵⁷简而言之，无血清条件更能代表肌腱内无血管、营养匮乏的微环境 体内此外，在特定培养条件下，血清补充可能促进组织降解。⁷⁵ 并促进细胞增殖和迁移出组织，这两者均为肌腱病变的特征⁵⁷.
2. 对于未加负载组，每个外植体在70 mL培养基中进行培养。对于基础张力组和静态撞击组，每个平台需要约125 mL培养基以保持肢体完全浸没。该体积可能因大腿在夹具中的位置以及3D打印参数（主要是填充密度）而有所变化。

结果

TUNEL染色组织切片的代表性图像显示，在不同实验组中，跟腱组织经过7天离体培养后，其内部的凋亡细胞核极少（图2A）。对这些图像进行定量分析表明，在不同力学加载条件下，该组织培养方案在离体培养7天后仍可维持跟腱组织平均高达78%的细胞活力（图2B）。

定性来看，与未加负载的对照组相比，静态撞击7天后甲苯胺蓝染色增强（图3A，B），尤其在邻近跟骨的深层象限区域更为明显，该区域正是我们先前测得横向压缩应变最大的位置^5,6。对这些甲苯胺蓝染色的组织切片进行定量分析表明，与对侧未加负载的离体样本相比，静态撞击7天后色相（图3D）、饱和度（图3E）.......

讨论

本研究所描述的实验性小鼠后肢离体培养平台结合组织培养方案，为研究跟腱止点处由机械撞击驱动的纤维软骨形成的力学生物学提供了一个合适的模型。通过代表性实验结果展示了该离体模型的有效性，结果显示在持续7天的静态撞击后，细胞活力得以维持，同时甲苯胺蓝染色出现显著且空间分布不均的变化。这些发现提示，机械撞击继发导致富含糖胺聚糖（GAG）的基质分子代谢发生改变，这与其他模型及临床研究结果一致^{3,4,9,13,23,25,28,29,30,}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
吸水垫	VWR	82020-845	用于实验台解剖
丙烯酸浴槽	Source One	X001G46CB1	用于容纳浸没在培养基中的组织外植体平台
高压灭菌桶	Thermo Scientific	13-361-20	用作二级 containment，可容纳两个平台
底座	-	-	根据作为补充文件提供的CAD文件进行3D打印
编织线	KastKing	30lb test	用于缠绕足部并施加踝关节背屈
夹子	-	-	根据作为补充文件提供的CAD文件进行3D打印
盖玻片	Fisherbrand	12-541-034	矩形，No. 2，50 mm × 24 mm
Cytoseal XYL	VWR	8312-4	以二甲苯为基础的封片介质，用于甲苯胺蓝染色组织切片的封片
地塞米松	MP Biomedical LLC	194561	CAS#50-02-2
无水二甲基亚砜（DMSO）	Invitrogen by ThermoFisher	D12345	CAS#67-68-5，用于将地塞米松溶解为高浓度储备液
双面胶带	Scotch Brand	34-8724-5195-9	用于将砂纸固定在夹具压板上
杜尔贝科改良伊格尔培养基（1X DMEM）	Gibco by ThermoFisher	11965092	高葡萄糖，不含丙酮酸钠，含谷氨酰胺
乙二胺四乙酸四钠盐二水合物	Thermo Scientific Chemicals	J15700.A1	CAS#10378-23-1，用于配制14% EDTA溶液以进行样本脱钙
乙醇，200 proof	Thermo Scientific	T038181000	CAS#64-17-5，1 L装
泡沫活检垫	Leica	3801000	与处理盒配合使用，在固定和脱钙过程中帮助保持踝关节处于所需位置
镊子，#SS Standard Inox	Dumont	11203-23	直头，光滑，细尖端
镊子，Micro-Adson 4.75"	Fisherbrand	13-820-073	直头，细尖端带锯齿
石榴石砂纸，50-D 粒度	Norton	M600060 01518	或其他粗粒度砂纸
冰醋酸	Fisher Chemical	A38S-500	CAS#64-19-7，用于调节甲苯胺蓝组织学所用的醋酸钠缓冲液以及14% EDTA脱钙溶液的pH值
夹具	ADMET	GV-100NT-A4	包含协议中描述的不锈钢台钳夹具、螺丝和弹簧
Histobond 黏附性载玻片	VWR	16005-108	后肢外植体的矢状切片在所有染色流程中均能可靠地黏附于这些载玻片上
原位细胞死亡检测试剂盒，TMR Red	Roche	12156792910	TUNEL检测
标签胶带	Fisherbrand	15-959	或任何其他偏好的标签胶带
L-抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A4544-100G	CAS#50-81-7，用于培养基配制
中性缓冲福尔马林，10%	Leica	3800600	用于样本固定，5加仑装
Nunc 培养皿	Sigma-Aldrich	P7741-1CS	直径100 mm × 高25 mm，按协议描述在70 mL培养基中保持外植体浸没状态
青霉素-链霉素（100X）	Gibco by ThermoFisher	15140122	每500 mL 1X DMEM中加入5 mL，得到1% v/v（1X）工作浓度
聚乳酸（PLA）1.75 mm线材	Hatchbox	-	选择与您的3D打印机挤出机兼容的线材直径，颜色可自选
组织处理盒	Leica	3802631	用于固定、脱钙和石蜡包埋
含DAPI的Prolong Gold抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen by ThermoFisher	P36931	TUNEL染色后组织切片的封片介质
蛋白酶K	Fisher BioReagents	BP1700-50	CAS#39450-01-6，用于TUNEL协议中的抗原修复
精细剪刀	FST	14094-11	直头，锋利
12孔载玻片染色套装	Mercedes Scientific	MER 1011	含12个染色缸和载玻片架，用于甲苯胺蓝组织学染色
无水乙酸钠	Thermo Scientific Chemicals	A1318430	CAS#127-09-3，用于配制甲苯胺蓝组织学染色缓冲液
Tissue-Tek Accu-Edge 低剖面切片机刀片	VWR	25608-964	用于石蜡切片
甲苯胺蓝O	Thermo Scientific Chemicals	348601000	CAS#92-31-9
体积减少插件	-	-	根据作为补充文件提供的CAD文件进行3D打印
二甲苯	Leica	3803665	4加仑装，用于组织学染色