本方案介绍了一种用于在大鼠跟腱中诱导可量化且可控的疲劳性损伤的测试系统，以建立一种由过度使用引起的跟腱病的体内模型。该操作包括将大鼠踝关节固定于一个关节驱动装置上，通过自行编写的MATLAB脚本控制装置对踝关节进行被动背屈运动。
本文内容
摘要
摘要
跟腱病是一种慢性肌腱疾病，会导致疼痛和功能丧失，其病因是肌腱反复超负荷以及恢复时间不足。本方案描述了一种通过被动背屈向大鼠跟腱周期性施加机械负荷的测试系统。自主编写的代码包含循环加载前后的测量步骤，用于评估加载方案的效果，同时包含基于反馈控制的循环疲劳加载程序。
本研究使用了25只Sprague-Dawley大鼠，每组5只，分别接受500、1,000、2,000、3,600或7,200次疲劳载荷。计算了滞后环、峰值应力以及加载和卸载模量在循环载荷前后测量值的百分比差异。结果表明，该系统可根据施加载荷次数的不同，在跟腱上诱导出不同程度的损伤。该系统提供了一种创新方法，可对跟腱施加定量且生理范围内的不同强度循环载荷，用于 体内 疲劳诱导的过度使用性肌腱损伤模型。
引言
由于肌腱连接肌肉与骨骼，并在其整个生命周期中经历日常重复性运动，因此极易发生过度使用性损伤，这类损伤具有疼痛性和限制性，会导致机械功能受损，影响30%-50%的人群1。肌腱病是一种慢性疾病，被认为是由于重复性疲劳运动以及未能充分恢复至伤前水平所导致的过度使用性损伤。上肢和下肢均常受累，包括肩袖、肘部、跟腱和髌腱2,3,4,5。跟腱病常见于涉及跑步和跳跃的活动中，尤其多见于田径、中长跑、网球及其他球类运动项目的运动员，影响约7%-9%的跑步者6,7。跑步和跳跃造成的损伤还可能导致踝关节背屈受限，而这一情况是跟腱和髌腱肌腱病的危险因素8,9,10。因此，亟需更准确地评估和表征肌腱病，本研究通过建立被动踝关节背屈的大鼠模型，为过度使用性跟腱损伤提供研究基础。
既往利用小型动物模型的研究旨在探讨跟腱病的发生发展及其生物标志物。这些方法包括跑步机运动、重复性抓取动作、直接肌腱负荷、胶原酶注射、手术干预以及 体外 研究11,12,13,14,15,16尽管现有文献通过使用这些肌腱病模型识别出了损伤标志物，但仍存在若干局限性，例如：直接对肌腱施加负荷时采用了非生理相关的关节运动，跑步机实验中未直接测量施加的负荷，以及如胶原酶注射等方法未采用生理性的过度使用机制等。为此，本研究旨在开发一种可对跟腱非侵入性施加量化负荷的系统，用于过度使用诱导型肌腱病研究，以弥补既往小型动物肌腱病模型的不足。我们开展了一项初步研究，以证明该系统在不同加载周期下可诱导肌腱力学性能产生可重复的变化。该系统能够实现生理相关的运动与负荷，以诱导过度使用状态，同时在加载过程中对肌腱所承受及经历的力进行量化与测量。
方案
本研究经贝斯以色列女执事医疗中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准后进行。动物麻醉采用5%异氟烷诱导，2.5%异氟烷维持，同时注意避免低体温。
1. 设置测试系统
- 通过步进电机控制被动踝关节旋转，以施加一致的旋转角度和扭矩。使用微控制器控制步进电机。利用三维位置与方向系统的输入信号标记旋转角度。若未达到预设阈值，则根据扭矩传感器的输出信号进行反馈控制，进一步增加背屈角度。
- 开始前，将微控制器、扭矩传感器、三维电磁定位与方向系统连接至计算机和电源。使用实验室自主开发的 MATLAB 程序控制该定制系统（图1）。从 GitHub 下载 MATLAB 代码文件，并按照 GitHub 页面上的说明运行程序（https://github.com/Nazarian-Lab/PassiveAnkleDorsiflexionSystem）。
- 使用代码文件打开 MATLAB。打开 PDImfc 软件，以将三维电磁定位与方向系统连接至 MATLAB 程序。点击 Connect | Continuous P&O | StartSockExport()。保持该应用程序在后台运行。
2. 离体与死后
- 通过吸入 CO2 并结合胸腔切开术作为二次安乐死方法，处死六只 13 周龄的 Sprague-Dawley 大鼠。完整保留跟骨及肌腱连接处，解剖右侧跟腱。在 -20°C 下冷冻，以便后续进行力学测试。待肌腱解冻、精细解剖并准备就绪后，进行拉伸至断裂测试，以获得肌腱的极限抗拉强度（UTS）（预加载至 0.1 N，预循环 10 次，从 0.1 至 1 N，以 0.1 mm/s 的恒定位移速率加载至断裂）。将 UTS 的 15% 作为系统输入，用于后续步骤中的预循环处理，如步骤 3.4 所述。
- 采用相同程序处死另一组五只动物，用于力臂和应变测量。将左腿踝关节置于 90° 背屈位置，并在旁放置标尺作为参考，进行 X 光成像。在 Fiji 软件中打开 X 光图像，利用图像中的标尺作为参考，测量从踝关节旋转中心到踝后部的肌腱力臂，该数值将作为 MATLAB 代码的输入，用于将步骤 2.1 中所述的预循环输入力转换为相应的扭矩值，并在数据分析中实现输出扭矩与力之间的转换。
- 通过在左后肢固定两根夹板，使膝关节处于完全伸展状态，以实现固定。轻柔地推动脚趾进行背屈，确保踝关节的旋转仅由肌腱独立引起，而不涉及周围软组织，并确保肌腱处于张力状态。若未处于张力状态或膝关节发生移动，需重新固定夹板。
- 去除跟腱周围皮肤以暴露肌腱。在直径 1/32 英寸的铝珠上涂抹胶水，将其粘附于靠近跟腱肌腱连接处的游离端，并用蘸有生理盐水的棉签清除多余胶水。在整个后续操作过程中，反复向跟腱施加生理盐水，以保持组织湿润。
- 在施加任何载荷之前，使用数显卡尺测量肌腱的横截面积。假设肌腱为椭圆形，重复三次测量其宽度和厚度。
- 将大鼠以俯卧位放置于全身平台上。使用扎带围绕踝部和脚趾将踝关节固定在关节驱动器上，并使用两根扎带固定膝部夹板。旋转轴杆，使踝关节处于完全跖屈位置。
- 将 3D 电磁定位与方向系统的数字化笔连接至计算机，并打开电源。
- 运行系统代码（在步骤 3 中进一步详细描述），执行指定次数的循环（本研究中，六只已处死的大鼠均接受 7,200 次循环）。
- 在离体应变测量的 0、500、1,000、2,000、3,600 和 7,200 次循环时，暂停循环加载程序，使用 3D 数字化笔以背屈 0° 至 40°（受限于系统物理结构的最大驱动范围）每隔 5° 测量一次从跟骨到铝珠的肌腱长度，每点重复三次，交替进行。
- 利用步骤 2.9 获得的长度数据，计算不同角度下的肌腱应变，其中每个循环次数下的初始长度为 0° 背屈时的长度。对每个循环次数下的背屈角度与应变关系进行线性拟合。利用该关系将原始角度数据转换为应变，用于数据分析。
- 在 40° 背屈时，使用数显卡尺计算肌腱横截面积，假设肌腱不可压缩（体积恒定），结合 0° 和 40° 时的肌腱长度测量值以及 0° 时测得的横截面积。将该横截面积用于各循环次数下，将力转换为应力以进行数据分析（应力 = 力 / 横截面积）。
3. 机械加载方案
- 在本研究部分，我们使用了25只11周龄的雌性Sprague-Dawley大鼠，每组随机分配5只大鼠，分别接受500、1,000、2,000、3,600或7,200次疲劳载荷处理。
注意：预处理、初始校准以及测量前后的操作共需约15分钟，而循环疲劳加载程序每个循环耗时1秒。因此，大鼠处于麻醉状态的最长时间约为2小时，该过程均在IACUC批准的实验方案下进行。 - 将微控制器、扭矩传感器、三维电磁定位与定向系统连接至计算机和电源。使用自主开发的 MATLAB 代码控制该定制系统（图1).
- 打开计算机并启动包含代码文件的 MATLAB。打开 PDImfc 软件，以将三维电磁定位与定向系统连接至 MATLAB 程序。点击 连接 | 连续 P&O | StartSockExport()保持应用程序在后台运行。
- 使用5%异氟烷通过诱导室吸入诱导麻醉。诱导完成后，将动物固定在带有水浴加热元件的全身固定平台上，并通过鼻罩持续给予2.5%异氟烷以维持麻醉状态。在麻醉期间使用湿眼膏涂抹眼睛，防止角膜干燥。
- 将大鼠以俯卧位放置在全身平台上。用一根扎带绑住踝关节，另一根扎带绑住足趾，并用两根扎带固定膝部分叉。旋转轴使踝关节处于完全跖屈位置。
注意：确保扎带不会造成束缚或损伤，收紧时需格外小心；必要时，可在扎带与皮肤之间放置纱布，以提供保护层。 - 在执行涉及运行系统代码的以下步骤时，针对每段与特定加载测试相对应的代码，在 MATLAB 中点击“运行”。
- 根据跟腱极限抗拉应力的数值，将踝关节循环运动50次，至极限抗拉应力的15% 离体 根据步骤 2.1 测量的拉伸至失效测试
- 对肌腱进行初始校准，背屈三次 12°. 利用滞后曲线加载区域中线性区段的斜率，计算该曲线的指数区段。
- 逐步背屈踝关节，角度逐渐增加，直至通过计算加载区域峰值的斜率（使用自主开发的 MATLAB 代码计算）获得曲线的指数区域，或直至达到旋转终点 40°以先发生者为准。
- 在最终获得的角度下，进行五次循环力学测量，作为预加载基线。
- 按照指定的循环次数进行疲劳载荷实验（本研究中分别为500、1,000、2,000、3,600或7,200次循环）。
- 每50个循环，计算滞后曲线加载部分的斜率（通过自主研发的MATLAB代码计算），以确保其仍处于指数区域。除非角度已达到 40° 直到达到该指数区域为止。
- 在完成循环加载方案后，在最初选定的角度下进行五次循环力学测量，作为加载后的测量，以评估肌腱的力学性能。
- 移除扎带和夹板，将动物放回恢复室。在动物未恢复足够意识之前，不得离开无人看管，待其意识恢复后，将其放回笼中。每天监测动物是否出现任何不良临床症状，若出现症状，则皮下注射布托啡诺，剂量为1.2 mg/kg，每72小时一次，或实施提前安乐死。在笼中饲养7天后，通过CO₂安乐死动物。2 吸入麻醉并辅以开胸术作为二次安乐死手段。
注意：循环加载的施加和力学测量采用本课题组先前报道的自制夹具完成，该夹具包括扭矩传感器、3D打印的踝关节驱动器和动物床、三维电磁位置与方位系统，以及驱动轴旋转以实现背屈的步进电机。17该系统由1.2步骤中提到的MATLAB脚本控制。扭矩传感器与位置和方向系统在整个系统的加载协议过程中采集扭矩和位置数据。
4. 数据分析
- 分别将测量前和测量后的数据导入 MATLAB。
- 根据步骤 2.2 中测得的力臂长度，以及步骤 2.11 中获得的指定载荷数量下测得的横截面积，利用公式（1）和（2）将扭矩转换为应力：
(1)
(2) - 根据步骤 2.10 中获得的换算关系，将角度转换为应变。
- 计算测量前和测量后循环的平均滞后环面积（加载与卸载曲线之间的面积）、峰值应力（循环中的最大应力值），以及加载和卸载模量（加载曲线最后 50% 和卸载曲线前 60% 的线性拟合结果）。
- 计算步骤 4.4 中所得的测量前后循环机械性能的百分比变化。
结果
随着应用循环次数的增加，减少程度更大 体内 肌腱力学性能。与3,600次和7,200次循环组相比，500次循环组的滞后损失以及加载和卸载模量的降低程度显著更小（p < 0.05）。 < 0.05) (图2）。尽管从500次循环组到3,600次循环组每周期的峰值应力显著降低，但500次循环组与7,200次循环组之间峰值应力的降低无显著差异。在3,600次和7,200次循环组中，滞后性、峰值应力以及加载和卸载模量均呈现一致的百分比下降。苏木精-伊红染色和Masson三色染色的肌腱样本图像证实，随着背屈循环次数的增加，微观结构损伤程度更高，表现为细胞更呈圆形、细胞增多、纤维断裂和纤维屈曲现象增多。图3). 本文结果表明，更多的背屈循环次数会导致跟腱损伤程度增加。
图1：被动踝关节背屈测试系统。（A）电源，（B）微控制器，（C）步进电机，（D）扭矩传感器，（E）三维电磁定位与方向传感器，（F）3D打印的踝关节固定装置，（G）3D打印的动物卧床，（H）3D打印的鼻锥固定器。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：典型的循环加载应力-应变曲线。 分别为 0、500、1,000、2,000、3,600 和 7,200 次循环时的滞后曲线。箭头表示随着循环次数的增加，峰值应力逐渐降低。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：肌腱样本的代表性组织学染色图像。 本研究中，对500、1,000、2,000、3,600和7,200次循环组的肌腱样本进行苏木精和伊红染色（左）以及马松三色染色（右），结果显示，随着施加循环次数的增加，细胞形态趋于圆形，出现细胞增多（星号）、纤维结构破坏以及纤维屈曲（箭头）。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本研究介绍了一种利用被动踝关节背屈系统对大鼠跟腱进行周期性加载的方法 体内 过度使用诱导的肌腱病模型。该系统的重要性在于能够分离跟腱，在不进行手术暴露肌腱的情况下施加可量化的负荷，并进行测量 体内 肌腱特性
2010年，Fung等人提出了一种使用自行构建的测试系统的大鼠髌腱疲劳模型14。他们的研究介绍了一种通过暴露肌腱直接对髌腱施加负荷的方法。尽管该方法同样可对肌腱施加可量化的疲劳负荷，但直接施加负荷可能会因皮肤切口及后续缝合而引发额外的炎症性伤口愈合反应。而采用我们的方法，非侵入性施加的负荷可确保所测得的任何生物学反应完全源于加载方案本身，而非任何外部因素。
该加载方案的一个关键组成部分是反馈控制回路。通过检测滞后加载曲线的斜率，并在必要时增加背屈角度，系统可持续使跟腱疲劳。固定膝关节是至关重要的一步，因为它可确保背屈仅对肌腱产生应变，而不是带动膝关节及其他周围软组织移动。为检查固定是否正确，可在固定后手动活动踝关节，感受肌腱是否僵硬，并监测循环加载步骤前产生的滞后曲线。
本研究的一个局限性在于应变值相对较大。然而，这些值与人体跟腱被动背屈时的应变相当，可能是由跟腱和腓肠肌的延长所引起。18另一个局限性在于，扭矩与应力之间的换算仅限于 离体 测量了跟腱的平均横截面积以及踝关节处的力臂，这些参数在不同动物之间可能存在差异。
慢性肌腱病的病理学及其早期阶段尚未阐明。除年龄和其他风险因素外，过度使用是导致慢性肌腱病发生的主要因素之一。通过本系统多次施加疲劳性循环载荷，可模拟出可重复的过度使用性损伤。此外，该系统的非侵入性特点使得能够在较长时间内评估肌腱损伤及修复过程中发生的生物学和结构变化，从而有助于理解肌腱病中的关键生物标志物。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢以下资助支持：Joe Fallon 研究基金、Dr. Louis Meeks BIDMC 运动医学培训人员研究基金，以及来自 BIDMC 骨科的院内资助（AN），同时感谢美国国立卫生研究院的支持（2T32AR055885（PMW））。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1/32'' 铝珠 | |||
| 2.5% 异氟烷 | |||
| 3D 数字化笔 | Polhemus，佛蒙特州，新罕布什尔州，美国 | ||
| 3D 电磁定位与方向传感器 | Polhemus，佛蒙特州，新罕布什尔州，美国 | ||
| 5% 异氟烷 | |||
| 定制装置：1）组件、传感器、3D 打印动物床和脚踝固定驱动器 | 按文中所述方式组装 | ||
| MATLAB 代码 | MATLAB，马萨诸塞州，纳提克，美国 | ||
| 微控制器 | 意大利，伊夫雷亚 | Arduino UNO, Rev3 | |
| 鼻罩 | |||
| 手术刀及刀柄 | 11 号手术刀 | ||
| 斯普拉格-道利大鼠（Sprague-Dawley rats） | Charles River Laboratories，马萨诸塞州，威尔明顿，美国 | 11–13 周龄 | |
| 步进电机驱动器 | SparkFun Electronics，科罗拉多州，尼沃特，80503 | DM542T | |
| 步进电机 | SparkFun Electronics，科罗拉多州，尼沃特，80503 | 23HE30-2804S | |
| 直头镊 | |||
| 扭矩传感器组件 | Futek Inc.，加利福尼亚州，尔湾，美国 | FSH03985, FSH04473, FSH03927 | |
| 水循环加热垫 |
参考文献
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