豚鼠圆窗膜外植体获取用于离体研究

摘要

本方案概述了一种从豚鼠颞骨中分离耳蜗圆窗膜的方法，为相关研究提供了有价值的资源 离体 研究。

摘要

向内耳高效且微创地递送药物是一项重大挑战。圆窗膜（RWM）作为进入内耳的少数通道之一，已成为研究的关键焦点。然而，由于分离RWM的复杂性，我们对其药代动力学的理解仍然有限。RWM由三层不同的结构组成：外层上皮、中间结缔组织层和内层上皮层，每一层可能具有独特的药物递送特性。

目前研究药物通过圆窗膜（RWM）转运的模型主要采用活体动物模型或离体RWM模型，后者依赖于细胞培养或膜碎片。豚鼠是研究药物在内耳中药代动力学的已验证的临床前模型，也是向耳蜗递送载体进行转化研究的重要动物模型。在本研究中，我们描述了一种从豚鼠中完整剥离圆窗膜及其周围耳蜗骨组织的方法，用于台式药物递送实验。该方法可保持圆窗膜的天然结构完整性，相较于现有的台式模型，可能更真实地模拟药物转运过程中的屏障特性。

引言

治疗感音神经性听力损失的新类型疗法已经出现。这些疗法向临床应用的转化受到内耳给药途径安全性与有效性的限制。目前的给药方法 体内 动物实验中的给药依赖于耳蜗内开窗或通过圆窗膜（RWM）扩散，后者为分隔中耳腔与耳蜗的非骨性屏障¹.

手术开窗和耳内显微注射均为侵入性操作，可能对残余的内耳功能造成风险²。因此，圆窗膜（RWM）是局部药物递送的重要途径，而豚鼠是研究药物经圆窗膜及在内耳中局部药代动力学的主要临床前动物模型，广泛应用于药物研发^3,4。尽管豚鼠的圆窗膜比人类的更薄，但其具有相同的三层结构。其直径约为1 mm，厚度为15–25 µm，由两层上皮细胞夹着一层结缔组织构成⁵。面向中耳的上皮层细胞排列紧密，并通过紧密连接相互连接；而面向内耳和鼓阶的上皮层结构较为疏松，细胞间缺乏明显的黏附连接。

目前，针对豚鼠圆窗膜药物通透性的临床前研究主要依赖于 体内 中耳注射后采集内耳的外淋巴液，该方法无法特异性研究圆窗膜转运^6,7RWM外植体的碎片已用于临床前研究，但由于其脆弱且尺寸较小，难以在RWM上形成严密的密封，因此不适用于需要密封条件的药物和载体转运的系统性微流控研究。²其他研究团队已采用 体外 使用培养的人类上皮细胞模型来模拟RWM^8,9,10然而，大多数这些构建物仅关注外层上皮，未能体现 native 组织结构的复杂性。为了更深入地理解跨 RWM 的转运机制，需要有针对性的 离体 需要开展研究。

本研究展示了从豚鼠中取出带有周围骨性支撑的圆窗膜（RWM），以保持其膜的完整性，并阐述了如何在实验模型中利用该组织，专门用于研究药物递送载体通过RWM的转运过程。

方案

所有动物实验程序均经机构动物护理和使用委员会批准（GP18M226）。本研究使用了哈特利白化豚鼠（雌雄皆有，体重500-700 g）。

1. 实验步骤的设置与准备

1. 实验开始前，使用环氧乙烷对所有器械进行灭菌。
2. 根据机构批准的方案实施动物安乐死。
   注：本研究中采用非预充气室，从商用气瓶释放100%二氧化碳（CO₂）。使用管路限流器调节气体流速，使其维持在每分钟30%至70%的容器体积范围内，符合2020年美国兽医医学会（AVMA）指南¹¹。
3. 将动物放入容器中，通入二氧化碳5分钟。在呼吸停止后继续维持CO₂气流1分钟。
4. 在呼吸停止后实施断头术，以确保动物安乐死。

2. 手术入路与移除术

1. 以常规方法从豚鼠颅骨中取出颞骨¹²。使用咬骨钳去除多余的软组织。辨认外耳道、颞骨鼓部和面神经管¹³（图1）。
2. 使用6 mm金刚砂钻头（见材料表）磨除外耳鼓室腹侧部分，完整暴露中耳腔和外耳道周缘。
3. 使用咬骨钳轻柔地去除外耳道和鼓环，同时分离锤砧关节。辨认砧骨、砧镫关节、耳蜗、水平半规管和面神经管¹³（图2A）。
4. 分离砧镫关节，并用镊子取出砧骨。辨认圆窗的骨性隐窝。
5. 使用6 mm金刚砂钻头磨除连接耳蜗与鼓室内侧壁朝向鼓膜张肌管方向的骨板。小心减压鼓膜张肌的骨性通道，并使用28 G针头去除鼓膜张肌。
   注意：鼓膜张肌窝的内侧壁直接与圆窗膜（RWM）周围的耳蜗骨相连，操作时需避免造成可能延伸至圆窗的骨折。
6. 磨除连接耳蜗与鼓室下壁的骨板，直至耳蜗旁残留约1 mm宽的骨 ledge（图2B）。
7. 使用2 mm金刚砂钻头（见材料表），在耳蜗基回处造耳蜗开窗术，保留距圆窗约2 mm的骨质。沿与圆窗膜平行的平面继续向下扩大耳蜗开窗，以分离耳蜗基部与顶部。
8. 将耳蜗开窗切口延伸穿过密度更高的颅底骨质，从而获得耳蜗基回的横截面视图。
   注意：将钻头方向对准内听道口，可使骨质去除最大化，同时避免过于靠近圆窗。
9. 从颅底侧观察标本，若尚未完成，需辨认内听道并钻至耳蜗开口处，使用28 G针头去除耳蜗神经。
10. 从耳蜗内部侧观察标本。用镊子或28 G针头辨认并去除基回的骨螺旋板及残余的蜗轴。
11. 充分冲洗鼓阶-前庭阶连通腔以清除碎屑。从耳蜗切除面应能清晰看到圆窗，无任何覆盖碎屑（图2C）。
12. 接下来从中耳侧观察标本。将外半规管和面神经管钻至卵圆窗水平。用镊子轻柔取出镫骨，暴露卵圆窗隐窝。值得注意的是，镫骨两支之间存在一条骨桥，称为镫骨肌嵴（crista stapedis）。
13. 使用1 mm金刚砂钻头（见材料表），沿圆窗面方向延伸卵圆窗，进一步开放前庭，注意保留1–2 mm与圆窗隐窝相邻的耳蜗骨质（图2D）。
14. 通过将卵圆窗切口与圆窗两侧的耳蜗切除切口连接，完成颞骨的切割。
    注意：由于耳蜗骨质脆弱，保留标本中的鼓膜张肌窝并避免在其区域进行切割，有助于防止延伸至圆窗膜（RWM）的骨折，从而维持其完整性。
15. 在靠近内听道的颅底致密骨上完成最终修整，并轻柔打磨，最终获得一个完整切除的圆窗膜（RWM）标本（图3A）。

结果

如图3A所示，该方法可将完整豚鼠圆窗膜连同周围一圈坚硬骨环一并取出。圆窗膜应与骨性环状结构在全周范围内完全连接，且耳蜗骨质不应出现骨折。与人类圆窗标本相比，豚鼠圆窗膜表面无假膜覆盖。此外，与人类不同的是，豚鼠镫骨的前后弓之间存在骨性桥连接，因此在取出镫骨上部结构前，需先将其折断并去除。代表性圆窗膜的组织学分析（图3B）显示其具有清晰的三层上皮结构，并邻接完整的圆窗隐窝。

从技术角度来看，有两个关键步骤。首先，在步骤 2.7 进行耳蜗切除时，重要的是使用钻头的赤道部位而非尖端进行切割，因为钻头尖端的抖动可能导致耳蜗骨的创伤性骨折，进而延伸至圆窗膜。其次，必须彻底磨除内听道，这有助于完全移除耳蜗神经，并更方便地解剖骨螺旋板，从而在耳蜗内侧形成一个统一的腔体，便于实验取样(图 2C)。

在成功提取圆窗膜（RWM）后，本课题...

讨论

在耳部局部给药中，圆窗膜（RWM）是治疗药物进入内耳的主要通路。为了更好地理解药物通过新型递送载体的转运机制和通透性，并推动药物研发，需要建立一种准确且可靠的台式模型。本研究证明，豚鼠圆窗膜离体移植是一种可行且可靠的实验方法，可用于系统研究药物与膜之间的相互作用。Lundman 等人和 Kelso 等人此前曾描述过类似的圆窗膜通透性模型^2,16；然而，手术取出的具体步骤此前一直未被详细阐述，而耳蜗骨的脆弱性及复杂的解剖结构也给完整、成块地稳定获取完整的圆窗膜带来了挑战。

豚鼠的圆窗膜（RWM）位于耳蜗鼓阶的末端，周围被一层薄的耳蜗骨包围。在取材过程中，若该骨性结构发生骨折，可能导致标本无法使用，因为一旦周围的耳蜗骨不完整，RWM 容易被撕脱。本研究团队注意到，骨折最常发生在钻孔接近致密的颅底骨与脆性的耳蜗交界处时，由于骨密度的突变，增加了裂纹向圆窗区域扩展的风险。因此，建议在靠近圆窗处保留附着于耳蜗的鼓膜张肌窝较致密的骨质，这将提高标本获取的成功率，尤其是在老年动物...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 毫米金刚石球钻头	Anspach	1SD-G1
2 毫米金刚石球钻头	Anspach	2SD-G1
6 毫米金刚石球钻头	Anspach	6D-G1
ANSPACH EMAX 2 Plus 系统	Anspach	EMAX2PLUS	任何骨切割钻孔系统均可使用
BD Eclipse 针头 27 G × 1/2 英寸，配可拆卸 1 mL BD Luer-Lok 注射器	Becton, Dickinson, and Co.	382903057894	任何 27–28 G 针头
Gorilla 环氧树脂胶	Gorilla	4200101
Kwik-CAST	World Precision Instruments	KWIK-CAST