模拟丁氏滚压法对竹叶青蛇毒诱导大鼠肌肉损伤的影响

摘要

本方案描述了一种模拟丁氏滚压法的简易装置，用于建立大鼠骨骼肌损伤模型，并采用苏木精-伊红染色观察受损组织的病理变化，以及通过酶联免疫吸附测定检测血清损伤标志物的变化。

摘要

丁氏滚法是中医推拿（推拿）临床中最常用的推拿手法之一，也是当今中国最具影响力的传统推拿手法之一。该手法基于一指禅流派中常用的傳統滾法，並以“丁氏滾法”命名。由於具有抗炎和促進血液循環的作用，丁氏滾法對肌病具有良好的治療效果。然而，由於該手法作用於人體皮膚的接觸面積較大，因此在大鼠、兔子等皮膚面積較小的實驗動物身上操作極具挑戰性。此外，施加於人體的推拿力度與實驗動物所需的力度存在差異，實驗過程中容易出現力度過大或過小的情況，從而難以達到預期的治療效果。本實驗旨在根據丁氏滾法的操作參數（力度、頻率、推拿時間）設計一種適用於大鼠的簡易推拿儀器。該裝置可實現動物實驗中推拿操作的標準化，減少因主觀因素導致對不同動物施加推拿力度的差異。本研究建立了由notexin誘導的大鼠骨骼肌損傷模型，並採用血漿損傷標誌物肌酸激酶（CK）和脂肪酸結合蛋白3（FABP3）來評估推拿對骨骼肌損傷的治療效果。結果顯示，該推拿儀器能夠降低CK和FABP3的表達水平，減緩骨骼肌損傷程度。因此，本研究所描述的模擬丁氏滾法的推拿儀器，有助於在實驗研究中實現推拿手法的標準化，對後續探討推拿治療肌病的分子機制具有重要幫助。

引言

肌肉损伤是临床和日常生活中常见的创伤性损伤，可由外部撞击（挫伤）或肌肉纤维的慢性过度拉伸（拉伤）等原因引起，导致肌肉功能障碍和疼痛，甚至严重影响患者的生活质量¹。在急性拉伤损伤后尽早开始康复治疗，是缩短重返运动时间² 并减轻疼痛^3,4的关键。现代西医中，肌肉损伤的临床急救遵循休息、冰敷、加压和抬高（RICE）原则，以控制肌肉组织内的出血⁵ ，并使用非甾体抗炎药物缓解疼痛⁶。近年来，外泌体⁷ 和组织工程⁸ 等新型疗法的发现，为骨骼肌疾病提供了潜在的治疗策略，弥补了既往药物治疗的不足。然而，这些疗法也可能增加患者的治疗成本，使其面临巨大的经济压力⁹。因此，建议采用替代性和补充性疗法治疗肌肉骨骼问题¹⁰。推拿作为中国传统医学方法，在中国临床广泛应用，因其疗效显著且副作用较少而深受患者欢迎。推拿治疗肌肉骨骼疾病可有效缓解疼痛并改善功能^11,12,13。著名上海推拿医师丁季峰先生创立了丁氏滚法¹⁴，这是一种具有作用面积大、力度均匀柔和且渗透性强特点的独特滚动按压技术。

不同的动物模型基于不同的病因学机制。这些模型各有优缺点，正确且恰当地选择动物模型对基础实验具有重要意义，有助于理解骨骼肌损伤后再生与修复的细胞和分子信号通路，从而为开发治疗骨骼肌疾病的新疗法提供依据。化学诱导的肌肉损伤模型被广泛应用，通过向骨骼肌注射药物可导致肌纤维坏死，并在2周内有效形成再生区域¹⁵。notexin 和 bupivacaine 均可引起肌肉损伤，但 notexin 对骨骼肌造成的肌毒性损伤比 bupivacaine 更严重，且自然功能恢复相对较慢¹⁶。药物肌肉注射建模不仅耗时较短，而且能够控制骨骼肌损伤的效应和程度。这种可量化的控制使得成功建模更为容易^15,17。

炎症反应是一种重要的生物学反应，在肌病研究中已被广泛探讨^18,19。在骨骼肌损伤的早期阶段，肌纤维坏死会破坏局部肌肉稳态，大量炎性细胞浸润损伤部位，并分泌多种促炎性细胞因子¹⁹。肌酸激酶（CK）是评估骨骼肌损伤的传统血清生物标志物。然而，其缺乏组织特异性²⁰ 和敏感性²¹，这限制了其在评估药物诱导的肌肉损伤程度以及间接反映损伤后肌肉恢复程度方面的能力。近年来，一些新型生物标志物（如脂肪酸结合蛋白3（FABP3））在骨骼肌损伤的啮齿类动物模型中表现出相对较高的组织特异性和敏感性。FABP3是一类主要在心肌和骨骼肌细胞中表达的结合蛋白家族，参与脂肪酸的代谢、转运和信号传导²²。因此，我们选择联合使用CK和FABP3两种生物标志物，以评估notexin诱导的骨骼肌损伤程度及治疗后的恢复情况。

在啮齿类动物中，肌肉较浅，皮肤面积较小，这也决定了啮齿类动物按摩的各个参数将不同于人类。例如在动物治疗中，按摩治疗师应采用丁氏滚法并施加较小的力量，但由于损伤区域较小，可能不利于该技术的操作，最终导致按摩效果降低。因此，本实验采用自制的滚压式按摩装置，该装置符合丁氏滚法的特点，用于干预并评估蛇毒因子（notexin）诱导的大鼠骨骼肌损伤模型，有助于在实验动物研究中标准化推拿治疗的参数，从而深入探究推拿这一中医治疗方法对肌肉骨骼系统疾病的分子作用机制。

方案

涉及动物的实验程序已获得湖南中医药大学机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 滚轮按摩器的组装

1. 选择一种由橡胶滚轮、叉形支架、弹簧、限位挡板、调节夹板、螺钉和亚克力手柄组成的按摩器（图1）。确保橡胶滚轮长3 cm、直径1.6 cm，弹簧长3 cm、直径0.9 cm，限位挡板长3 cm、宽2 cm，手柄长12 cm、直径0.9 cm。
2. 力控设计：根据文献结果²³，发现丁氏滚法的下压力约为体重的10%，因此在设计前滚动作时施加的压力约为大鼠体重的10%（0.2–0.3 N）。通过调节限位挡板的角度，在称重控制器上测试按摩器的最大压力约为0.3 N。该压力要求满足大鼠实验的需求。
3. 确保回滚时的最小压力约为0.08 N（图2）。确保压力精确符合丁氏滚法对前后作用力比值为3:1的要求。
4. 治疗前，要求操作者配合节拍器软件将滚动频率控制在140次/分钟，并在预实验中至少练习3次以上，以确保操作标准化。

2. 建立骨骼肌损伤的大鼠模型

1. 将24只雄性Sprague-Dawley大鼠（体重200-250 g）随机分为三组，每组8只，分别为对照组（C）、notexin组（NTX）和notexin联合推拿组（NTX + 推拿），均给予标准饮食喂养。维持12小时光照/12小时黑暗循环，饲养环境温度为20-25 °C，相对湿度为50%-70%。
2. 通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行麻醉，随后使用脱毛膏去除右侧下肢的毛发。脱毛后，用生理盐水擦拭残留的脱毛膏。通过夹趾反应确认麻醉效果充分。动物在麻醉期间使用眼膏润滑眼睛，防止干燥。整个操作过程中提供保温支持。
3. 注射前交替使用碘伏消毒液和75%酒精对右侧下肢皮肤进行消毒。先用蘸取碘伏消毒液的棉签从下肢皮肤中心开始，以同心圆方式向外擦拭；再用蘸有乙醇的棉签重复相同操作。
4. 参照文献方法建立骨骼肌损伤模型²⁴。仅在一侧后肢注射notexin（避免双侧注射）。取1 mL注射器配30G针头，吸取200 µL notexin溶液（在15 mL离心管中将100 µg notexin溶于10 mL生理盐水中，配制成10 µg/mL的溶液），将notexin溶液经肌内注射注入腓肠肌以诱导肌肉损伤。
5. 缓慢注射notexin，拔针前停留3秒，确保完全注入。
   注意：notexin为有毒化学品，若接触开放性伤口，需立即用大量清水冲洗，必要时及时就医。
6. 对照组大鼠注射200 µL生理盐水。将麻醉后的大鼠转移至铺有清洁垫料的空笼中，注意清除其口鼻周围的垫料，保持呼吸道通畅。注射结束后持续肉眼观察组织颜色及呼吸频率，直至大鼠意识基本恢复。
7. 将大鼠放回饲养笼，通常继续饲养24小时。

3. 推拿疗法

1. 将SD大鼠俯卧位放置于经75%酒精消毒的实验平台上，头部用黑色布料覆盖以暴露腓肠肌，但不要包裹过紧。
2. 对于NTX+推拿组使用推拿按摩器：手持按摩器，将滚轮置于大鼠腓肠肌上，向前滚动直至弹簧接触限位挡板，随后撤力使其回至初始位置，实现往复运动（图3）。
3. 以每分钟140次的频率滚动按摩器，每次操作持续3分钟。每日上午和下午各进行一次，连续3天。
4. 每次处理后将大鼠放回饲养笼，末次处理后禁食8小时。

4. 实验结束后采集大鼠的血液和组织

1. 根据相关动物实验伦理委员会的要求，通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg，腹腔注射）麻醉大鼠。通过夹趾反应确认麻醉充分。采血后通过腹主动脉放血处死大鼠。
2. 注射前交替使用碘伏消毒液和75%酒精对皮肤进行消毒。用浸有聚维酮碘的棉签从腹部皮肤中央开始向外作环形涂抹。再用浸有乙醇的棉签重复操作。重复消毒3次。
3. 请助手使用两把止血钳提起腹部正中皮肤。术者使用手术刀从腹中线向耻骨联合方向切开腹壁皮肤和肌肉。
4. 打开腹腔后，用无菌棉球分离肠管，暴露腹膜后壁的腹主动脉。
5. 定位腹主动脉，采集5 mL大鼠血液至采血管中，静置1小时后以3000 × g 离心10分钟，分离血浆至1.5 mL离心管中。将血浆储存在-80 °C条件下。
6. 沿下腹部切口使用手术剪向右下肢外侧剪开皮肤，暴露下肢肌肉；用镊子仔细分离筋膜后，使用手术刀切断，完整取下腓肠肌。
7. 用无菌生理盐水清洗腓肠肌，去除附着的毛发和血液。
8. 将取出的腓肠肌放入含有4%多聚甲醛的15 mL离心管中。

5. 采用ELISA法检测血浆CK和FABP3水平

1. 计算并确定一次实验所需的预包被板数量。取出所需数量的包被板，放入96孔板架中，将剩余微孔板重新放回铝箔袋中密封，并储存于 4 °C.
2. 将试剂盒和样品在室温（25-28 °C）120 分钟，完全平衡至室温。
   注意：试剂盒和样品的平衡至关重要，必须给予足够的时间进行平衡。
3. 设置标准品孔、样品孔和空白孔。加入 50 µL 向标准孔中加入不同浓度（100、50、25、12.5、6.25、0 ng/mL）的CK或FABP3标准品，每个标准品重复一次，共占用12个孔。
4. 向样品孔中加样 40 µL 样品稀释液（0.8 g NaCl，0.02 g KH₂PO₄，0.29 g Na₂HPO₄12H₂O，0.02 g KCl，0.01 g NaN₃在100 mL双蒸水（pH 7.4）中，随后 10 µL 待测样本每个重复一次，共占用48个孔。
5. 除了位于最后一个样本孔后方两孔处的空白孔外，其余各孔均添加 100 µL 向各标准品孔和样品孔中加入 HRP 标记的抗人 CK 或 FABP3 抗体（酶标记抗体）。
6. 用封板膜密封各孔，并在以下条件下孵育 37 °C 水浴或恒温器中孵育60分钟
7. 弃去液体，用吸水纸拍干，每孔加入洗涤液，静置20秒，甩去洗涤液，用 blotting paper 拍干，重复洗涤5次（或使用洗板机）。
8. 添加 50 µL A显色液（20 mg四甲基联苯胺溶于10 mL乙醇，加至100 mL双蒸水中）及 50 µL 加入显色液B（0.1 M/L柠檬酸，0.2 M/L磷酸二氢钠缓冲液，pH 5.0–5.4）至各孔，避光孵育15分钟 37 °C.
9. 对于标准孔、样品孔和空白孔，加入 50 µL 向每孔加入终止液，15分钟内测定各孔在450 nm处的光密度值。

6. 大鼠胫前横纹肌注射蛇毒诱导损伤的组织学分析

1. 按照文献²⁵所述方法，制备5 µm厚的石蜡切片，并用苏木精和伊红染色，用于光学显微镜观察。

7. 图像处理与数据分析

1. 使用分析软件读取并分析成像系统拍摄的图像。用鼠标将选定的图像视野移至屏幕中央，点击 40x，然后点击 Take Snapshot。
2. 在电子表格中记录 ELISA 的 OD 值，并利用标准曲线计算样品中大鼠 CK 和 FABP3 的水平。
3. 使用统计分析软件进行统计分析。测量结果以均值 ± 标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，当方差齐性时使用 LSD 检验，方差不齐时采用 Tamhane T2 方法。当 p 值小于 0.05 时，认为差异具有统计学意义。

结果

为了观察大鼠骨骼肌损伤后的形态学特征，按照每组8只大鼠的实验方案，对腓肠肌进行苏木精-伊红染色，并使用分析软件读取染色图像。在采用竹叶毒素（NTX组）诱导腓肠肌损伤的大鼠中，大量肌细胞出现破裂、萎缩、坏死且排列不规则，且在病变区域周围有大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润（图4B）。然而，在使用滚轮按摩器进行推拿治疗后（NTX+推拿组），肌细胞的病理状况得到改善，与NTX组相比，破裂、萎缩和坏死的细胞数量减少，且仅有少量炎性细胞浸润（图4C）。在对照组中，大鼠的肌细胞大小均匀、排列紧密，且无炎性细胞浸润（图4A）。

为了进一步验证使用丁氏滚轮按摩器进行推拿对大鼠腓肠肌损伤的治疗效果，我们采用ELISA检测了每组8只大鼠骨骼肌损伤标志物CK和FABP3的水平。与对照组相比，NTX组中CK和FABP3水平显著升高，而NTX+推拿组的CK和FABP3水平较NTX组明显降低（图5...

讨论

本文介绍了一种针对大鼠骨骼肌损伤的推拿治疗方案，并在治疗后分析了骨骼肌损伤的程度，以验证该方法的有效性。值得注意的是，推拿可干预多种大鼠骨骼肌损伤模型，包括但不限于药物诱导（notexin、布比卡因）¹⁶、钝性挫伤²⁶、挤压伤²⁷以及缺血-再灌注损伤²⁸。通过苏木精-伊红（HE）染色观察组织病理学变化，并采用ELISA检测骨骼肌损伤标志物，结果直观显示notexin可导致大鼠腓肠肌严重损伤，而模拟丁氏滚法的按摩器可减轻肌肉损伤。这些结果为推拿治疗骨骼肌损伤的有效性提供了有力证据。

在对模拟丁氏滚法的大鼠进行推拿时，需考虑若干必要步骤。治疗前，推拿操作者应预先接受培训，至少使用滚压按摩器练习3次，借助压力传感器调节挡板角度以实现适当的力度控制，并将推拿频率控制在140次/分钟。同时，用黑色头巾轻轻覆盖大鼠头部使其保持安静，注意不要过紧，以确保其能自由呼吸。若大鼠在推拿过程中突然挣扎活跃，应暂停操...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器	JIANGXI FENGLIN	20220521
1.5 微量离心管	Servicebio	EP-150X-J
15 mL 离心管	Servicebio	EP-1501-J
30G 针头	CONPUVON	220318
5 mL 血液采集管	Servicebio	QX0023
丙烯酸手柄	广东广兴旺塑料材料有限公司	65643645
调节夹板	CREROMEM	20220729
棉签	INOHV	22080215
酶标仪	Rayto	RT-6100
乙醇	INOHV	211106
叉形固定器	永康康哲健康科技有限公司	JL001
脱毛膏	Veet, 法国	LOTC190922002
苏木精染色液套装	武汉谷歌生物科技有限公司	G1005
成像系统	Nikon, 日本	Nikon DS-U3
碘伏消毒液	Hale&Hearty	20221205
光学显微镜	Nikon, 日本	Nikon Eclipse E100
限位挡板	CREROMEM	20220724
Notexin	Latoxan S.A.S.	L8104-100UG
戊巴比妥钠	Merck KGaA	P3761
大鼠肌酸激酶（CK）ELISA 试剂盒	伦常硕生物科技	YD-35237
大鼠脂肪酸结合蛋白 3（FABP3）ELISA 试剂盒	伦常硕生物科技	YD-35730
橡胶滚轮	河北麦贵化学科技有限公司	202207
螺钉	伟燕五金	B05Z122
Sprague Dawley 大鼠	湖南斯莱克旺达实验动物有限公司	SYXK2019-0009
弹簧	炳彰五金	TH001
手术刀片	Covetrus	#23
称重控制器	Iyoys	HY-XSQ