方法文章

SARS-CoV-2、流感病毒A/B型和MERS-CoV多重实时RT-qPCR检测方法的建立

DOI：

10.3791/65822

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2023年11月10日

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1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们提供了两种基于探针的自主研发一步法RT-qPCR试剂盒，用于检测常见呼吸道病毒。第一种检测方法针对SARS-CoV-2（N基因）、甲型流感病毒（H1N1和H3N2）以及乙型流感病毒。第二种检测方法针对SARS-CoV-2（N基因）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV，靶标为UpE和ORF1a）。这些检测方法可在任何专业实验室中成功实施。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

导致2019冠状病毒病（COVID-19）的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）对公众健康构成严重威胁。在流感季节，SARS-CoV-2与其他呼吸道病毒的传播可能导致大范围的呼吸系统疾病负担，难以有效管理。因此，在即将到来的秋冬季，需对SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒以及中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）等呼吸道病毒进行严密监测，尤其是SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒，它们在易感人群、传播途径和临床综合征等方面具有相似的流行病学特征。由于这些病毒之间存在相似性，在缺乏靶向特异性检测方法的情况下，区分其感染病例可能具有挑战性。因此，一种灵敏且具有靶向性的多重检测方法，若能简便地区分这些病毒靶标，将对临床医疗工作者具有重要价值。在本研究中，我们开发了一种基于实时逆转录PCR的检测方法，利用自主研发的R3T一步法RT-qPCR试剂盒，可同时检测SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒以及SARS-CoV-2、MERS-CoV。使用低至10拷贝的合成RNA，我们能够以100%的特异性成功同时识别SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒和MERS-CoV的靶标。该检测方法被证实准确、可靠、简便、灵敏且特异性强。所建立的方法可作为优化的SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒以及SARS-CoV-2、MERS-CoV诊断检测手段，广泛应用于医院、医疗中心、诊断实验室以及科研领域。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

新型冠状病毒病2019（COVID-19）的全球大流行是由一种名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的新型冠状病毒引起的1。由于SAR-CoV-2具有高度传染性和快速传播能力，COVID-19疫情最初在中国武汉市暴发，并迅速蔓延至全球。这最终导致患者出现呼吸窘迫症状，甚至死亡2,3,4。已有超过213个国家宣布进入COVID-19大流行状态，确诊病例数量预计将急剧上升，多项研究发表的论文已证实了这一趋势3,5。COVID-19主要通过感染者释放到环境中的微小呼吸道飞沫传播，易感人群通过吸入或密切接触被污染的表面而暴露于病毒。当这些飞沫接触到眼睛、口腔或鼻腔的黏膜时，个体可能被感染6。世界卫生组织（WHO）发布的统计数据显示，全球范围内已有超过7600万例确诊病例，死亡人数高达700万7。因此，联合国将由COVID-19疾病引发的大流行归类为灾难，因其直接影响全球数十亿人的生命，并带来了深远的经济、环境和社会影响。

包括全面检测、早期发现、接触者追踪和病例隔离在内的公共卫生措施已被证明对于控制此次大流行至关重要8,9,10,11。冬季将加剧其他呼吸道病毒（如甲型和乙型流感病毒）的传播，这些病毒具有与 COVID-19 相似的症状，使得早期识别、追踪和隔离 COVID-19 病例变得更加困难。每年，甲型和乙型流感疫情通常在深秋或初冬开始，具有可预测的季节性特征12。SARS-CoV-2 与流感病毒在多种流行病学特征上存在共性。此外，两者在易感人群方面也具有相似性，包括儿童、老年人、免疫功能低下者以及患有哮喘、慢性阻塞性肺疾病、心力衰竭、肾功能衰竭或糖尿病等慢性合并症的个体12,13。这些病毒不仅共享易感人群，还具有相似的传播途径，包括接触传播和呼吸道飞沫传播14。随着流感季节的临近，预计患者可能同时感染多种呼吸道病毒14。因此，在对患者实施隔离前，应对 SARS-CoV-2 和流感病毒进行筛查。由于全球范围内核酸提取和诊断资源的短缺，无法对三种病毒（SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒）分别进行独立检测。为实现在单次反应中同时筛查所有病毒，亟需开发一种能够联合检测的方法或检测试剂。

中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）是人类冠状病毒（CoV）家族的一员。首批MERS-CoV病毒分离株来自一名于2012年9月因急性呼吸系统问题在沙特阿拉伯住院并死亡的患者。15有证据表明，单峰骆驼是MERS-CoV的重要储存宿主。已证实来自感染单峰骆驼的病毒具有人畜共患性，因此能够感染人类。16,17感染该病毒的人类可通过密切接触将病毒传播给他人18截至1月26日th, 截至2018年，全球共报告2143例经实验室确诊的MERS-CoV感染病例，其中包括750例死亡19最常见的MERS-CoV症状包括咳嗽、发热和呼吸急促。已有报道称MERS-CoV感染还可出现肺炎、腹泻及胃肠道疾病症状。20目前尚无针对MERS-CoV的商业化疫苗或特异性治疗手段。因此，及时而准确的诊断对于防止MERS-CoV的大范围暴发以及将其与SARS-CoV-2所致疾病相鉴别至关重要。

迄今为止，已提出多种方法用于检测这些病毒，例如多重RT-PCR21,22,23,24,25、CRISPR/Cas1226,27、CRISPR/Cas928、CRISPR/Cas329、侧向流动免疫分析30、基于纸张的生物分子传感器31、一步法SHERLOCK检测32、DNA适配体33、环介导等温扩增（LAMP）19,34等。上述每种方法在灵敏度和特异性方面均有其独特的优势与局限性。在这些方法中，基于核酸扩增的检测方法——多重qRT-PCR——最为常用，被公认为诊断SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒和MERS-CoV的金标准。

本研究中，我们设计并评估了多种引物组合和探针，利用标准 Twist 合成病毒 RNA，实现对 SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒以及 SARS-CoV-2 和 MERS-CoV 的高效、准确且同步检测。针对 MERS-CoV 或 SARS-CoV-2 目标基因开发的多重检测方法，其基因靶标均依据世界卫生组织（WHO）的推荐。这些基因通常编码参与复制/转录复合体（RTC）形成的蛋白质及复合物35，例如用于 MERS-CoV 检测的开放阅读框 1a（ORF1a）区域。此外，诊断检测中所用基因还编码结构蛋白，如用于 MERS-CoV 检测的包膜蛋白基因上游区域（upE）以及用于 SARS-CoV-2 检测的核衣壳蛋白基因（N）35,36。我们采用自主研发的 R3T 一步法 RT-qPCR 试剂盒建立 RT-qPCR 检测方法以检测病毒37。通过标准 Twist 合成 RNA 的 10 倍系列稀释液，对 R3T 一步法 RT-qPCR 试剂盒及其引物组的病毒检测能力、灵敏度、特异性和动态范围进行了测试与评估。最低可检测限约为每反应 10 个转录本拷贝。结果表明，自主研发的 R3T 一步法 RT-qPCR 试剂盒及引物/探针组可成功用于 SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒以及 SARS-CoV-2 和 MERS-CoV 的常规同步诊断。

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方案

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1. Taq 聚合酶的表达与纯化

  1. 构建一个在酶的C末端带有可切割六组氨酸标签的质粒。
  2. 将50 ng表达载体转化至 E. coli BL21-(DE3)菌株，按照标准操作流程38.
  3. 将转化后的细胞接种于四个6 L的锥形瓶中，每个锥形瓶含有2 L的2YT液体培养基，在37 °C、170 rpm振荡培养，直至OD600达到0.8或细胞数量达到6.4 × 10⁸个/mL8 达到。
  4. 用0.5 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导Taq聚合酶表达，并在16 °C下振荡培养18 h。
  5. 在 4 °C 条件下以 7808 x g 离心收集细胞 g 10 分钟。将沉淀重悬于 200 mL 冰冷的 Taq 聚合酶裂解缓冲液中（表1) 按每克细胞沉淀加入5 mL的量。
  6. 将细胞与溶菌酶（2 mg/mL 裂解缓冲液）及蛋白酶抑制剂孵育 45 分钟，随后将裂解液通过细胞破碎仪在 30 kPsi 下处理，并在 22,040 x g 条件下离心 g 在 4 °C 下离心 30 分钟以去除细胞碎片。
  7. 在85 °C下加热上清液15分钟。以95,834 x g离心沉淀 g 4 °C 下孵育 1 小时。收集上清液，并在冰上用 0.45 µm 滤膜过滤。
  8. 使用快速蛋白液相色谱（FPLC）进行蛋白纯化，首先将样品以 4 mL/min 的流速通过 Ni-NTA HP 5 mL 柱，使用 Taq 聚合酶缓冲液 A表2； 图1A).
  9. 用10个柱体积（CV）的Taq聚合酶缓冲液A和4%的Taq聚合酶缓冲液B洗涤表2用100 mL的Taq DNA聚合酶缓冲液B，在20个柱体积范围内进行线性梯度洗脱，收集结合的蛋白质。
  10. 将100 mL瓶中的洗脱液以4 mL/min的流速通过阳离子交换5 mL层析柱，使用Taq DNA聚合酶缓冲液C表2； 图1A).
  11. 用20个柱体积的100% Taq聚合酶缓冲液C和5% Taq聚合酶缓冲液D洗涤表2).
  12. 使用Taq聚合酶缓冲液D进行线性梯度洗脱（表2从5% 到 100% 开始。
  13. 通过SDS-PAGE凝胶电泳检测洗脱组分 39 随后进行凝胶染色 40 如前所述。简言之，取每种组分10 µL，加入等体积的2x SDS上样缓冲液。将样品在90℃下变性o在 200 V 电压下将样品加载至 10% SDS-PAGE 凝胶并电泳 25 分钟。使用考马斯亮蓝染色，随后进行脱色。
  14. 收集所有含有纯化的Taq聚合酶的组分，并在Taq聚合酶储存缓冲液中透析（表3在4 °C条件下进行。简言之，配制2 L储存缓冲液，将透析盒浸入缓冲液中2分钟以充分水化。使用针头将收集的组分注入透析盒中，置于透析缓冲液中，在摇床中以200 rpm转速搅拌过夜。
  15. 透析后，使用分光光度计测定蛋白浓度，分装成10 µL每份，液氮速冻后于-80 °C保存。
    ​注意：在将所有缓冲液上样至FPLC系统前，须使用0.45 µm滤膜过滤以进行纯化。

2. 昆虫细胞表达系统中MMLV-RT的表达与纯化

  1. 病毒基因组DNA的制备与分离
    1. 按照先前描述的方法41，将带有C端可切割TEV-8xHis-Strep标签的MMLV-RT序列克隆至表达载体中。
    2. 将100 ng表达载体加入50 μL DH10Bac细胞中，轻轻敲击离心管混匀。
    3. 将细胞置于冰上孵育15分钟，随后在42 °C下热激1分钟。
    4. 立即转移至冰上，加入400 μL S.O.C培养基，于37 °C振荡培养4小时。
    5. 取10 μL和15 μL转化混合物涂布于含有三种抗生素（50 μg/mL卡那霉素、10 μg/mL四环素和7 μg/mL庆大霉素）以及40 μg/mL IPTG和100 μg/mL X-Gal的LB琼脂平板上，进行蓝白斑筛选。
    6. 将平板在37 °C下孵育48小时，挑取数个白色菌落及一个蓝色菌落作为对照，重新划线接种至含上述抗生素的新鲜LB琼脂平板上，于37 °C过夜培养。
    7. 确认为白色表型后，挑取数个菌落接种至含有50 μg/mL卡那霉素、10 μg/mL四环素和7 μg/mL庆大霉素的10 mL LB液体培养基中（置于50 mL离心管中）。
    8. 于37 °C、170 rpm振荡条件下过夜培养。以22,040 × g离心10分钟收集菌体沉淀。
    9. 弃去上清液，将沉淀重悬于250 µL质粒小提试剂盒中的重悬溶液中（该溶液需按照制造商说明操作），然后转移至1.5 mL微量离心管中。
    10. 加入250 µL裂解液，轻轻混匀后孵育3分钟。加入350 µL中和液，颠倒混匀2–3次，以22,040 × g离心10分钟。
    11. 将上清液转移至新离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，于-20 °C孵育30分钟。
    12. 以22,040 × g离心10分钟收集沉淀的DNA，弃去上清液，用700 µL预冷的70%乙醇洗涤沉淀两次。
    13. 用移液器小心吸除上清液，避免触碰沉淀。将沉淀在超净工作台中晾干5–10分钟，直至管内无可见液体。将沉淀溶解于100 µL EB缓冲液中。
  2. 病毒基因组转染与病毒扩增
    1. P1代病毒制备
      1. 在6孔细胞培养板中，每孔接种约9 × 105个细胞，加入2 mL昆虫细胞培养基。
      2. 室温孵育约30分钟，使细胞贴壁。
      3. 配制病毒基因组/Fugene混合液：在一个离心管中加入1 µg病毒基因组DNA和300 µL昆虫细胞培养基；在另一管中加入8 µL转染试剂和300 µL昆虫细胞培养基。轻柔吹打混匀后，室温静置约30分钟，使病毒基因组/转染试剂复合物形成。
      4. 将约210 µL复合物混合液逐滴加入每孔中，并用透明封膜密封培养板。
      5. 于27 °C培养3–4天。
      6. 收集含有病毒的培养上清液，加入胎牛血清（终浓度2%），经0.45 µm滤器过滤后，避光保存于4 °C，作为P1代病毒储备液。
    2. P2代病毒制备
      1. 在培养瓶中，用3 mL P1代病毒转染50 mL浓度为2 × 106个细胞/mL的昆虫细胞。
      2. 于27 °C、100 rpm振荡条件下培养4–6天，直至细胞死亡率达到25%–30%。
      3. 以300 × g离心10分钟，收集含有病毒的上清液。
      4. 加入胎牛血清至终浓度2%，经0.45 µm滤器过滤后，分装为每管1 mL，于-80 °C保存，作为P2代病毒储备液。
    3. P3代病毒制备
      1. 在培养瓶中，用2 mL P2代病毒转染100 mL浓度为2 × 106个细胞/mL的昆虫细胞。
      2. 于27 °C、100 rpm振荡条件下培养3–4天，直至细胞死亡率达到15%–20%。
      3. 以300 × g离心10分钟，收集含有病毒的上清液。
      4. 加入胎牛血清至终浓度2%，经0.45 µm滤器过滤。可在避光条件下于4 °C保存1个月。
  3. 昆虫细胞中MMLV-RT的表达与纯化
    1. 将5 mL P3代病毒加入6个2 L培养瓶中，每瓶含700 mL、密度为2 × 106个细胞/mL的新鲜昆虫细胞，共6瓶。
    2. 转染后55–60小时收集细胞，以7808 × g离心10分钟。
    3. 将细胞沉淀重悬于200 mL MMLV-RT裂解缓冲液中（表4）。使用细胞破碎仪在15 kPsi压力下处理裂解液，随后于4 °C、22,040 × g离心30分钟。
    4. 将上清液转移至新离心管中，于4 °C、95,834 × g再次离心1小时。收集上清液，并在冰上使用0.45 µm滤器过滤。
    5. 使用FPLC系统开始蛋白纯化：首先以4 mL/min流速将样品通过Ni-NTA Excel 5 mL层析柱（图1B），使用MMLV-RT缓冲液A（表5）进行平衡。
    6. 用10个柱体积（CV）的MMLV-RT缓冲液A和4%的MMLV-RT缓冲液B（表5）洗涤层析柱，随后在100 mL收集瓶中使用MMLV-RT缓冲液B进行20 CV的线性梯度洗脱。
    7. 将洗脱组分通过已用MMLV-RT缓冲液C（表5）平衡的Strep 5 mL层析柱（图1B）。
    8. 用10 CV的100% MMLV-RT缓冲液C洗涤层析柱，随后使用缓冲液D进行20 CV的线性梯度洗脱（表5）。
    9. 通过SDS-PAGE检测洗脱组分（操作步骤同1.13–1.14），收集含有纯化MMLV-RT的组分，并于4 °C条件下对MMLV-RT保存缓冲液（表6）进行透析。
    10. 使用Nanodrop测定蛋白浓度，分装后在液氮中速冻，保存于-80 °C。
      ​注意：所有用于纯化的缓冲液在上样至FPLC系统前，均需使用0.45 µm滤器过滤。

3. 自制多重R3T一步法RT-qPCR试剂盒组分的制备

  1. 缓冲液混合物的制备
    1. 配制RT-qPCR反应所需的2×缓冲液，其中包含先前所示的试剂37. 所有试剂均用无DNase/RNase的水配制，缓冲液混合物储存于-20 °C 冷冻机
  2. 引物与探针组合及引物混合液的制备
    注意：所使用的探针和引物列于 表7流感病毒和SARS-CoV-2多重检测试剂盒包含3种探针以及4对正向与反向引物。探针的5′端分别标记荧光报告基团：甲型流感病毒（InfA）使用6-羧基荧光素（FAM），SARS-CoV-2（N基因）使用Texas Red-XN，乙型流感病毒（InfB）使用Yakima Yellow。中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和SARS-CoV-2多重检测试剂盒包含3种探针以及3对正向与反向引物。探针的5′端同样标记荧光报告基团：MERS-CoV（ORF1a基因）使用Texas Red-XN，MERS-CoV（UpE基因）使用VIC，SARS-CoV-2（N基因）使用6-羧基荧光素（FAM）。
    1. 配制引物混合液，包含所列出的全部引物和探针 表7 每条正向和反向引物的终浓度为 6.7 µM，每条探针的终浓度为 1.25 µM，置于 1.5 mL 离心管中。将引物混合液储存于 -20 °C 冷冻机。使用洗脱缓冲液定容至所需体积。
  3. 酶混合液的制备
    1. 在Taq DNA聚合酶保存缓冲液中配制Taq聚合酶（30 U/µL）和MMLV-RT（60 ng/µL）酶混合液，如下所示 表3 补足所需体积。此步骤需在冰上操作，并将酶混合液于 -20 °C 保存。
  4. RNA模板
    1. 分别将SARS-CoV-2、Influenza A H1N1、Influenza A H3N2、Influenza B和MERS-CoV的合成RNA用100 µL 1×Tris-EDTA缓冲液（10 mM Tri-Cl和1 mM EDTA（pH 8.0））重悬，配制成1 × 10的储备液6 RNA 拷贝数/µL
    2. 将用于RT-qPCR的合成RNA按以下配置混合：1）SARS-CoV-2、Influenza A和Influenza B，分别取每种病毒储备液5 µL加入至50 µL体系中，制成1 x 105 RNA 拷贝/µL；2）SARS-CoV-2、MERS-CoV，通过将每种病毒原液各取 5 µL 加入 50 µL 体系中，制成 1 × 105 RNA 拷贝/µL。将每种合成 RNA 混合物进行10倍系列稀释，稀释范围从 1 × 105 从 RNA 拷贝/µL 稀释至 10 RNA 拷贝/µL。
      ​注意：确保使用预冷的无 DNase/RNase 水来配制模板的系列稀释液。

4. 实验室自建的多重 SARS-CoV-2、甲型流感、乙型流感以及 SARS-CoV-2、MERS-CoV 一步法 RT-qPCR 检测

注意：对工作台表面进行消毒，并使用96孔板模板规划PCR板布局。

  1. 96孔板的准备
    1. 解冻2×缓冲液和引物混合物。酶混合物需保持在冰上。
    2. 向每个孔中加入10 µL的2×缓冲液混合物、1.5 µL引物混合物、1 µL酶混合物、6.5 µL无DNase/RNase水以及1 µL待检测的相应RNA混合物。每孔终体积为20 µL。请参考预先设计的布局图以协助完成此步骤。
      注意：建议根据反应数量配制主混合液（master mix），其中包含除RNA样本外的所有试剂，以避免移液偏差。此外，建议每个反应设置重复（双复孔或三复孔），以减少技术误差。
    3. 使用粘性PCR板封膜密封板子，并短暂离心1分钟，使所有液体沉降至孔底。在将样品转移至qPCR仪前，确保每个孔中的液体体积一致且无气泡。
      注意：所有PCR反应均需在冰上进行配制。
  2. PCR程序
    1. 打开实时qPCR仪的程序，选择以下实验参数：
      反应板类型：快速96孔（0.1 mL）
      实验设置：标准曲线
      试剂：TaqMan试剂
      ​运行模式：标准。
    2. 根据表7中所示内容，定义所有基因靶标及其对应的报告荧光染料。此外，为每个待测反应定义样品名称，以便更方便地分析扩增曲线。
    3. 根据96孔板的实际布局，在程序中分配靶标和样品。
    4. 在PCR仪中设置如下循环程序：
      55 °C 10分钟
      40 个循环：94 °C 1分钟
      94 °C 10秒
      68 °C 10秒
      ​68 °C 20秒；在此步骤采集荧光信号。
    5. 将板子转移至实时qPCR仪中，放入支架并确保板子方向正确，然后启动运行。
    6. 选择保存实验数据的文件路径。
  3. 数据分析
    1. 首先必须检查qPCR程序生成的扩增曲线图。通过分析检测限，评估可检测到的最低RNA浓度。
    2. 以x轴表示RNA拷贝数的对数值，y轴表示相应的平均Ct值，绘制曲线以评估检测的灵敏度。斜率和R2值反映反应的可靠性和扩增效率。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近年来，利用PCR技术检测常见呼吸道病毒的诊断方法已取得显著进展21,22,23,24,25。然而，尽管已有这些进展，可在单次检测中同时识别多种病毒的多重检测方法尚未得到广泛应用，尤其是在RT-qPCR平台上。该方法已通过使用合成RNA病毒及对反应组分进行实验室内部优化而成功实现37。通过检测限分析，该诊断检测方法的特异性、灵敏度和可靠性均被评估为较高。本研究所提出的方法可显著提高呼吸道病毒诊断的效率与准确性，减少对多次检测的需求，并降低误诊风险43。未来仍需进一步研究，利用患者样本深入探索该方法的优势，并推动其在临床实践中的应用。

带组氨酸标签的T...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于SARS-CoV-2、甲型/乙型流感病毒和MERS-CoV变异株等常见呼吸道病毒的广泛传播，导致全球范围内感染率和死亡率居高不下，给医疗保健系统带来了沉重的经济负担12，19，20。出于减轻这一负担的责任感，我们认识到迫切需要一种快速、精确且易于获取的诊断检测方法，例如RT-qPCR，能够在一次检测中区分这些常见病毒。 得益于qRT-PCR的多重检测特性，能够实现对SARS-CoV-2与其他呼吸道病毒（如甲型/乙型流感病毒和MERS-CoV）的鉴别诊断。最终，通过本研究建立的这种多重检测方法，可实现对患者的更优且更精准的治疗46。综上所述，本研究介绍了一种自主研发的一步法多重RT-qPCR检测技术，可针对两种不同的病毒组合进行检测。每种组合均包含三种不同的呼吸道病毒，旨在控制此类传染性病毒的传播，并减轻医疗系统的经济负担。

本多重RT-...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作由沙特阿拉伯阿卜杜拉国王科技大学的核心资金以及授予 S.M.H. 的国家重大挑战计划（NTGC）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.45 μm 滤膜杯Thermo Scientific291-4545
10X Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液NovexLC2675
6 孔细胞培养板Corning353046
硫酸铵Fisher ScientificA701-3
氨苄青霉素Corning61-238-RH
阳离子交换柱（HiTrap SP HP）5 mLCytiva17-1152-01
D-(+)-生物素，98+%Thermo ScientificA14207.60
DH10Bac 感受态细胞Fisher Scientific10361012
透析袋（Snakeskin，10,000 分子量截留）Thermo Scientific68100
二硫苏糖醇（DTT）Thermo ScientificR0862
无 DNase/RNase 蒸馏水AmbionAM9930
dNTPsThermo ScientificR0192
E. coli BL21(DE3) 感受态细胞InvitrogenC600003
EDTAFisher ScientificBP120-1
洗脱缓冲液Qiagen19086
ESF 921 昆虫细胞培养基（昆虫细胞培养液）Expression Systems96-001-01
FBS 溶液GibcoA38400-01
Fugene（转染试剂）PromegaE2311
庆大霉素Fisher Scientific15750060
甘油Sigma AldrichG5516-500
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI8896-100ml
咪唑Sigma Aldrich56750-1Kg
甲型流感病毒（H1N1）合成 RNATwist Bioscience103001
甲型流感病毒（H3N2） 合成 RNATwist Bioscience103002
乙型流感病毒合成 RNATwist Bioscience103003
IPTGGold BiotechnologyI3481C100
卡那霉素Gibco11815-032
LB 琼脂Fisher ScientificBP1425-500
LB 肉汤培养基Fisher ScientificBP1426-500
溶菌酶Sigma AldrichL6876-10G
氯化镁Sigma Aldrich13152-1Kg
MERS-CoV 合成 RNATwist Bioscience103015
MicroAmp 快速光学 96 孔反应板（带条形码，0.1 mL）Applied Biosystems10310855
Mini-PROTEAN TGX 预制胶Bio-Rad456-1093
质粒小提试剂盒Qiagen27106
Ni-NTA Excel（HisTrap Excel）5 mLCytiva17-3712-06
Ni-NTA HP（HisTrap HP）5 mLCytiva17-5248-02
光学粘合盖片（PCR 兼容，无 DNA/RNase/PCR 抑制剂）Applied Biosystems4311971
氯化钾Fisher BioreagentsBP366-1
引物和探针Integrated DNA Technologies, Inc.
蛋白酶抑制剂小片剂（无 EDTA）Thermo ScientificA32955
蛋白分子量标记Fermentas26616
RT-qPCR 仪（QuantStudio 7 Flex）Applied Biosystems
S.O.C. 培养基Fisher Scientific15544034
SARS-CoV-+A2:C442 合成 RNATwist Bioscience102024
Sf9 昆虫细胞GibcoA35243
氯化钠Sigma AldrichS3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mLCytiva29401323
四环素IBI ScientificIB02200
Tris 碱（分子生物学级）PromegaH5135
Tris-HClAffymetrix22676
Tween 20Sigma AldrichP1379-100ml
X-GalInvitrogenB1690

参考文献

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