我们提供了两种基于探针的自主研发一步法RT-qPCR试剂盒，用于检测常见呼吸道病毒。第一种检测方法针对SARS-CoV-2（N基因）、甲型流感病毒（H1N1和H3N2）以及乙型流感病毒。第二种检测方法针对SARS-CoV-2（N基因）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV，靶标为UpE和ORF1a）。这些检测方法可在任何专业实验室中成功实施。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
导致2019冠状病毒病（COVID-19）的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）对公众健康构成严重威胁。在流感季节，SARS-CoV-2与其他呼吸道病毒的传播可能导致大范围的呼吸系统疾病负担，难以有效管理。因此，在即将到来的秋冬季，需对SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒以及中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）等呼吸道病毒进行严密监测，尤其是SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒，它们在易感人群、传播途径和临床综合征等方面具有相似的流行病学特征。由于这些病毒之间存在相似性，在缺乏靶向特异性检测方法的情况下，区分其感染病例可能具有挑战性。因此，一种灵敏且具有靶向性的多重检测方法，若能简便地区分这些病毒靶标，将对临床医疗工作者具有重要价值。在本研究中，我们开发了一种基于实时逆转录PCR的检测方法，利用自主研发的R3T一步法RT-qPCR试剂盒，可同时检测SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒以及SARS-CoV-2、MERS-CoV。使用低至10拷贝的合成RNA，我们能够以100%的特异性成功同时识别SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒和MERS-CoV的靶标。该检测方法被证实准确、可靠、简便、灵敏且特异性强。所建立的方法可作为优化的SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒以及SARS-CoV-2、MERS-CoV诊断检测手段，广泛应用于医院、医疗中心、诊断实验室以及科研领域。
引言
新型冠状病毒病2019（COVID-19）的全球大流行是由一种名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的新型冠状病毒引起的1。由于SAR-CoV-2具有高度传染性和快速传播能力，COVID-19疫情最初在中国武汉市暴发，并迅速蔓延至全球。这最终导致患者出现呼吸窘迫症状，甚至死亡2,3,4。已有超过213个国家宣布进入COVID-19大流行状态，确诊病例数量预计将急剧上升，多项研究发表的论文已证实了这一趋势3,5。COVID-19主要通过感染者释放到环境中的微小呼吸道飞沫传播，易感人群通过吸入或密切接触被污染的表面而暴露于病毒。当这些飞沫接触到眼睛、口腔或鼻腔的黏膜时，个体可能被感染6。世界卫生组织（WHO）发布的统计数据显示，全球范围内已有超过7600万例确诊病例，死亡人数高达700万7。因此，联合国将由COVID-19疾病引发的大流行归类为灾难，因其直接影响全球数十亿人的生命，并带来了深远的经济、环境和社会影响。
包....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. Taq 聚合酶的表达与纯化
- 构建一个在酶的C末端带有可切割六组氨酸标签的质粒。
- 将50 ng表达载体转化至 E. coli BL21-(DE3)菌株，按照标准操作流程38.
- 将转化后的细胞接种于四个6 L的锥形瓶中，每个锥形瓶含有2 L的2YT液体培养基，在37 °C、170 rpm振荡培养，直至OD600达到0.8或细胞数量达到6.4 × 10⁸个/mL8 达到。
- 用0.5 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导Taq聚合酶表达，并在16 °C下振荡培养18 h。
- 在 4 °C 条件下以 7808 x g 离心收集细胞 g 10 分钟。将沉淀重悬于 200 mL 冰冷的 Taq 聚合酶裂解缓冲液中（表1) 按每克细胞沉淀加入5 mL的量。
- 将细胞与溶菌酶（2 mg/mL 裂解缓冲液）及蛋白酶抑制剂孵育 45 分钟，随后将裂解液通过细胞破碎仪在 30 kPsi 下处理，并在 22,040 x g 条件下离心 g 在 4 °C 下离心 30 分钟以去除细胞碎片。
- 在85 °C下加热上清液15分钟。以95,834 x g离心沉淀 g 4 °C 下孵育 1 小时。收集....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
近年来，利用PCR方法检测常见呼吸道病毒的诊断技术取得了显著进展21,22,23,24,25。然而，尽管取得了这些进展，多重检测方法（即在单次检测中同时检测多种病毒）尚未得到广泛应用，尤其是在RT-qPCR平台上。该方法已通过使用合成RNA病毒及对反应组分进行实验室内部优化而成功实现37。通过检测限分析，该诊断检测方法的特异性、灵敏度和可靠性均被证实较高。本研究所提出的方法可显著提高呼吸道病毒诊断的效率与准确性，减少对多次检测的需求，并降低误诊风险43。未来仍需进一步研究，利用患者样本深入探索该方法的优势，并推动其在临床实践中的应用。
带组氨酸标签的.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
由于SARS-CoV-2、甲型/乙型流感病毒和MERS-CoV变异株等常见呼吸道病毒的广泛传播，导致全球范围内感染率和死亡率居高不下，给医疗保健系统带来了沉重的经济负担12，19，20。出于减轻这一负担的责任感，我们认识到迫切需要一种快速、精确且易于获取的诊断检测方法，例如RT-qPCR，能够在一次检测中区分这些常见病毒。 得益于qRT-PCR的多重检测特性，能够实现对SARS-CoV-2与其他呼吸道病毒（如甲型/乙型流感病毒和MERS-CoV）的鉴别诊断。最终，通过本研究建立的这种多重检测方法，可实现对患者的更优且更精准的治疗46。综上所述，本研究介绍了一种自主研发的一步法多重RT-qPCR检测技术，可针对两种不同的病毒组合进行检测。每种组合均包含三种不同的呼吸道病毒，旨在控制此类传染性病毒的传播，并减轻医疗系统的经济负担。
本多重RT-.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
这项工作由沙特阿拉伯阿卜杜拉国王科技大学的核心资金以及授予 S.M.H. 的国家重大挑战计划（NTGC）资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.45 μm 滤膜杯 | Thermo Scientific | 291-4545 | |
| 10X Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液 | Novex | LC2675 | |
| 6 孔细胞培养板 | Corning | 353046 | |
| 硫酸铵 | Fisher Scientific | A701-3 | |
| 氨苄青霉素 | Corning | 61-238-RH | |
| 阳离子交换柱（HiTrap SP HP）5 mL | Cytiva | 17-1152-01 | |
| D-(+)-生物素，98+% | Thermo Scientific | A14207.60 | |
| DH10Bac 感受态细胞 | Fisher Scientific | 10361012 | |
| 透析袋（Snakeskin，10,000 分子量截留） | Thermo Scientific | 68100 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Thermo Scientific | R0862 | |
| 无 DNase/RNase 蒸馏水 | Ambion | AM9930 | |
| dNTPs | Thermo Scientific | R0192 | |
| E. coli BL21(DE3) 感受态细胞 | Invitrogen | C600003 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| 洗脱缓冲液 | Qiagen | 19086 | |
| ESF 921 昆虫细胞培养基（昆虫细胞培养液） | Expression Systems | 96-001-01 | |
| FBS 溶液 | Gibco | A38400-01 | |
| Fugene（转染试剂） | Promega | E2311 | |
| 庆大霉素 | Fisher Scientific | 15750060 | |
| 甘油 | Sigma Aldrich | G5516-500 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I8896-100ml | |
| 咪唑 | Sigma Aldrich | 56750-1Kg | |
| 甲型流感病毒（H1N1）合成 RNA | Twist Bioscience | 103001 | |
| 甲型流感病毒（H3N2） 合成 RNA | Twist Bioscience | 103002 | |
| 乙型流感病毒合成 RNA | Twist Bioscience | 103003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I3481C100 | |
| 卡那霉素 | Gibco | 11815-032 | |
| LB 琼脂 | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB 肉汤培养基 | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| 溶菌酶 | Sigma Aldrich | L6876-10G | |
| 氯化镁 | Sigma Aldrich | 13152-1Kg | |
| MERS-CoV 合成 RNA | Twist Bioscience | 103015 | |
| MicroAmp 快速光学 96 孔反应板（带条形码，0.1 mL） | Applied Biosystems | 10310855 | |
| Mini-PROTEAN TGX 预制胶 | Bio-Rad | 456-1093 | |
| 质粒小提试剂盒 | Qiagen | 27106 | |
| Ni-NTA Excel（HisTrap Excel）5 mL | Cytiva | 17-3712-06 | |
| Ni-NTA HP（HisTrap HP）5 mL | Cytiva | 17-5248-02 | |
| 光学粘合盖片（PCR 兼容，无 DNA/RNase/PCR 抑制剂） | Applied Biosystems | 4311971 | |
| 氯化钾 | Fisher Bioreagents | BP366-1 | |
| 引物和探针 | Integrated DNA Technologies, Inc. | ||
| 蛋白酶抑制剂小片剂（无 EDTA） | Thermo Scientific | A32955 | |
| 蛋白分子量标记 | Fermentas | 26616 | |
| RT-qPCR 仪（QuantStudio 7 Flex） | Applied Biosystems | ||
| S.O.C. 培养基 | Fisher Scientific | 15544034 | |
| SARS-CoV-+A2:C442 合成 RNA | Twist Bioscience | 102024 | |
| Sf9 昆虫细胞 | Gibco | A35243 | |
| 氯化钠 | Sigma Aldrich | S3014-1Kg | |
| StrepTrap XT 5 mL | Cytiva | 29401323 | |
| 四环素 | IBI Scientific | IB02200 | |
| Tris 碱（分子生物学级） | Promega | H5135 | |
| Tris-HCl | Affymetrix | 22676 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-100ml | |
| X-Gal | Invitrogen | B1690 |
参考文献
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
- Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
- Huang, C., <....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
