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使用数字显微镜研究细胞死亡的启动

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DOI：

10.3791/65824

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2023年11月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Institute of Biology, 2University of Nova Gorica

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过在诱导细胞死亡后连续成像接种叶片来研究程序性细胞死亡起始速率的实验方案。

摘要

超敏反应（HR）介导的抗性是一种有效的防御反应，可由N抗性基因决定。HR的表现为在接种叶片上形成细胞死亡区域。本文介绍了一种利用数码显微镜对接种叶片在细胞死亡起始至可见细胞死亡出现之间的时间段进行成像，以研究细胞死亡起始速率的实验方案。数码显微镜可实现按设定时间间隔连续成像，从而能够精确到分钟级别地确定细胞死亡的起始时间，相较传统方法以小时为单位的精度显著提高。此外，数码显微镜成像不受光照条件影响，因此可在白天和夜间连续使用，不会干扰植物的昼夜节律。该方案经少量修改后，也可用于研究其他导致程序性细胞死亡发展的病理系统。总体而言，该方案实现了对细胞死亡起始速率的简便、准确且低成本的鉴定。

引言

马铃薯是全球种植最广泛的粮食作物之一，产量仅次于水稻、小麦和玉米，位居第四。然而，马铃薯的生产常受到马铃薯Y病毒（PVY）的严重影响，目前PVY被认为是马铃薯最重要的病毒病原体1,2。在Rywal品种的马铃薯植株中，多种PVY株系（包括PVY N-Wilga株系）可触发由超敏反应（HR）介导的抗性，该抗性表现为病原体被限制在侵染位点，并在接种叶片上形成坏死病斑3。在此病理系统中，HR由Ny-1抗病基因介导，且具有温度依赖性：在较低温度下生长的植株能有效形成坏死病斑；而在持续高温（28 °C）条件下生长的植株，则表现为抗性中止，即不形成病斑并出现病毒的系统性扩散3,4。当植株被转移至较低温度（22 °C）时，细胞死亡过程被启动，这一特性可用于通过成像技术监测接种叶片在细胞死亡启动至可见坏死出现期间的细胞死亡发生速率。

本实验方案展示了一种利用数码显微镜测定细胞死亡起始速率的简便方法。通过将植物从28 °C转移至22 °C后对已接种的叶片进行成像，数码显微镜可在设定的时间间隔内对叶片进行连续观察。与其它方法（例如共聚焦显微镜或肉眼观察病斑形成）相比，该方法能够精确确定病斑形成的时间，从而将细胞死亡起始速率的测定精度提高至分钟级别，而前述其他方法的精度通常仅为小时级别5,6。数码显微镜的使用不受光照条件限制，因此可在白天和夜间持续使用。若所用植物为转基因植株，且其特定组分的表达水平发生改变，则本方案还可用于鉴定参与细胞死亡起始的组分，或确定不同组分对细胞死亡起始速率的影响。

方案

注意：第1和第2部分描述了一种基于Lukan等7所述方法改进的植物材料制备方案。具体而言，对受控环境条件和接种物制备进行了一些修改。

1. 培养马铃薯植株

  1. 在无菌条件下，使用无菌镊子和解剖刀，在无菌纸上从马铃薯品种 Rywal 植株上切取含有节的 1 cm 长外植体，进行茎节组织培养8。
  2. 6–8 周后，从马铃薯植株上切取十个含节的 1 cm 长外植体，置于无菌纸上的无菌条件下操作。
  3. 将外植体转移至含有 Murashige 和 Skoog（MS30）培养基的塑料盒中（图 1A），并在受控环境条件下培养（光照下 22 °C，黑暗中 19 °C，光照强度为 250 µE 或 µmol/m2/s ，光周期为 16 小时，相对湿度为 55% ± 5%）。
  4. 微繁殖后 2 周，将植株移栽至土壤中。
    1. 将花盆（半径 r = 10 cm）装满土壤。用手指在花盆中央的土壤中挖一个深 3–4 cm 的小孔，向孔中注水，并等待水分完全吸收。
    2. 每个花盆中放入一株植株，使叶片位于土壤表面以上，轻轻用土壤覆盖根部（图 1B）。
      注意：部分植株可能未形成根系。此类植株应排除在分析之外。
  5. 将植株种植于土壤中，并在生长室内的受控环境条件下继续培养（光照下 22 °C，黑暗中 19 °C，相对湿度为 55% ± 5%，光照强度为 250 µmol/m2/s ，光周期为 16 小时）。
  6. 3–4 周后，植株即可用于接种。
    注意：植株应至少具有 3–4 片完全展开的叶片，且小叶清晰可见（图 1C）。植株应生长健康，无任何可见症状（如黄叶或褐叶），以免与马铃薯 Y 病毒（PVY）引起的病斑混淆。为获得可比结果，所有实验中的植株应在同一时间点接种（例如上午 9 点），以避免昼夜节律对植物免疫反应和病斑形成可能产生的影响9,10,11。

2. 接种物制备与马铃薯接种

  1. 接种PVY N-Wilga株系至植物 (PVYN-Wi；登录号 EF558545）接种物，具体如下所述。
    注意：若有多个数字显微镜，可同时平行接种更多植株。接种前，植株应至少具有三片完全展开的叶片。图1C）。PVYN-Wi 在马铃薯品种Pentland中进行增殖和培养。
    1. 制备用于接种的磷酸盐缓冲液（添加二乙基二硫代氨基甲酸钠，DIECA）：取1.3 mL 0.2 M NaH₂PO₄溶液与8.7 mL 0.2 M Na₂HPO₄溶液混合，加入0.1 g DIECA，用去离子水定容至100 mL，充分溶解后于4°C保存备用。2PO4，8.7 mL 的 0.2 M Na2HPO4，以及0.225 g的DIECA。用ddH₂O定容至100 mL。20. 加入1 M NaOH或1 M HCl溶液，调节pH至7.6。
    2. 收获6至8周龄的PVYN-Wi 从组织培养的感病马铃薯品种Pentland植株中取样（每6株取0.5 g），放入带滤网的提取袋中，加入含DIECA的磷酸盐缓冲液（按植物材料质量：体积比为1:4）。使用手持式匀浆器匀浆1–2分钟，以获得均一溶液。
    3. 用碳化硅粉末轻轻摩擦3-4周龄马铃薯植株（来自步骤1.6）最下面三片完全展开的叶片。
      注意：调整碳化硅粉末的用量。用量过多可能导致组织损伤，而过少则可能导致侵染效果不佳。最佳用量为每平方厘米0.1 mg碳化硅粉末，即每片中等大小叶片（约15 cm²）使用约1.5 mg粉末。2).
    4. 用接种物轻轻摩擦叶片（每片叶片约 100 µL）。10 分钟后，用自来水彻底冲洗叶片。
      1. 注意不要损伤叶片。不要超过孵育时间。根据叶片大小调整接种量——每平方厘米接种6.5 µL，即平均大小叶片（约15 cm）每片接种约100 µL。2).
    5. 将植株转移至人工气候室，在受控环境条件下培养（光照和黑暗温度均为28 °C，相对湿度为55% ± 5%，光照强度为250 µmol/m²/s，光照周期为16小时光照/8小时黑暗）。2/s 辐射和16小时光周期）培养3天。

3. 植物材料准备及利用数码显微镜记录病害发展

  1. 接种后3天，将接种过的植株从保持在28 °C的培养室转移至22 °C的培养室，其他条件同步骤1.5所述。
  2. 选择一株植物进行观察。使用胶带固定第二片接种的叶片（图1D）。在开始成像之前，确保目标叶片已完全固定不动图1D).
  3. 在笔记本电脑上安装图像采集软件应用程序。将数字显微镜连接至计算机。打开该软件。
    注意：确保将植物、数码显微镜和笔记本电脑放置在靠近电源插座的架子上，以便连接电脑电源。选择需要监测的叶片时，应根据所研究的生物学问题来决定，例如导致有限程序性细胞死亡的特定过程类型。
  4. 调整显微镜至固定好的叶片上方。使用数字显微镜上的调焦旋钮（如图所示）进行对焦。 图1E).
    1. 确保视野尽可能宽阔，以提高捕获病灶形成过程的几率，同时保持足够的放大倍数以便观察到病灶的出现（通常使用25倍放大）。
  5. 设置相机参数。单击 设置 图像右上角的按钮（图2A，圈出部分1）并调整相机设置： 亮度 (60-70), 对比 (10-15), 色调 (0), 白平衡，饱和度 (45-50), 锐度 (0), 伽马 (5) (图2B）。本研究中使用的设置如下： 亮度 (64), 对比 (14), 色调 (0), 饱和度 (47), 锐度 (0), 伽马 (5).
    注意：应根据室外光线调整相机设置，以确保最佳图像质量。可根据用户在生长室内的具体条件对设置进行相应调整。
  6. 通过单击图标来设置图像采集参数 图像采集 (图 2C，圈出部分2）。点击按钮 延时视频 并设置 图像采集 每15分钟一次，持续24小时（图2C).
    注意：拍摄图像的时间间隔和成像持续时间完全可调，可根据实验需求进行调整。在图像采集间隔期间，LED 灯处于关闭状态；在图像采集过程中，LED 灯会自动开启。
  7. 点击开始图像采集 开始 按钮（图 2C).
    注意：将植物从 28 °C 转移至 22 °C 后，应在 24 小时内开始出现病斑。若未出现病斑，可能表明接种效果不佳。此时应调整碳化硅粉末的用量，确保接种物在叶片上的孵育时间正确，并通过 qPCR 检测接种物中病毒的丰度。
  8. 要保存图像，请选择所有图像并点击 保存 图标图2B，圈出部分3）。设置 导出选项. 将DPI设置为最高值（300）（图2D）。保存后，删除程序中的所有图片。
  9. 对于图像分析，任何可用于图像查看/编辑的程序均足够。以下将说明如何使用免费的图像编辑软件 ImageJ。
    1. 从单个视野导入图像的时间序列（在左上角点击） 文件，选择 导入，然后 图像序列）。粘贴已保存图片的目录路径，然后按 好的 单击按钮以开始转换。
    2. 转换完成后，软件将自动打开内置视频播放器，显示最终视频。通过点击导出视频文件 文件 > 保存为 选项并选择 AVI 格式. 一个小窗口会打开。设置 帧率 以 0.3 fps 按下并按住 好的 将视频保存为 AVI 视频文件。
      注意：病灶出现时间也可通过手动检查所有图像并找到病灶首次显现的图像来确定。

结果

本研究展示了一种利用数码显微镜通过观察土豆品种Rywal的病灶发生来研究细胞死亡起始的逐步实验方案。该方法可用于确定程序性细胞死亡起始的精确时间。

在马铃薯品种Rywal进行微繁殖2周后，已生根的植株被移栽至土壤中（图1A，B）。在所述条件下生长3-4周后，选取具有至少3-4片完全展开、小叶清晰可见、外观健康且无脱落迹象的叶片的植株用于后续分析（图1C）。根据本实验方案所述，使用数码显微镜对已接种叶片的同一区域每15分钟观察一次，以确定病斑出现及随时间扩展的情况（图3）。病斑于15小时30分钟时出现（图3）。

植物生长阶段和显微镜设置；微繁殖、生长测量、叶片检查。
图1：使用数码显微镜进行分析的植物准备。（A）含有节点的马铃薯品种Rywal外植体置于MS 30培养基的塑料盒中。（B）土壤中的马铃薯品种Rywal植株（微繁殖后2周）。（C）准备接种的马铃薯品种Rywal植株（移栽至土壤后4周），具有至少三片完全发育的叶片。（D）马铃薯品种Rywal植株的第二片接种叶片（箭头所示），用胶带固定（箭头所示）。（E）植株置于数码显微镜下，箭头指向用于对焦的旋钮。请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜软件界面、相机调节和导出设置；数字图像分析。
图 2：记录病灶发育的数字软件设置。（A）软件界面——红色圆圈标注了以下按钮选项：（1）相机设置，（2）图像捕获设置，以及（3）保存图像。（B）相机设置窗口，点击面板 A 中的（1）即可打开。应适当调整亮度、对比度、饱和度、锐度和伽马值。（C）图像捕获设置窗口，点击面板 A 中标注的（2）即可打开。（D）图像保存设置窗口，点击面板 A 中标注的（3）即可打开。请点击此处查看此图的放大版本。

不同条件下叶片表面的显微镜图像；突出显示损伤进展过程。
图3：在数字显微镜下观察接种叶片上的病斑形成。在28 °C下培养3天的PVY接种马铃薯叶片中心区域在数字显微镜下以23.6倍放大倍数拍摄的图像，拍摄间隔为5分钟。接种植株于第3天转移至22 °C开始观察，起始时间为7:00。（A）21:02时，病斑尚不可见；（B）90分钟后，即22:32，病斑已可见；（C）次日01:02观察到病斑扩展；（D）次日07:32的图像。该实验重复两次，病斑分别在细胞死亡启动后8小时15分钟和12小时出现。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

本实验方案通过数字显微镜对接种叶片在细胞死亡起始至细胞死亡显现之间的时间段进行连续成像，使研究者能够准确测定细胞死亡的起始速率。尽管已有多种方法可用于监测病斑及植物病害的发生12,13,14,15，但本方案的优势在于可在不干扰植物昼夜节律的前提下进行无需光照的测量，因为在两次测量之间可关闭光源。

接种后，植物应在 28 °C 下生长 3 天。Ny-1 抗性基因可诱导产生过敏反应，该反应具有温度依赖性；在较高温度下生长的植物中，抗性反应会中止，表现为无法形成病斑并出现病毒的系统性扩散3。当植物转移至 22 °C 后，细胞死亡即被启动，因此为了获得准确结果，应在转移后尽快开始使用数码显微镜进行观察。植物成像前准备的另一个关键步骤是叶片的固定（图 1D），因为在成像过程中植物会持续生长，可能导致被观察的叶片移出焦平面，从而无法获得理想的结果。

如果将所述方案用于研究参与细胞死亡起始过程的、其组分发生改变的转基因植物，则该方案可使使用者确定所研究组分水平的降低是否会影响细胞死亡起始的速率。由此，可在发生程序性细胞死亡的病理系统中，利用本方案鉴定参与细胞死亡起始的相关组分。其他用于鉴定这些组分的方法包括例如转录组学分析（如RNA-seq ）或各种形式的显微镜技术，但这些方法可能成本较高且耗时较长16。本方案所描述的方法通过观察转基因植物与对照植物之间细胞死亡起始速率的差异，能够简便且低成本地鉴定参与细胞死亡起始的组分。在理想条件下，此类实验应同时使用两台数码相机，以便在同一实验中平行分析转基因植物和对照植物。

本方案中使用了马铃薯Y病毒（PVY）N-Wilga株系；然而，该病毒的其他株系，例如绿色荧光蛋白标记的PVY（PVY-N605(123)-GFP）7，也可用于此方法。此外，其他可诱导程序性细胞死亡的病害系统也可通过对此方案进行微小修改后加以研究。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢 Barbara Jaklič 对本研究的贡献。 技术协助。本研究由斯洛文尼亚研究与创新署资助（研究核心资金编号 P4-0165 及项目 Z4-3217：解析马铃薯抗病毒过程中氧化还原相关信号通路的相互关联性）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酒精灯Mikro+PoloSH-234002455用于镊子和手术刀的灭菌
高压灭菌器 A-21 CAVKambifigure-materials-1N/A
Bacto 琼脂Becton, Dickinson and Company214010
碳化硅粉末VWR Chemicals22505297
DinoCapture 2.0 Dino-Lite版本 2.0数码显微镜软件
Dino-Lite Edge AM7915MZTL 数码显微镜AnMo Electronics CorporationAM7915MZTL
70% 乙醇Stella TechP94000用于镊子和手术刀的灭菌
提取袋Bioreba420100
生长室 FS-WIPhoton Systems InstrumentsN/A
手动匀浆器Bioreba400010
Hawita 特制基质HAWITA Gruppe2000000071701即用型基质，由泥炭（H4-H6 和 H6-H8）制成
盐酸（HCl）Merck109057
标签胶带SigmaL8144-5EA
安装有 DinoCapture 2.0 软件的笔记本电脑HPZ2V77EA#BED实验在生长室内进行，因此计算机需便于移动
Murashige 和 Skoog 培养基Duchefa BiochemieM02220100
Na2HPO4Emsure1065860500
NaH2PO4Emsure1064700250
0.5 mL 巴斯德吸管 Brand21500209
pH 计Mettler ToledoML1601
塑料盒 Cvetlice DornigVCG10.5半径 = 10.5 cm
塑料花盆 Lab AssociatesDIS40003上部半径 = 11.5 cm，底部半径 = 9.8 cm
蔗糖Kemika d.d.1800408
二乙基二硫代氨基甲酸钠（DIECA）Sigma-Aldrich228680三水合二乙基二硫代氨基甲酸钠，ACS 级试剂
氢氧化钠（NaOH）Merck106462
无菌外科刀片Braun4511733633
镊子BraunBD033R

参考文献

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