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ABCG5/G8 在脂质双层胶束环境中的X射线晶体学结晶

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DOI：

10.3791/65828

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2023年8月25日

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1Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine, University of Ottawa, 2Department of Biochemistry, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

本文内容

摘要

本方案描述了一种用于甾醇转运蛋白ABCG5/G8结晶的实验设置。将ABCG5/G8重组到双层脂质盘（bicelles）中，用于悬滴法结晶。该方案无需特殊材料或底物，因此可在任何实验室中便捷地采用和调整，以通过X射线晶体学方法测定蛋白质结构。

摘要

ATP结合盒（ABC）转运蛋白是一类嵌入脂质中的膜蛋白。通常使用去垢剂将这些膜蛋白从脂双层提取到水相环境中。去垢剂可破坏脂双层结构并使膜蛋白溶解。由于膜蛋白的天然环境位于脂双层内，因此在溶液中维持其稳定性和均一性以进行结构表征具有挑战性。双层脂质小片（bicelles）由长链与短链磷脂以及去垢剂混合组成，能够模拟天然脂质结构。利用脂质bicelles和去垢剂可作为合适的模型系统，用于获得高质量的衍射晶体，特别是用于解析膜蛋白的高分辨率结构。通过这些人工构建的微环境，膜蛋白能够保持其天然构象和功能，从而促进三维晶体的形成。在本方法中，经去垢剂溶解的异源二聚体ABCG5/G8被重新整合至含胆固醇的DMPC/CHAPSO bicelles中，并应用于气相扩散法蛋白质结晶实验。

引言

ATP结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白是一类膜蛋白超家族，负责介导生物膜上多种依赖ATP的转运过程1,2,3,4,5。这些转运蛋白与心血管疾病密切相关，并在促进胆固醇向胆汁转运以实现肝脏后续排泄过程中发挥重要作用。因此，多年来胆固醇代谢与平衡机制受到广泛关注6。人体内胆固醇及其他甾醇排出的一种特定机制涉及ABCG亚家族成员，尤其是异源二聚体ABCG5/G87,8,9,10。这两个基因中任意一个发生突变均会破坏异源二聚体结构，导致功能丧失，从而引发植物固醇血症（sitosterolemia），即一种影响固醇转运的疾病11,12,13。鉴于该疾病的重要性以及这些蛋白在促进胆固醇外排中的作用，固醇转运蛋白已引起广泛关注。然而，其分子机制和底物选择性的精细细节在很大程度上仍不明确。因此，解析ABCG5/G8的晶体结构是深入理解胆固醇转运机制及其下游功能的关键一步。

膜蛋白需要锚定在膜内才能正确折叠并发挥功能。因此，将膜蛋白从其天然环境中提取出来通常会导致蛋白不稳定、错误折叠以及功能丧失14,15。这些挑战凸显了膜蛋白结晶过程中面临的主要障碍。然而，将蛋白重构到合成去垢剂双分子层（如bicelle）中已成为解决这一难题的有效策略，使膜蛋白能够在类似天然的双分子层环境中得以维持16。bicelle是由合成磷脂和去垢剂在水中悬浮并溶解形成的组装结构，其显著特征是具有模拟生物膜的双分子层结构16,17,18。bicelle可根据温度和黏度在液相与凝胶相之间发生转变。bicelle结晶利用低温下形成的较小双分子层圆盘和较低黏度，促进蛋白溶液与bicelle溶液的充分混合。bicelle的尺寸取决于制备过程中去垢剂与脂质的比例19,20。目前常用于形成bicelle的去垢剂包括3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙磺酸盐（CHAPSO）、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐（CHAPS）以及1,2-二十三酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DHPC）21。这些去垢剂通常与二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱（DMPC）和1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱（POPC）等脂质联合使用。此外，近期研究表明，在生理条件下，膜蛋白在bicelle中仍能保持完全功能。例如，Lee及其同事成功基于脂质双分子层对ABCG5/ABCG8进行了结晶，并报道了其晶体结构22,23。在结晶过程中，蛋白-bicelle混合物可使用标准设备进行操作，包括高通量结晶机器人24。然而，bicelle的应用可行性在很大程度上取决于蛋白的热稳定性，因为结晶过程需在较高温度下进行。尽管如此，与其他技术相比，膜蛋白结晶所需的条件总体较为温和，通常仅涉及低浓度的沉淀剂、盐类和缓冲液。这使得蛋白-bicelle混合物结合蒸汽扩散法成为膜蛋白结构研究中高效且易于实施的工具。

本方案概述了制备蛋白质和微晶晶体以确定ABCG5/G8高分辨率X射线晶体结构的关键步骤（图1）。

方案

1. 克隆与蛋白表达

  1. 将人ABCG5/G8基因克隆到 Pichia pastoris 酵母，遵循先前的方案25,26简而言之，从pPICZB载体衍生出pSGP18和pLIC表达载体。在ABCG8 cDNA的C末端添加一段编码鼻病毒3C蛋白酶切割位点及钙调蛋白结合肽（CBP）的标签（pSGP18-G8-3C-CBP）。
    1. 添加一个由甘氨酸分隔的六组氨酸标签（His6GlyHis6) 连接到 ABCG5 cDNA 的 C 末端（pLIC-G5-H12）。将质粒共转化进入 毕赤酵母 使用电穿孔法转化KM71H菌株。
      注意：请参见 材料表 有关所用质粒、培养基和缓冲液的详细信息。
    2. 在28 °C下于MD琼脂平板上培养转化的酵母细胞。
  2. 1-2 天后，挑选 10-12 个菌落，接种于含有 10 mL 最小甘油酵母氮源基础（MGY）培养基的 50 mL 离心管中，进行小规模培养。
    1. 在离心管盖上打三个小孔以改善通气。将细胞置于28 °C、250 rpm持续振荡培养，直至600 nm处的光密度（OD600）达到10，通常需要培养1至2个过夜时段。
      注意：细胞生长通常需要12-24小时。
  3. 第二天，取1 L无菌MGY培养基，接种至2.4 L锥形瓶中的初级培养物中。将锥形瓶置于摇床培养箱中，在28 °C、250 rpm条件下振荡培养24 h。
    1. 为维持 pH 在 5–6 之间，加入 10% 氨水（NH₄OH）4OH）直至 pH 值稳定。
  4. 调节pH值，并通过每升培养物加入1 mL纯甲醇（0.1% (v/v) 甲醇）诱导蛋白表达。
    注意：每12小时向培养物中添加5 mL纯甲醇（终浓度为0.5 % (v/v) 甲醇），持续诱导36–48小时。
  5. 通过在15,000 x g下离心收集细胞 g 4 °C 下孵育 30 分钟。
  6. 收集细胞沉淀，用裂解缓冲液（0.33 M 蔗糖，0.3 M Tris-Cl pH 7.5，0.1 M 氨基己酸，1 mM EDTA 和 1 mM EGTA）重悬至浓度为 0.5 g/mL。将悬液于 -80 °C 保存。通常，每 1 L 培养细胞可收获 30 ± 5 g 细胞湿重。
    ​注意：将细胞沉淀直接储存于冷冻箱中，或立即用裂解缓冲液重悬，用于膜制备。

2. 微粒体膜的制备

  1. 解冻细胞并加入蛋白酶抑制剂（2 µg/mL 亮抑蛋白酶肽，2 µg/mL 胃蛋白酶抑制剂A，2 mM PMSF，参见材料表）。
    1. 为进一步裂解细胞，使用预冷至冰温的乳化器或微流化器（参见材料表），压力设置为25,000–30,000 psi，重复此过程3–4次。
    2. 离心去除细胞碎片：先在4 °C下以3,500–4,000 × g 离心15分钟，随后在4 °C下以15,000 × g 再次离心30分钟。
  2. 为分离微粒体膜囊泡，将上清液转移至超速离心管中，在4 °C下以200,000 × g 超速离心1.5小时。
    1. 使用Dounce匀浆器将膜沉淀物重悬于50 mL缓冲液A（50 mM Tris-Cl pH 8.0，100 mM NaCl，10%甘油）中。将悬浮液储存于-80 °C。

3. 蛋白质制备——异源二聚体的纯化

  1. 解冻冷冻的微粒体膜，并用溶解缓冲液将浓度调整至4-6 mg/mL。缓冲液应包含50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、100 mM NaCl、10%甘油、1%（w/v）β-十二烷基麦芽糖苷（β-DDM）、0.5%（w/v）胆酸盐、0.1%（w/v）胆固醇半琥珀酸酯（CHS）、5 mM咪唑、5 mM β-巯基乙醇（β-ME）、2 µg/mL亮抑酶肽、2 µg/mL胃蛋白酶抑制剂A和2 mM PMSF（参见 材料表).
    注意：可将膜制备物与溶解缓冲液等体积混合，或使用不含蛋白酶抑制剂和还原剂的2倍浓度溶解缓冲液。短暂煮沸缓冲液有助于高效溶解胆固醇硫酸钠（CHS）。用于纯化时，仅使用4 °C预冷的缓冲液。
    1. 在 4 °C 条件下以中等速度搅拌混合物 1 小时，随后在室温（RT）下继续搅拌 20–30 分钟。
    2. 将混合物在 1,00,000 x g 条件下离心 g 在 4 °C 下孵育 30 分钟，以去除不溶性膜成分。收集可溶性上清液，并加入 20 mM 咪唑和 0.1 mM TCEP。
  2. 进行亲和柱层析26：将溶解后的上清液与预平衡的 Ni-NTA 珠（10–15 mL）结合（参见 材料表在缓冲液A（步骤2.2.1）中过夜。
    注意：从此步骤开始，运行缓冲液中应避免使用甘油。
    1. 用含 25 mM 咪唑的缓冲液 B（50 mM HEPES，pH 7.5，100 mM NaCl，0.1 % (w/v) β-DDM，0.05 % (w/v) 胆酸盐，0.01 % (w/v) CHS，0.1 mM TCEP）洗涤柱两次，每次使用 10 倍柱体积的缓冲液。
    2. 用含有 50 mM 咪唑的 Buffer B 洗涤层析柱，洗脱体积为 10 个柱体积。
    3. 使用缓冲液C（含200 mM咪唑的缓冲液B）洗脱蛋白质。
    4. 加入1 mM TCEP（参见 材料表）和 10 mM MgCl2 到洗脱的蛋白质。
    5. 在SDS-PAGE凝胶上验证洗脱组分，以确认蛋白大小正确26.
      注意：典型的蛋白质产量（1st Ni-NTA：每6升培养物可获得10–20 mg蛋白质。使用DDM的浓度为其临界胶束浓度（CMC）的10倍或5倍，约为0.01%。本方案采用0.1%的DDM。
    6. 用等体积的缓冲液 D1（缓冲液 B 加 1 mM CaCl₂）稀释 Ni-NTA 洗脱的峰组分2，1 mM MgCl2），混合后将蛋白组分上样至CBP柱（3-5 mL）（参见 材料表) 已用CBP洗涤缓冲液D1预平衡的
    7. 使用缓冲液 D1 和 D2（含 1 mM CaCl₂ 的缓冲液 B）对 CBP 柱进行连续洗涤以更换去垢剂2，1 mM MgCl2，0.1% (w/v) 十烷基麦芽糖新戊二醇（DMNG），不含 β-DDM）：第一步，用 3 个柱体积的 D1 洗脱；第二步，用 3 个柱体积的 D1:D2（3:1，v/v）洗脱；第三步，用 3 个柱体积的 D1:D2（1:1，v/v）洗脱；第四步，用 3 个柱体积的 D1:D2（1:3，v/v）洗脱，随后用 6–10 个柱体积的 D2 洗脱。
    8. 使用含300 mM NaCl的CBP洗脱缓冲液D2，以1 mL流份从CBP柱中洗脱蛋白（共10 mL）。将收集的洗脱流份浓缩至1–2 mL。
      注意：典型的蛋白质产量（1st CBP 的产量为每 6 L 培养液中 5–15 mg 蛋白质。麦芽糖新戊二醇（MNG）类去垢剂可增强纯化后蛋白质在 4 °C 下的储存稳定性。本研究中使用了 DMNG 和月桂基麦芽糖新戊二醇（Lauryl MNG，LMNG），其中 DMNG 获得了更适合 X 射线衍射的晶体。建议使用 DMNG 浓度为其临界胶束浓度（CMC）的 10–20 倍，约为 0.003%。本方案中采用的 DMNG 浓度为 0.1%。部分 CBP 洗脱组分可进一步通过凝胶过滤色谱法（步骤 4.4）进行纯化，用于分析蛋白质的 ATP 酶活性，或通过透射电子显微镜（TEM）评估其单分散性。

4. 蛋白质制备——结晶前处理

  1. 使用内切糖苷酶 H（Endo H，约 0.2 mg 每 10–15 mg 纯化蛋白）和 HRV-3C 蛋白酶（约 2 mg 每 10–15 mg 纯化蛋白）分别切割 N-连接聚糖和 CBP 标签（参见 材料清单4 °C 条件下孵育过夜。
  2. 在进行内切酶H和3C蛋白酶孵育的同时，对合并的蛋白质进行还原烷基化处理。首先加入20 mM碘乙酰胺孵育（参见 材料表) 在4 °C下孵育过夜。随后在冰上加入额外的2 mM碘乙酰胺，继续孵育1小时。
    注意：此步骤可使蛋白质在 4 °C 下稳定保存长达一个月。
  3. 使用第二个CBP柱（1-2 mL）分离切割后的CBP标签，此过程使用Buffer D2。
    注意：典型的蛋白质产量（2nd CBP 的产量为每 6 升培养液 5-10 毫克蛋白。
  4. 使用凝胶过滤层析纯化无 CBP 标签的蛋白。缓冲液应包含 10 mM HEPES（pH 7.5）、100 mM NaCl、0.1% (w/v) DMNG、0.05% (w/v) 胆酸钠和 0.01% (w/v) CHS。
    注意：典型的蛋白产量（凝胶过滤）为每6 L培养液获得2–8 mg蛋白。在此步骤中，凝胶过滤过程中十二烷基β-D-麦芽糖苷（DDM）峰（约65 kD）的缺失表明去垢剂已成功置换为十二烷基-β-D-麦芽糖苷新戊二醇（DMNG）。
  5. 通过还原性甲基化修饰混合的蛋白质组分：加入 20 mM 二甲基胺硼烷（DMAB，参见 材料表）和40 mM甲醛加入蛋白质中，在4 °C振荡摇床上孵育2小时。加入10 mM DMAB。
    1. 重复步骤4.5，包括加入10 mM DMAB，并在4 °C下孵育过夜（12–18 h）。
    2. 加入 100 mM Tris-Cl（pH 7.5）以终止反应。
  6. 将甲基化的蛋白质上样至预先用100 mM Tris-Cl（pH 8.0）和100 mM NaCl平衡的2 mL Ni-NTA柱。
    1. 使用洗涤缓冲液（10 mM HEPES，pH 7.5，100 mM NaCl，含0.5 mg/mL DOPC:DOPE（3:1，w/w）、0.1%（w/v）DMNG、0.05%（w/v）胆酸盐、0.01%（w/v）CHS）洗涤柱体，体积为10个柱体积。
    2. 使用洗脱缓冲液（10 mM HEPES，pH 7.5，100 mM NaCl，200 mM 咪唑，0.5 mg/mL DOPC:DOPE（1:1，w/w），0.1%（w/v）DMNG，0.05%（w/v）胆酸盐，0.01%（w/v）CHS）洗脱复脂化的蛋白。
      注意：典型的蛋白质产量（2nd Ni-NTA）每6升培养物可获得1-5毫克蛋白。
    3. 将蛋白洗脱液通过已用第4.4步缓冲液预平衡的PD-10脱盐柱。
  7. 将脱盐并重新脂化的蛋白质与胆固醇（溶于异丙醇或乙醇中）在终浓度约为 20 µM 的条件下过夜孵育。
    1. 次日早晨，通过在 150,000 × g 条件下超速离心去除沉淀物 g 4 °C下离心10分钟。收集上清液。
    2. 使用截留分子量为100 kDa的离心浓缩器将蛋白质浓缩至终浓度为30–50 mg/mL。
    3. 使用台式冷藏离心机在4 °C条件下以最高转速离心30分钟，去除沉淀物。
    4. 将上清液置于冰上，4 °C 保存，并在bicelles中建立结晶条件。
      ​注意：浓缩后的蛋白质应在一周内用于晶体生长。切勿冷冻蛋白质。

5. 在bicelle中进行蛋白质结晶

  1. 使用DMPC脂质和CHAPSO去垢剂按3:1（w/w）比例制备10%的bicelle储存溶液（参见材料表）。
    注意：CHAPSO的使用浓度为其临界胶束浓度（CMC）的5倍，约为0.5%。这可使蛋白-bicelle混合液中的去垢剂浓度维持在其CMC附近（步骤5.2）。
    1. 将溶于去离子H2O的去垢剂（CHAPSO）加入预先干燥的脂质中（脂质组成为5 mol%胆固醇和95 mol% DMPC）。
      注意：在氯仿中配制不同组成的脂质混合物，使用氮气流在室温下于玻璃试管中吹干。随后将样品置于真空室中过夜以去除残留溶剂，形成一层薄脂膜。
    2. 使用水浴超声仪重新悬浮脂质和去垢剂。
    3. 在冰浴冷却的水中，以连续功率对bicelle混合物进行超声处理，直至溶液变为透明。
      注意：操作时应佩戴听力保护装置，并确保有足够的冰以维持混合物处于液态。
    4. 使用0.2 µm离心滤膜去除未溶解成分（参见材料表）。
      注意：将分装后的bicelle溶液储存于-80 °C。
  2. 在冰上将10%的bicelle溶液（步骤5.1.4）与蛋白溶液（步骤4.7.4）按1:4（v/v）比例轻柔混合，制备蛋白/bicelle混合液，最终蛋白浓度为5–10 mg/mL。
  3. 将蛋白与bicelle混合液置于冰上孵育30分钟。
  4. 采用悬滴气相扩散法，在48孔板中设置结晶条件。
    1. 取等体积（0.5或1 µL）的蛋白/bicelle混合液与含有1.6 M–2.0 M硫酸铵、100 mM MES（pH 6.5）、0%–4% PEG 400和1 mM TCEP的结晶储液混合（参见材料表）。
      注意：每次实验前应预先构建储液的矩阵，调整硫酸铵（1.6–2.0 M）和PEG 400（0%–4%）的浓度。
    2. 在20 °C条件下孵育以促进结晶。
    3. 次日检查结晶板，确保盖玻片密封良好。
    4. 每天至少监测一次晶体生长情况。高质量晶体通常在1–2周内出现，尺寸约为50–150 µm × 20–50 µm × 2–5 µm。
      注意：在较低蛋白浓度下，晶体形成可能需要更长时间。成熟晶体应在一个月内收获。
    5. 将蛋白晶体浸泡于0.2 M丙二酸钠溶液中，并使用50或100 µm冷冻环在液氮中快速冷冻。
      注意：若有X射线衍射仪，可选取数颗晶体进行15–30分钟X射线照射测试，以获得分辨率达约5 Å的衍射数据。更高分辨率的衍射需使用同步辐射光源。使用0.2 M丙二酸钠作为冷冻保护剂时，一颗尺寸为100 µm × 50 µm × 2 µm的晶体在同步辐射X射线下可获得约90帧衍射图像。

结果

重组ABC半转运蛋白人ABCG5和ABCG8在毕赤酵母（Pichia pastoris）中共同表达。随后通过离心法对酵母膜组分进行分级分离。如本方案所述，利用串联柱层析技术提取异源二聚体蛋白。接着，将经过化学预处理的蛋白与磷脂/胆固醇双层微盘（bicelles）共孵育以诱导结晶。纯化与结晶过程的示意图见图1。

为评估纯化后蛋白质的单分散性，将含有 0.01–0.05 mg/mL 蛋白质的样品用 1%–2% 醋酸铀酰染色，并通过负染透射电镜进行观察（图 2A）。为了在不经历冻融循环的情况下评估蛋白质的稳定性，采用分析型凝胶过滤色谱法。该分析通过使用小体积、等量的蛋白质分装样品，监测纯化蛋白质在储存过程中的时间进程变化（图 2B）。在 4 °C 下孵育一周后，主峰组分中的蛋白质含量可能出现轻微下降，这可能是由于残留的可溶性蛋白质聚集体所致。尽管如此，总体蛋白质得率仍足以支持晶体生长。使用负染透射电镜和分析型凝胶过滤色谱是评估不同基因工程构建体所表达蛋白质是否适用于结晶的标准方法。

为了评估柱层析过程每一步以及预结晶化学处理后蛋白质的质量，分别取自两个Ni-NTA柱、两个CBP柱、一个凝胶过滤柱以及还原烷基化样品的等分试样被加载到10% SDS-PAGE凝胶上（图3）。此外，用于烷基化的相同反应环境也可应用于乙基汞（EMTS）进行汞标记，但此内容不在本研究范围之内。

使用配备偏光镜的台式体视显微镜每日监测晶体生长情况。成熟且适合进行数据收集的晶体通常达到50 µm × 100 µm × 2 µm的尺寸（图4）。在晶体收获过程中，应刻意避开较小的晶体或晶体簇。

带有Ni-NTA、CBP、凝胶过滤和bicelle组装过程的蛋白质纯化示意图。
图1：异源二聚体ABCG5/G8的纯化（A）和bicelle结晶（B）的示意图。重组人ABCG5（hG5）和ABCG8（hG8）的构建体分别携带RGS-H6-G-H6和3C-CBP标签（A，顶部）。通过串联亲和层析柱色谱，随后进行凝胶过滤色谱，以实现异源二聚体的纯化（A，底部）。请点击此处查看该图的放大版本。

纳米颗粒分析：用于稳定性研究的电子显微镜图像和色谱图。
图 2：纯化蛋白的单分散性（A）和稳定性（B）评估。（A）使用透射电子显微镜（TEM）对负染色的ABCG5/G8（G5G8）异源二聚体进行观察。代表性颗粒用实心白色圆圈标出。比例尺 = 100 nm。（B）烷基化蛋白在4 °C下保存，一个月内通过分析型凝胶过滤色谱进行检测，结果显示一周后蛋白略有损失。请点击此处查看该图的放大版本。

电泳凝胶示意图；通过还原烷基化进行蛋白质纯化；峰组分分析。
图3：柱层析洗脱蛋白及还原烷基化处理后的SDS-PAGE分析。 将不同体积（1–10 µL）的蛋白质组分上样至10% Tris/Glycine凝胶，在200 V恒定电压下电泳45分钟。凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色、自然干燥后，使用台式扫描仪扫描成像。1° & 2° Ni：第一和第二Ni-NTA柱；1° & 2° CBP：第一和第二CBP柱；Peak Fractions实线：用于结晶的合并组分；Peak Fractions虚线：肩部组分；EMTS：乙基汞硫水杨酸；IA：碘乙酰胺。请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜图像、晶体形成、显微技术、材料科学、100 µm 比例尺。
图 4：通过光学显微镜评估蛋白质晶体成熟情况。 使用配备偏光镜的体视显微镜观察来自结晶液滴的ABCG5/G8成熟晶体。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

膜蛋白结晶相关的挑战促使了脂质双分子层驱动的结晶方法的发展，例如bicelle27 或脂质立方相（LCP）14 方法。然而，膜蛋白的成功结晶仍然依赖于蛋白质制备这一关键且有时成为瓶颈的步骤。值得注意的是，ABC转运蛋白在获得适用于X射线晶体学的晶体方面构成了巨大挑战。本实验方案提供了全面的操作指导，用于优化人源ABCG5/G8固醇转运蛋白的制备，并通过bicelle结晶方法促进晶体生长。

在设计本方案时，一个关键考虑因素是在蛋白质纯化的初始阶段必须获得足够的蛋白质产量，以允许在结晶前处理过程中出现一定程度的蛋白质损失（图3）。解决这一挑战的常用策略包括广泛的蛋白质工程改造、使用多种表达宿主，以及探索同源物或类似物等其他方法。然而，尽管该流程看似复杂，但已确定若干关键步骤，这些步骤是本方案成功的基础，同时也为研究其他ABC转运蛋白或一般膜蛋白时可能遇到的潜在局限性提供了启示。

首先，本方案在每一步骤中均采用充分的离心处理，以最大限度减少蛋白质聚集。此外，持续监测纯化后蛋白质的热稳定性至关重要。利用电子显微镜验证蛋白质的单分散性，同时通过分析型凝胶过滤层析追踪蛋白质随时间变化的稳定性（图2）。也可引入圆二色光谱（CD）或差示扫描量热法（DSC）等替代技术。此外，在特定阶段加入脂质对于提高纯化后的ABCG5/G8蛋白的活性和结晶能力至关重要。例如，胆酸盐和CHS是实现可测ATP水解所必需的；磷脂对于维持甲基化蛋白的稳定性不可或缺；而胆固醇则是bicelle溶液的必要组分，有助于形成适合高分辨率X射线衍射的晶体（图4）。

本质上，整个实验过程可在一周内完成。与脂立方相（LCP）法相比，从悬滴结晶板中回收晶体的操作更为简便。展望未来，若能获得充足的蛋白质产量（约10 mg），本方案可轻松拓展用于ABCG5/G8突变体或其他转运蛋白的晶体学研究。这对于目前难以通过电子显微镜进行观察的样品尤为适用。

披露

作者无任何披露事项。

致谢

本研究工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金（RGPIN 2018-04070）和加拿大卫生研究院项目基金（PJT-180640）对 JYL 的资助。本实验方案基于 Farhat 等人22 和 Lee 等人23 早前报道的 ABCG5/G8 晶体结构原始研究。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ABCG5美国国立卫生研究院收藏 NCBI登录号 NM_022436
ABCG8美国国立卫生研究院收藏 NCBI登录号 NM_022437
ÄKTA FPLC系统 Cytiva（原GE Healthcare Life Sciences）
CaCl2Wisent600-024-CG无水
CBPAgilent214303钙调蛋白结合肽亲和树脂
离心浓缩器（Vivaspin）Sartorius
CHAPSO AnatraceC317Anagrade
胆固醇AnatraceCH200
CHSSteraloidsC6823-000
DMABMilliporeSigma18023897%
DMNGAnatraceNG322
DMPCAnatraceD514
DOPCAvanti850375
DOPCAnatraceD518
DOPEAvanti850725
DTTFisherBP172
双厚度MicroLoopsMiTeGen
EDTABioShopEDT003二钠盐，二水合物
EGTAMilliporeSigma324626
乳化剂（EmulsiFex-C3）Avestin
内切酶H（Endo H）New England BiolabsP0702
乙醇GreenfieldP016EAAN无水乙醇
甲醛MilliporeSigma252549ACS试剂
甘油BioShopGLY004
HEPESBioShopHEP001
HRV-3C蛋白酶自制
咪唑BioShopIMD510试剂级
碘乙酰胺MilliporeSigmaI1149BioUltra
异丙醇FisherBP2618212
亮抑酶肽BioShopLEU001
MESMilliporeSigma69892BioUltra
甲醇FisherA412P
MgCl2Wisent800-070-CG水合
微流化仪（LM 20）Microfluidics
NaClBioShopSOD002
NH4OHFisherA669-212ACS试剂
Ni-NTA SuperflowQiagen30430镍离子负载树脂
PEG 400MilliporeSigma202398
胃蛋白酶抑制剂BioShopPEP605
PMSFMilliporeSigmaP7626
pSGP18 和 pLIC 自制（源自pPICZ，Invitrogen）
SDSBioShopSDS003
胆酸钠Fisher229101
丙二酸钠MilliporeSigma63409
蔗糖Wisent800-081-WG超纯
Superdex 200 30/100 GLCytiva（原GE Healthcare Life Sciences）28990944预装凝胶过滤柱
TCEP
透射电子显微镜（TEM）FEI, Technai
Tris碱FisherBP152
β-DDMAnatraceD310SSol Grade
β-巯基乙醇MilliporeSigma
ε-氨基己酸FisherAAA1471936

参考文献

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ABCG5 G8 ATP

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