方法文章

通过酶联免疫吸附测定/免疫荧光光度测量对植物组织中卡洛斯的定量

DOI：

10.3791/65833

⸱

2026年5月22日

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1Department of Plant Sciences, Microbiology, and Biotechnology, College of Natural Sciences, Makerere University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3The Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 4International Potato Center (CIP)

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方案采用胼胋糖特异性方法——免疫荧光光谱光度法（ELISA），该方法基于将胼胋糖在植物样本中与胼胝糖特异性抗体结合，然后通过酶标记检测抗体通过测量酶活性定量结合的胼骨糖。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

现有从植物组织定量钙化的方法包括上荧光显微镜、荧光光谱光度法、免疫荧光显微镜，以及对钙糖合酶和β-（1,3）-葡萄糖酶活性的间接评估。然而，其中一些方法存在显著局限性，包括耗时、非针对胼胼骨、劳动密集、主观、高自发荧光、低灵敏度、更偏定性而非定量，以及需要软件资源和技术技能的掌握。因此，迫切需要探索植物组织中卡洛斯定量的其他方法。有人假设使用胼胋糖特异性抗体的免疫荧光光谱光度法或酶联免疫吸附测定（ELISA）能够克服当前钙质定量方法的一些局限性。生物应激通过向组织培养来源的香蕉幼苗接种黄单胞菌（ Xanthomonas vasicola pv ）来施加。诱导钙糖产生的 musacearum （Xvm）细菌。在接种后14天（dpi）采集香蕉球茎组织样本，使用新的免疫荧光光谱法进行钙化物定量。 Xvm接种组和对照组球茎的钙化产出在香蕉基因型中差异显著（独立样本 t检验， p < 0.05）。本文描述的免疫荧光光谱光度法可用于定量不同植物组织中对胼胼的高特异性、敏感性、可靠性和可重复性。此外，使用96孔板，使该方法适合高通量钙化定量研究，采样和分析偏差极小。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

卡洛斯是一种β-1,3-葡聚糖的多糖，这是一种天然存在于多种高等植物细胞壁中的化合物。卡洛斯由卡洛斯合成，并由β-（1,3）-葡糖酶1,2,3降解。它参与多个生物过程，包括生长发育以及对非生物和生物胁迫的反应 4,5,6。在病原体感染期间，乳头内的辅糖沉积增加有助于防止微生物进一步定植，作为邻近植物细胞之间的通透屏障 2,4,7,8,9,10,11,12 .通过减缓病原体入侵受攻击组织，钙质沉积为诱导额外防御反应提供了时间13.准确的时空定量化植物组织中钙质对于理解其在各种生理过程中的作用至关重要。然而，目前植物组织钙化定量的方法，包括上荧光显微镜、免疫荧光显微镜和荧光光谱光度法，存在显著局限性和定量挑战。因此，迫切需要探索其他卡洛斯定量方法，以克服这些缺点。有人假设免疫荧光光谱光度法或酶联免疫吸附测定（ELISA）能够提供一种更高效的植物样品钙盐定量方法，该方法具有高特异性、灵敏度、可靠性、可重复性，并具有高通量。

铁骨糖定量的黄金标准方法是通过荧光显微镜14,15,16,17对苯胺蓝色石膏糖颗粒进行成像。苯胺蓝色染色的方氧化物在暴露于蓝光或紫外光激发时表现为黄色荧光颗粒，可以通过手动计数14、15个荧光的钙化颗粒数，或由自动计量软件进行计数。对研究者来说，手工计数工夫、耗时且主观，而自动计数则需要获取软件资源和相当的技术技能。用于自动卡洛斯计数的一些软件包括ImageJ19、20、21、22、photoshop23、CalloseMeasurer24、Icy18、25和Ilastik26。苯胺蓝色染色的钙糖也可以通过荧光光谱光度法17,19,27,28,29进行定量。然而，由于上荧光显微镜和荧光光谱光度测量具有较高的背景/自发荧光，这些方法因信噪比低而困难且不可靠。此外，苯胺蓝除了钙30外还能染色其他β-1,3-葡聚糖，使得上荧光显微镜和荧光光谱光度法的钙蛋白检测和定量方法部分非特异性和不可靠。基于胼胼组织特异性抗体的免疫荧光显微镜法也被用于多项研究，31,32,33。虽然该方法与对苯胺蓝染色胼胋的透荧光显微镜有一些缺点，但由于所用抗体，它具有胼胋特异性的优势。钙化定量也采用基于酶活性的方法进行。基于酶活性的钙糖定量方法包括评估钙糖合酶（CalS）20,33和β-（1,3）-葡萄糖酶活性34,35。与上荧光显微镜、免疫荧光显微镜和荧光光谱光度测量相比，酶活性方法存在若干缺点。这些问题包括间接估计胼胋、酶提取和酶活性检测的困难，以及植物组织中钙化物分布不均。

由于当前的钙糖定量方法（包括荧光显微镜、免疫荧光显微镜、荧光光谱光度法、CalS和β-（1,3）-氨基糖酶测定法存在缺点，因此需要开发一种新的钙糖定量方法，该方法具有多项优势，包括：1）高特异性、灵敏度、可靠性和可重复性，2）更易且高通量的钙糖定量。免疫荧光光谱光度法用于钙化定量尚未被探索。本书报道了一种基于免疫荧光光谱光度法的新钙糖定量方法，更具体地说是酶联免疫吸附测定（ELISA）。该方法可优化用于不同植物或其组织中对茧状物的定量，具有较高的特异性、精确度、可重复性以及高通量实验能力。该方法也可以修改，如果有针对该分析物的抗体，可以定量任何植物基分析物。为确保植物组织中钙化物的准确、高效和可靠时空分布，建议同时使用多种钙化定量方法，包括显微镜、分光光度法和酶活性法。因此，这将有助于准确且高效地理解卡洛斯在各种生理和应激反应中的作用。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 实验植物的接种

  1. 根据标准程序36,37分离、制备并确认Xvm接种物。随机选取10株2个月大、组织培养来源的Musa balbisiana和Mbwazirume植株，并用200微升（1 x 108细胞）PCR确认的Xvm接种剂，接种最年轻、完全开放叶柄的背面（见图1）38。
  2. 同样，随机选取10株巴尔比 斯和姆布瓦兹鲁姆香蕉苗，并用200微升无菌蒸馏水（SDW）接种。
  3. 在筛屋内以12小时光照/12小时暗照时间、25°C维持，每3天浇水一次，保持 Xvm接种和控制的香蕉植株。
    注意：材料表和表1分别列出材料和设备及缓冲剂配方。

2. 球茎组织采样及样本制备

  1. 进行破坏性采样以从实验植物中获取球茎样本（见图1）。
  2. 接种后14天（dpi）使用无菌手术刀片迅速切除约2克球茎样本，并单独放入标记的50毫升管中。对所有从 Xvm接种植物和对照植物采集的10个样本都进行此操作。
  3. 立即将装有样品的50毫升管浸入液氮中。
  4. 将样本运送到实验室，并在-80°C下储存，直到准备继续。样品可在−80°C下储存，保存时间可达1年或更长时间，且冻融循环极少。
  5. 使用冷冻干燥机将样品冻干72小时（见图1）。
  6. 将30毫克冻干样品放入2毫升管中，内含2颗钢制自行车珠，将其粉碎成细粉，速度设定为5，持续1分钟（见图1）。
  7. 将粉碎样品存放在室温下、干燥干燥的环境中，密封良好，直到准备继续。将粉碎样品在室温下保存最长4个月，或在−80°C下保存最长一年，且冻融循环极短，39,40。

3. 提取钙质并制备层流蛋白标准和空白料

  1. 从30毫克粉碎球茎样本中提取钙质，加入800微升1米氢氧化钠，并在80°C水浴中培养30分钟，每10分钟后偶尔涡旋一次（见图1，步骤6）。
  2. 让样品冷却至室温（约5分钟），然后以15,294 x g 离心5分钟。
  3. 将上清液（钙糖提取物）转移到无菌的2 mL管中，并以1：2的比例与阻断缓冲液（见表1）稀释。
    注意：根据初步实验和优化选择稀释因子。卡洛斯提取物的稀释可能必要，也可能不需要。必要时应在阻断缓冲液中进行稀释，并根据不同样品类型优化稀释比，使其落在标准曲线范围内。
  4. 将钙化物提取物保存在-20°C，直到准备好继续使用。将Callos提取物保存长达6个月，冻融循环极少。
  5. 制备100 mg/mL浓度的浓缩层簧苷标准液，浸泡在1 M NaOH 6,42,43,44,45中。
    注意：层叶蛋白是一种1-3-β-葡聚糖聚合物，可作为免疫荧光光谱光度测量中钙糖当量物的标准使用。
  6. 将标准液悬浮液在80°C的水浴中孵育，间隔轻轻摇晃，直到所有层状物质完全溶解（约20-40分钟）。
  7. 将溶解的标准液冷却至室温（约10分钟）。
  8. 从浓缩的100 mg/mL起点，使用阻断缓冲液制备80 mg/mL、60 mg/mL、40 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL、10 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.5 mg/mL、0.1 mg/mL和0.01 mg/mL的层压蛋白标准。
  9. 通过将1M氧化钠和阻断缓冲液以1：2的比例混合来制备空白胚。如果需要稀释，使用与准备钙糖提取物相同的稀释比例。
  10. 层流制品和空白剂储存在−20°C。 标准和空包可保存长达6个月，冻融循环极少。

4. 通过免疫荧光光谱光度法进行钙化定量

  1. 将100微升的初级抗体（1-3-β-葡聚糖导向小鼠IgG）通过涂层缓冲液制备（见表1）加入聚苯乙烯ELISA板的96孔（见图2）。
  2. 用石蜡膜密封盘子，并在冰箱中以4°C孵育一夜。
  3. 第二天，将盘子放在工作台上，让它达到室温（大约10分钟）。
  4. 按照标准吸墨和清洗程序清洗盘子46。简短地，向孔中加入200微升洗涤缓冲液（见表1），用数字摇床以500转/分钟旋转30秒，然后在纸巾上吸迹。重复此洗涤过程两次（见图2）。确保孔体不完全干燥，并使用无菌微量移液器尖端去除孔内气泡，避免接触井底和壁。
  5. 向每个孔加入200微升阻断缓冲液（见图2），并用石蜡膜紧密封闭板。在37°C下孵育4小时。 按照上面提到的洗盘（见图2）。
  6. 将10个 Xvm接种和10个对照工厂的钙糖提取物加入指定井中。向其他井加入100微升层流素标准。将100微升的空白槽加入其他孔（见图2）。
  7. 用石蜡膜密封盘子，并在冰箱中4°C下孵育一夜。如上所述再次清洗盘子（见图2）。
  8. 在每个孔中加入100微升原版抗体（1-3-β-葡聚糖导向小鼠IgG），使用阻断缓冲液制备（见图2）。
  9. 用石蜡膜密封板，在37°C下孵育4小时，然后如上所述清洗板（见图2）。
  10. 每个孔中加入100微升抗小鼠IgG-碱性磷酸酶二级抗体46,47（见图2）。
  11. 用石蜡膜密封板，并在冰箱中以4°C孵育一夜。然后，按照上面说明的步骤洗盘（见图2）。
  12. 向孔中加入100微升新鲜制备的对硝基苯基磷酸盐（pNPP）溶液，浓度为1 mg/mL（见表1）（见图2）
  13. 将平板在实验台上室温下孵育30分钟48分钟。
    注意：孵化时间可能因植物样本和所用标准而异。在这项研究中，拉米纳林的读数最佳，达到了30分钟。
  14. 通过向每个井48 （见图2）加入100微升新制备的停止液（0.5 M NaOH）来终止反应。
  15. 将板转移到微板读器（平衡至37°C），以中速摇晃1分钟，然后在405 nm48 读取吸收率（见图1， 图2）。

5. 数据分析

  1. 对层道吸收率在405纳米处对层状蛋白浓度（μg/mL）进行简单线性回归，得到标准曲线。标准曲线的方程为
    Y = β1X + β0
    其中Y代表405纳米处的层流吸收，β1 是回归线的斜率（皮尔逊相关系数），X是Log10 （层状蛋白浓度，单位为μg/mL），β 0是 y截距。
  2. 通过用样品吸收度减去胚胶的吸收度，计算球茎样品中的方钠含量。然后使用标准曲线估算钙盐浓度（μg/mL），即层道当量（LE）。
  3. 使用Shapiro-Wilk检验检查所有分布正态性数据，并用Levene检验（α > 0.05）检验方差的同方差性。
  4. 利用独立样本 t检验比较 Xvm接种组与对照组间的钙糖产出（p≤ 0.05）。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过分光光度分析已知层状砷标准的浓度，并记录其对应的吸光度值。利用这些数据，通过将层流蛋白标准物的浓度画在横轴，吸收度在纵轴绘制，构建了一个比尔-兰伯图。回归线的方程为 y = 0.5079x − 0.04534（见图3）49。比尔-兰伯特图给出了高相关系数（r）为0.9988，决定系数（r²）为0.9975，表明浓度与吸收度之间存在强线性关系，且因变量（吸光度）方差最多可由自变量（浓度）解释为0.9975;图3;第<0.0001页）。因此，该模型在预测层簧素和胼胝蛋白浓度方面是个良好、准确且可靠的模型。香蕉鱼茎样品中的方囊糖浓度通过分光光度测量球茎样品的吸收度，并利用吸收度值计算方程中的方莲糖浓度。

免疫荧光光谱光度分析显示，Xvm接种植株中诱导的卡洛糖含量在两种香蕉基因型中均显著增加（独立样本t检验，p < 0.05;图4）。对照植株在14 dpi时的钙糖产量分别为1474.34 mg/mL和M. balbisiana的1037.11 mg/mL（见图4）。Xvm接种后，接种Xvm的Mbwazirume和M. balbisiana小苗球茎中分别在14 dpi下产生了4190.78 mg/mL和1996.07 mg/mL的钙糖（见图4）。Xvm接种使钙盐产量比对照组高出1.9倍至2.8倍（独立样本t测试，p < 0.001;图4）。

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图1：新型免疫荧光光谱光度法定量钙化主要步骤的示意图。 图示了从香蕉组织定量钙化的主要步骤，包括培养组织培养衍生幼株、 Xvm接种、破坏性球茎组织采样、样品冻干、铁丝提取以及通过新型免疫荧光光谱光度法定量钙化。此图已重印50人。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：免疫荧光光谱光度法用于钙化定量的详细示意图。 图中详细展示了免疫荧光光谱光度法用于钙化定量的方法，展示了ELISA板上如何装载各组分，以及最终如何通过分光光度法定量化钙盐。此图已重印50人。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：蛋白质定量。 基于已知浓度层道蛋白标准和吸收读数（405纳米处）的Beer-Lambert图，用于计算球茎样品吸收读数的钙化物浓度（作为层流当量，LE）。此图已重印于第49页。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：钙化物浓度比较。通过新型免疫荧光光谱光度法（独立样本t检验，α ≤0.05）测定的M. balbisiana和Mbwazirume香蕉苗粒接种Xvm后，球茎的平均钙盐浓度±（SEM平均值，n=9）比较。点击此处查看该图的更大版本。

缓冲区创作存储
阻塞缓冲区10克牛血清白蛋白（BSA;1% w/v），溶解于1升PBS。-20°C，持续6个月
涂层缓冲剂1.59克碳酸钠（Na2CO3）、2.93克碳酸氢钠（NaHCO3）、0.2克叠氮化钠（NaN3），溶解于1升去离子氢2O中，pH为9.6。-20°C，持续长达12个月
共轭缓冲区2 克 PVP（2% w/v），溶解在 1 升阻断缓冲液中。-20°C，持续6个月
对亚硝基苯基磷酸盐（pNPP）溶液将对亚硝基苯基磷酸盐（pNPP）溶解于底物缓冲液中，工作浓度为1 mg/mL-20°C，持续长达12个月
磷酸盐缓冲盐水（PBS）8.0克氯化钠（NaCl）、0.2克单碱性磷酸钾（KH2PO4）、1.15克二卤性磷酸钠（Na2HPO4）、0.2克氯化钾（KCl）、0.2克叠氮化钠（NaN3），溶解于1升去离子化氢2O中，pH为7.4。-20°C，持续长达12个月
阻断缓冲液中的一级抗体按照制造商指示重新合成冻干的一级抗体，以获得浓缩的原料。将获得的重组初级抗体稀释至阻断缓冲液中的工作浓度2 μg/mL。-20°C，持续6个月
涂层缓冲液中的一级抗体按照制造商指示重新合成冻干的一级抗体，以获得浓缩的原料。将获得的重组初级抗体稀释至涂层缓冲液中的工作浓度2 μg/mL。-20°C，持续6个月
二级抗体1：1000次级抗体浓缩液：结合缓冲液-20°C，持续6个月
基底缓冲器97毫升二乙醇胺，0.2克叠氮化钠（NaN3），溶解于1升去离子水，pH值9.8-20°C，持续长达12个月
洗涤缓冲0.5毫升Tween 20（0.05% v/v），溶解于1升PBS，pH值7.5-20°C，持续长达12个月

表1：缓冲剂配方。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

免疫荧光光谱光度法首次应用于香蕉球茎中的钙化物定量。该方法基于酶免疫分析（EIA），用于利用胼胝特异性抗体47,51,52量化粗1 M NaOH香蕉提取物中的钙糖。简而言之，这项基于胼胝的免疫荧光光谱光度定量测定法涉及在微板上涂覆胼胝特异性抗体，然后结合植物提取物中的钙糖，再用同样特异于胼胝的二级抗体。随后加入与酶（碱性磷酸酶）相关的抗体，并与二级抗体形成复合物。然后加入基物对硝基苯基磷酸盐（pNPP）。样品中钙糖的定量依赖于碱性磷酸酶将磷酸基从pNPP分子中切割出去的能力，从而形成黄色化合物（对硝基酚）。黄色的强度检测是用405纳米的分光光度计进行的，然后将吸光度与碱性磷酸酶活性相关，碱性磷酸酶活性与样品中的钙盐浓度成正比。通过添加0.5 M NaOH提高pH，阻止了进一步的碱性磷酸酶活性，从而阻止了反应。

相比之下，钙盐定位和定量的标准黄金方法是落射荧光显微镜法，这是一种基于苯胺蓝氟染色53染色钙的成熟方法。简而言之，该方法基于苯胺蓝染料与β-1,3-葡聚糖（胼胝）特异结合形成复合物。该配合物中的苯胺蓝随后被紫外线（波长365-375纳米）激发。当苯胺蓝染料被激发时，会发出蓝色荧光，被捕捉以实现植物组织中钙质的特异性可视化53。苯胺蓝染色的钙化物的定量遵循一系列成像技术，这些技术量化了来自植物组织的荧光量。荧光与植物组织中可用钙质的量成正比。荧光显微镜已被用于生物胁迫下钙的可视化和定量。

在另一项研究中，结合了落射荧光显微镜和免疫荧光光谱光度法49，确定了炉骨糖沉积。虽然数据中观察到一些差异，但统计分析大体显示透射荧光显微镜和免疫荧光光谱光度测量数据一致，表明两种钙化物检测方法的一致性49。虽然两种方法的结果大致一致，但建议将透射荧光显微镜和免疫荧光光谱光度法相互补充，以获得更可靠的评估。尽管基于ELISA的方法针对胼胝、灵敏且可靠，但在优化方案和获得符合所有浓度和吸收度的最佳标准曲线时，初期耗时较长。

部分钙化定量方法繁琐 17,32,55，耗时26,56，非胼胝蛋白特有，因为苯胺蓝还可能染色除钙蛋白30外的其他β-1,3-葡聚糖，需要昂贵且复杂的钙盐计数软件 23,24,26需要一定的技术技能，且荧光光谱光度测量相关的高背景/自发荧光使得钙化物定量困难且不可靠。基于自动化图像分析工作流程（如ImageJ软件）的卡洛斯定量方法需要适当训练图像分析插件，如ImageJ的可训练Weka分割（TWS），这非常繁琐，57。

基于免疫荧光光谱光度法的测定法因其特异性、灵敏度、易用性和可重复性而备受青睐。但需要注意的是，检测系统及其灵敏度可能因具体的检测方案和所用设备而异。

这里介绍了一种基于免疫荧光光谱光度法的新型钙化物定量方法。本文所述的方法可用于不同植物组织和物种中对胼胋的定量，具有令人满意的特异性、高精度和可重复性。该方法是对各种钙盐定量方法的补充，可用于监测植物生长发育过程中钙盐水平的变化，以及对各种刺激或处理的反应。此外，使用96孔板减少了主观采样和分析，使该方法适合高通量钙化定量。值得注意的是，尽管石榴糖可以从新鲜采集的植物组织中轻易提取，但根据该新方案，包含的冷冻干燥样品制备步骤，使样本可以保存时间很长（最长1年），并允许在环境温度下储存和运输易腐生物样本在远方实验室之间。这使得可以重复钙化物提取，而无需反复为新样本采集而设置整个实验。

高通量钙化实验推荐采用免疫荧光光谱光度法，而上荧光显微镜和免疫荧光显微镜则可用于植物组织中钙化和方钙的组织定位。为确保植物组织中钙化物的准确、高效和可靠时空分布，建议同时使用多种钙化定量方法，包括显微镜、分光光度法和酶活性法。因此，这将有助于准确且高效地理解卡洛斯在各种生理和应激反应中的作用。未来的研究有望全面且同时评估多种钙化定量方法，包括荧光显微镜、免疫荧光显微镜、荧光光谱光度测量、免疫荧光光谱光度法以及基于酶活性的方法。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由比尔及梅琳达·盖茨基金会资助，资助编号为INV 009894/OPP1134098。资助方未参与研究设计;在数据的收集、分析或解释中;在手稿写作中;或者在是否发表结果时。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
铝箔及nbsp;金-费伊EA有限公司，肯尼亚内罗毕
分析平衡 梅特勒-托莱多股份公司，瑞士格赖芬湖ML204/01
敲珠器96BioSpec Products Inc.，美国俄克拉荷马州巴特尔斯维尔1001欧元
吸墨纸等;金-费伊EA有限公司，肯尼亚内罗毕
牛血清白蛋白（BSA） 美国马萨诸塞州赛莫飞世尔科学公司B14
离心机，5425R埃彭多夫，德国汉堡5406000240
结合冰箱与冷冻柜（4 & deg;C 和 & 减号;20 & deg;C） 海尔医疗实验室有限公司，中国青大HYCD-282
二乙醇胺 PanReac应用化学ITW试剂，Quí西班牙巴塞罗那的米卡SLU191287
数字摇臂，MixMate埃彭多夫，德国汉堡5353000529
二氢磷酸钠（Na2HPO<>4）PanReac应用化学ITW试剂，Quí西班牙巴塞罗那的米卡SLU141679
ELISA板，96孔，平底，透明，聚苯乙烯，高粘结度萨斯泰特股份公司及KG连，Nü德国姆布雷希特82.1581.200
iMark微板读器滤镜，iMark 680,405纳米Lasec International Pty. Ltd.，南非开普敦BRD1681011
冷冻干燥机，VirTis和mdash;BenchTop ”K”系列;型号：4KBTXLLabWrench，加拿大，美国448053
盐酸（HCl） PanReac应用化学ITW试剂，Quí西班牙巴塞罗那的米卡SLU141020
等温线强制对流孵化器，IFA-54-8Esco 生命科学集团，新加坡2100002
Laminarin 美国马萨诸塞州阿尔法AesarJ66193
微型离心管1.5毫升 埃彭多夫，德国汉堡022363204
微型离心管 2 mL Genesee Scientific Corp.，加利福尼亚，美国24–283
微量移液器（30–300 & mu;L），12通道，2100系列 埃彭多夫，德国汉堡EP-12-300R
微量移液器尖端 epT.I.P.S. 单曲埃彭多夫，德国汉堡022363204
微量移液器（0.5–1000 & mu;L）、研究 加埃彭多夫，德国汉堡3123000900
微板吸收读器，iMarkBio-Rad 实验室公司，美国加利福尼亚州1681135EDU
Microplate Manager 6 版本 软件 Bio-Rad 实验室公司，美国加利福尼亚州1689520
副胶片保罗·马里恩费尔德有限责任公司及劳达-克杜姆尔KG连;尼格斯霍芬，德国740751
对硝基苯基磷酸盐（pNPP）德国达姆施塔特默克KGaA20-106
pH计，HI9126汉纳仪器，美国罗德岛州伍恩索基特02310048991
聚乙烯基吡咯里酮（PVP） PanReac应用化学ITW试剂，Quí西班牙巴塞罗那的米卡SLUA2260
氯化钾（KCl）PanReac应用化学ITW试剂，Quí西班牙巴塞罗那的米卡SLUA2939
二氢磷酸钾（KH2POs4）和nbsp;PanReac应用化学ITW试剂，Quí西班牙巴塞罗那的米卡SLU141509
精密水浴，GP10Thermo Fisher Scientific Inc.，美国康涅狄格州纽因顿TSGP10
原版抗体（1-3-&β;-葡萄糖导向的小鼠IgG） 澳大利亚生物供应有限公司，澳大利亚墨尔本400-2
试剂储层及nbsp;美国马萨诸塞州，Thermo Fisher Scientific Inc.15075
与碱性磷酸酶（抗小鼠IgG-碱性磷酸酶）及nbsp结合的二级抗体;Sigma生命科学，美国新泽西州A5153
叠氮化钠（NaN3） PanReac应用化学ITW试剂，Quí西班牙巴塞罗那的米卡SLUA1430
碳酸钠（Na2CO<>3）与nbsp;PanReac应用化学ITW试剂，Quí西班牙巴塞罗那的米卡SLU141648
氯化钠（NaCl） PanReac应用化学ITW试剂，Quí西班牙巴塞罗那的米卡SLUA2942
碳酸氢钠（NaHCO3） PanReac应用化学ITW试剂，Quí西班牙巴塞罗那的米卡SLU141638
氢氧化钠（NaOH）PanReac应用化学ITW试剂，Quí西班牙巴塞罗那的米卡SLU141687.1210
Tween-20Biomatik公司，加拿大安大略省A4031
超纯蒸馏水美国马萨诸塞州赛莫飞世尔科学公司10-977-015

参考文献

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