在斑马鱼中建立胎儿酒精谱系障碍模型以表征不良胚胎环境对成年社会行为的影响

摘要

本实验方案的目的是阐述建立和使用成年斑马鱼社会偏好检测方法的必要步骤，并证明该方法可用于表征乙醇诱导的社会行为缺陷。

摘要

胎儿酒精谱系障碍（FASD）描述了所有由酒精引起的出生缺陷。与FASD相关的出生缺陷包括生长迟缓、颅面异常、行为异常和认知异常。社交困难是FASD常见的行为异常，常导致严重的健康问题。动物模型对于理解乙醇引起社交缺陷的机制至关重要。斑马鱼是一种具有社会性的脊椎动物，可产下体外受精的透明卵；这些特性为研究人员提供了精确而简便的方法来构建FASD表型，并利用其天生的行为特征模拟FASD相关的社交缺陷。因此，斑马鱼非常适合用于表征FASD的社交缺陷。本实验方案的目标是为使用者提供一种简单的行为检测方法，可用于表征发育早期不良环境所导致的后果及其对成年期社交行为的影响。该方案也可用于表征基因突变或致畸物对成年个体社交行为的影响。本文所述方案演示了如何在20分钟的社交检测中表征单条鱼的社交行为。此外，采用本方案获得的数据表明，该方法可用于表征胚胎期乙醇暴露所导致的成年斑马鱼社交缺陷。

引言

产前酒精暴露可导致一系列先天性缺陷，统称为胎儿酒精谱系障碍（fetal alcohol spectrum disorders, FASD）¹。行为障碍，例如社交困难，是与FASD相关的常见出生缺陷^2,3。不幸的是，社交困难常导致严重的心理健康问题⁴，从而对FASD患者的生活质量产生不利影响。因此，阐明乙醇诱导社交缺陷的机制至关重要。

斑马鱼具有生物学和行为学特征，使其非常适合用于深入研究乙醇引发社交缺陷的机制。例如，斑马鱼可产生大量体外受精的透明卵子；这些生物学特性使研究人员能够轻松地构建精确且可重复的胎儿酒精谱系障碍（FASD）表型⁵。在受精后24小时（hpf）对胚胎进行乙醇暴露时，研究人员只需使用解剖显微镜观察透明卵子，并根据Kimmel等人的已有研究⁶确定胚胎发育阶段，随后将卵子置于所需浓度的乙醇溶液中，持续所需时间即可。由于卵膜对酒精的屏障作用较弱⁷，乙醇可迅速渗透并包围胚胎。要终止暴露，只需将卵子从乙醇溶液中取出即可。除了为研究人员提供一种简单而准确的FASD表型构建方法外，斑马鱼还因其约70%的人类基因具有斑马鱼同源基因，而成为研究人类疾病相关基因的宝贵工具⁸。此外，与其他动物模型不同，斑马鱼会形成称为“群聚”（shoals）的社会群体⁹¹⁰。群聚行为可用于表征胚胎期乙醇暴露对社交行为的影响¹¹。此外，在斑马鱼中，可通过计算机控制的社交刺激¹²或活体社交刺激¹³来诱发其社交反应。

既往研究已对成年斑马鱼在群体中的社会反应进行了表征¹⁴，但该方法的一个局限性在于无法将个体鱼的行为与特定指标（如神经递质水平的变化）进行关联分析¹¹。以下实验方案将使用户能够表征单条成年斑马鱼的社会行为。由于社会行为数据是针对个体鱼获取的，因此使用者现在可将每条鱼获得的行为特征谱与其相关的因变量结果进行关联分析。例如，既往研究已表明，胚胎期乙醇暴露会损害多巴胺能系统对社会刺激的反应¹¹。尽管本文展示的数据以胚胎期乙醇暴露作为自变量，但本方案的使用者亦可表征其他药理学处理或基因突变对社会行为的影响。此外，使用者不仅限于研究胚胎期处理对行为的改变，还可探究成年斑马鱼在急性药理学处理下对社会行为的影响¹⁵。

方案

本文所述所有方法均已获得南达科他大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 斑马鱼的饲养、护理及胚胎期乙醇暴露

1. 按照文献¹⁶所述方法饲养和繁殖斑马鱼。
2. 乙醇暴露
   1. 选择适当的发育阶段进行乙醇暴露。本方案中，胚胎在受精后24小时（24 hpf）暴露于乙醇。
   2. 将胚胎置于体积分数为1.0%的乙醇溶液中处理2 h¹⁵。建议每毫升胚胎培养基（EM）中放置1枚胚胎。具体操作：将胚胎放入50 mL胚胎培养基（EM；EM配方详见Westerfield¹⁶）中，移除500 µL EM，加入500 µL乙醇。
   3. 乙醇暴露后，按文献¹⁷所述方法继续培养胚胎。在鱼龄达到16周时检测其社会行为。

2. 随机分组与水箱设置

1. 使用在线随机序列生成器，对所有试验进行随机化 先验的 进行行为检测时，确保刺激侧和处理组随机分配。
2. 为避免时间或测试日期等混杂因素的影响，每天在相同时间开始和结束行为学实验，并在连续数日内完成所有实验鱼的行为测试。
3. 对于本实验（图1），使用一个37 L的水箱（50 cm × 25 cm × 30 cm，长×宽×高），并在水箱宽度方向外侧放置1.4 L的水箱，具体方式如前所述¹⁷.
4. 用白色波纹塑料衬垫37 L水箱的背面和底部，以增强实验鱼与背景之间的对比度，从而改善视频追踪效果。
5. 将波纹塑料板放置在1.4 L水箱的外壁，以增强实验鱼所见社会刺激的对比度。最后，在1.4 L水箱与37 L水箱之间放置白色波纹塑料板；该不透明屏障用于在适应阶段防止实验鱼观察到社会刺激。
6. 将相机放置在足够远的位置，以完整拍摄37 L水族箱的全长以及1.4 L水族箱的一半，并能准确追踪成年实验鱼。
   注意：确认刺激所在的一侧可确保研究人员正确标记了追踪区域，并提供冗余备份。
7. 若未使用红外追踪，请确保照亮37 L水箱。使用任何市售的水族箱罩灯，配备15 W T8全光谱灯管。
   ​注意：若设置多个实验区域，应使用带有相同灯具的相同水族箱罩。

3. 进行社会性实验

1. 首先，用与饲养架中相同的水注满用于行为实验的37 L水箱。确保水温与饲养架中的水温相差在2 °C以内。
2. 每天结束时排空37 L水箱，每次测试开始前均应使用新鲜水。确保37 L水箱与1.4 L水箱中的水位一致。如果室温无法使37 L水箱中的水温维持在28.5 °C ± 2 °C范围内，则需更换为28.5 °C的温水。
3. 接下来设置感兴趣区域（zones of interest）。参考所选用户手册中的追踪软件来创建区域。在本实验方案中，沿37 L水箱顶部和底部使用卷尺标记出每5 cm的刻度。由于测试水箱长度为50 cm，每5 cm划分一个区域，共形成10个各为5 cm的区域。
4. 以37 L水箱上标记的刻度为参考，使用软件将顶部5 cm处的点与底部对应的5 cm处的点连接，从而构建区域。此外，还需在底部和刺激源位置分别创建区域。根据需要自定义感兴趣区域。
5. 在本实验方案中，使用追踪软件测量鱼体与某一区域的距离以及在该区域内停留的时间。本方案共使用了12个区域。
6. 量化实验鱼在区域1至区域10中停留的时间，并以距离刺激源和水箱底部的距离作为参数进行分析：其中区域1定义为最靠近刺激源的区域，而区域10则为距离刺激源最远的区域。
7. 接下来，选择将用于社会刺激的两条雄鱼和两条雌鱼。最佳做法是选用与实验鱼来自同一群体的个体；若不可行，则应尽量选择品系、年龄和体型与实验鱼相匹配的鱼。
8. 将实验鱼从饲养水箱转移至测试区域（37 L水箱）。使用渔网从饲养水箱中捕获实验鱼，将装有鱼的渔网放入盛有鱼水的容器中。
   注意：采用此方法可在转移过程中减少实验鱼所受的应激。
9. 将实验鱼放置于测试区域的中央位置。
10. 根据所选软件的用户手册调整检测参数，待设置满意后，开始20分钟的实验。在前10分钟内，保持37 L水箱与1.4 L水箱之间的不透明屏障处于原位，以防止实验鱼看到由两条雄性和两条雌性斑马鱼组成的社会刺激，从而使其适应测试环境^13,17。
11. 10分钟后，小心地从水箱后方抽出不透明屏障，使实验鱼能够看到社会刺激。
12. 根据用户的偏好及软件手册，使用追踪软件对实验鱼的行为进行追踪和量化分析^{11, 12, 17}。在当前实验方案中，需量化实验鱼与社会刺激及水箱底部之间的距离，以及其在各个区域中停留的时间。
13. 使用传统的数据分析工具对数据进行分析。

结果

图2 修改自 Fernandes 等人¹⁷，显示通过检测与刺激物的距离，胚胎期乙醇暴露会减弱群集反应。图2 中的数据表示在20分钟试验期间与社交刺激物的距离。Y轴显示距离（单位：厘米），X轴显示被划分为1分钟间隔的20分钟试验过程。X轴上的黑色条形表示不透明屏障已被移除、社交刺激物对测试鱼可见的时间段。所有组别在刺激物刚变得可见时，均表现出迅速向社交刺激物靠近的趋势，这可通过第9至第10分钟间距离的急剧下降来判断；然而，对照组鱼类在接近后会持续保持在社交刺激物附近，而酒精处理组则不会。这表明胚胎期乙醇暴露会影响成年期的社交行为^12,18。

图3 修改自 Fernandes 等人¹⁷，利用测量到刺激物距离的数据，进一步展示胚胎期乙醇暴露对群集反应的影响。图3 中的数据表示当社会性刺激可见时，个体与刺激之间距离的减少量。为计算到刺激物距离的平均减少量，用习惯化阶段（社会性刺激不可见时）到刺激物的平均距离减去刺激呈现阶段（社会性刺激可见时）到刺激物的平均距离，因此更负的数值代表更强的社会性反应。

图4 显示在各区域停留的时间与刺激源距离的关系。 图4 已根据 Fernandes 等人的研究进行了修改。¹⁷. 图 4A 显示了在刺激可见期间，鱼类在各个区域（X轴）所花费的时间（Y轴）。尽管所有组别的鱼类似乎均表现出对靠近社交刺激区域的偏好，但对照组鱼类在第1区所花费的时间几乎是酒精处理组鱼类的两倍（图4B). 图4C 表明胚胎期乙醇暴露并未损害运动能力，因为各组在不同区域之间无显著差异。最后， 图4D 表明在没有社交刺激的情况下，鱼类不会在靠近社交刺激的区域停留。因此，实验结果表明，当社交刺激可见时，对照组鱼类会靠近并长时间停留在其附近，而经乙醇处理的鱼类则不会。此外，图中所示数据还显示 图2 和 图4C 表明胚胎期乙醇暴露并未损害鱼类观察社交刺激的能力（图2）或移动（图4C因此为胚胎期乙醇暴露会损害成年斑马鱼的社会行为提供了有力证据。

图 1：行为实验装置示意图。 采用一个37 L的水箱，用于检测成年斑马鱼（命名为ZT140）在有或无胚胎期乙醇暴露条件下的社会行为。该图改编自Fernandes等人的研究¹⁷。请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：胚胎期乙醇暴露削弱成年斑马鱼的社交行为。 在20分钟行为实验期间，以每1分钟为间隔绘制的实验鱼与活体鱼群之间的平均距离。数据以均值±标准误（SEM）表示。对照组（n = 12）；1%乙醇（EtOH；n = 11）。X轴上方的水平条（10至20分钟）表示活体鱼群对实验对象可见的时间段。酒精浓度标注在图上方。本图经Fernandes等¹⁷修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3：经酒精处理的鱼类距离活体鱼群显著更远。 柱状图表示鱼类在活体鱼群出现前后与其距离的差值。负值越大，表明对同种个体的反应越强。数据以均值±标准误（SEM）表示。对照组（n = 12）；1%乙醇（EtOH；n = 11）。本图改编自Fernandes等人的研究¹⁷。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：仅当可见活鱼群时，胚胎期乙醇暴露才会改变斑马鱼在第 1 区域的停留时间。（A）柱状图表示在刺激呈现期间，斑马鱼在全部 10 个区域中停留的时间。（B）柱状图表示在刺激呈现期间，斑马鱼在第 1 区域的停留时间。第 1 区域是距离活鱼群最近的区域，而第 10 区域是距离活鱼群最远的区域。注意对照组鱼类在第 1 区域停留时间的显著差异。（C）柱状图表示在习惯化阶段（前 10 分钟）所有区域中平均停留时间的百分比。（D）柱状图表示在习惯化阶段斑马鱼在第 1 区域的停留时间。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。样本量如下：对照组（n = 12）；乙醇组（EtOH；n = 11）。本图经 Fernandes 等人¹⁷ 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

斑马鱼具有多种生物学和行为学特征，使其成为研究基因、环境与行为相关性的极具吸引力的模式生物^5,19。本实验方案为最终使用者提供了一种相对简便的方法，用于检测社会行为，多种量化社会行为的方式，并具备将个体鱼的行为反应与特定处理（如胚胎期乙醇暴露、基因突变或其他药理学物质）进行关联的潜力。

为了检测成年斑马鱼的社会行为，请严格遵循本方案，并结合所选追踪软件的用户手册进行操作。构建测试区域时，仅需一个带盖和光源的37 L水族箱、波纹塑料板、两个用于放置社会刺激物的小型水族箱以及一台摄像机；这些物品大多数可在宠物商店或大型零售商处购得。当单独的一条斑马鱼面对一群斑马鱼时，其自然行为表现为缩短与群体之间的距离，同时增加在群体附近近距离停留的时间¹⁹，这种行为被称为群集反应¹⁹。群集反应是一种可从两个方面进行表征的社会行为：第一，当社会刺激可见时，测量社会刺激与单条鱼之间的距离¹²；第二，测量当社会刺激可见时，单条鱼在最靠近社会刺激区域所停留的时间。能够量化斑马鱼在社会刺激可见时于5 cm区域内停留的时间，为判断其社会反应提供了有力证据，因为这些鱼的平均体长约为4 cm。

将50 cm的水箱划分为10个5 cm的区域有助于统计分析，因为测试鱼处于任一区域的概率相同。乍一看，对同一结果采用两种测量方式似乎多余。然而，这种冗余可提供验证作用。此外，习惯化阶段的距离和持续时间测量可用于判断某种处理是否影响了视觉或运动能力。本方案采用了 commercially available automated tracking software^13,18，但也可适用于其他追踪系统，甚至可由经过培训的观察者进行手动追踪。

无论使用何种追踪软件，都有一些关键步骤需要执行以优化追踪效果。首先，应选择与待记录鱼类形成显著对比的背景。野生型斑马鱼具有金色和蓝色的横向条纹²⁰；其体表还分布有黄色的黄色素细胞、银色或蓝色的虹彩细胞以及黑色的黑色素细胞组成的镶嵌图案²⁰。因此，在分析AB野生型斑马鱼行为时，应使用白色背景^12,13,17；而在研究缺乏色素的casper斑马鱼的社会行为时，则应使用黑色背景¹⁷。其次，确保光照充足，以便准确追踪实验鱼。若存在多个追踪区域，需保证各区域之间的光照条件一致。另一个关键步骤是确保37 L水箱中的水位与1.4 L水箱中的水位相同，以防止测试鱼游入没有社会刺激的区域。此外，在录制视频时，必须确保1.4 L水箱完全处于摄像画面内；这样做可在需要手动编码数据或验证刺激侧位置时提供备份依据。

实验方案中常见的问题包括受试对象未能被正确追踪、适应期不足，以及在设置多个实验区域时，拉开不透明屏障存在短暂的时间延迟。为避免受试对象未能被正确追踪，请确保如前所述，鱼类与背景之间具有足够的对比度，并遵循软件的使用指南。此外，如果所用软件支持红外追踪，则可缓解对比度相关的问题。尽管10分钟的适应期看似较长，但我们尚未发表的研究结果表明，缩短适应期会对实验结果产生负面影响。最后，若37 L与1.4 L水箱之间的不透明屏障为手动拉开，且同时设置了多个实验区域，则除非有多人同时操作，否则无法确保所有屏障在同一时刻被拉开。作为替代方案，若仅由一人进行实验操作，则应采用平衡顺序的方法，轮流将不同实验区域的屏障优先拉开。

尽管该实验方案较为直接，但追踪软件的成本以及需要单独表征每条鱼行为所耗费的额外时间是潜在的局限性。本方案采用 commercially available software 来记录实验鱼的行为，从而避免了观察者偏差，并通过设置多个实验区域实现对多条鱼的同时记录，提高了通量。尽管本方案使用了 commercial software，但其他行为追踪软件也可获得，包括免费软件。使用者可根据自身条件选择合适的追踪软件，结合本方案即可重现社会行为实验。在本方案中，我们对个体鱼的行为进行了表征；而其他研究则侧重于分析斑马鱼群体¹⁴，这是解决逐条表征鱼类行为效率问题的一种方式。此外，如前所述，同时使用多个测试区域可在维持对个体鱼行为特征准确归因的前提下提高实验通量。保留将行为特征与个体鱼相对应的能力至关重要，因为它使研究人员能够探究同一处理组内个体间的变异。尽管代表性数据中将胚胎期乙醇暴露作为自变量，但本方案所述技术的未来应用并不仅限于表征胚胎期乙醇暴露对社会行为的影响。例如，可用来确定基因突变²¹或其他药理学处理²²对社会行为的作用。此外，除胚胎期乙醇暴露外，后续研究还可利用该方法表征其他致畸剂对社会行为的影响。因此，本方案适用于任何希望探究基因和/或环境因素如何影响社会行为的研究人员。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.4 升 ZT140 Aquaneering 水箱	Aquaneering	ZT140	用于社交刺激的水箱
Aqueon 20" 豪华荧光全罩式水族灯	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aqueon-aquarium-black-24-fluorescent-deluxe-full-hood-215740		37 升水箱用灯
Aqueon 标准开口玻璃水族箱，10 加仑	https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aga-10g-20x10x12bk-tank-170917		用于社交实验的 37 升水箱
乙醇	Fisher Scientific	BP28184
Ethovision XT 追踪系统	https://www.noldus.com/ethovision-xt
R-可编程彩色 Basler GigE 相机	https://www.noldus.com/ethovision-xt
白色波纹塑料	https://www.homedepot.com/p/Coroplast-48-in-x-96-in-x-0-157-in-4mm-White-Corrugated-Twinwall-Plastic-Sheet-CP4896S/205351385		用于铺设 37 升水箱及社交刺激所用水箱的底部和背面的塑料材料