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方法文章

探索生命史选择：利用温度和基质类型作为相互作用因子研究丽蝇幼虫及雌性成虫的偏好

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DOI：

10.3791/65835

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2023年11月17日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Evolutionary Biology, Institute of Biosciences, University of São Paulo, 2Department of Zoology, Institute of Biosciences, University of São Paulo

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文详细介绍了两种用于评估丽蝇幼虫和雌虫对食物来源及产卵偏好的实验方案。该方案包含四个选择，涉及两个相互作用的因素：基质类型和温度。这些检测可用于确定幼虫对食物来源的偏好以及雌虫对产卵位点的偏好。

摘要

丽蝇（双翅目：丽蝇科）的幼虫具有多种生活方式，通常分为专性寄生、兼性寄生和完全腐生性食腐。一些寄生性种类，无论是专性还是兼性寄生，均具有重要的卫生和经济意义，因为其幼虫可导致蝇蛆病（活体组织中的蛆虫侵染）。然而值得注意的是，成虫雌蝇起着决定性作用，因为它选择产卵地点，从而在很大程度上决定了幼虫的取食习性和发育条件。本研究提出了两种实验方案，用于检测幼虫取食偏好和雌蝇产卵地点偏好，同时考虑两个交互因素：肉类基质类型和温度。本文所介绍的实验装置可用于四选一实验，测试丝光绿蝇（Lucilia cuprina）幼虫和 gravid 雌蝇在两种温度（33 ± 2 °C 和 25 ± 2 °C）以及两种肉类基质（添加血液的新鲜肉类和放置5天的腐烂肉类）条件下的行为。幼虫或 gravid 雌蝇可分别选择在以下四种条件之一中钻入或产卵：25 °C 下的腐烂肉类（模拟腐食性种类的条件）、33 °C 下添加血液的新鲜肉类（模拟寄生性种类的条件），以及两个对照组：33 °C 下的腐烂肉类或 25 °C 下添加血液的新鲜肉类。通过统计每组重复中各选项内幼虫数量或产卵数量来评估偏好性。将观察结果与随机分布进行比较，可估算偏好的统计学显著性。结果表明，L. cuprina 幼虫显著偏好 25 °C 下的腐烂基质。相反，雌蝇对产卵地点的偏好在肉类类型之间表现更为多样化。该方法可适用于测试其他体型相似昆虫物种的偏好性，也可通过采用不同实验条件来探讨其他科学问题。

引言

蝇类，尤其是有瓣蝇类（包括丽蝇、家蝇、肤蝇和肉蝇等），表现出多种多样的生活方式，涵盖寄生性和腐生性行为1。寄生性种类通常引起蝇蛆病，即蝇的幼虫（蛆）对活体组织的侵染2。在丽蝇科中，专性寄生和兼性寄生种类均为重要的畜牧业害虫，因幼虫侵染导致经济损失并损害动物福利2,3,4,5,6,7。专性寄生虫如新大陆和旧大陆螺旋蝇（Cochliomyia hominivorax 和 Chrysomyia bezziana）尤为严重4,7,8,9,10，兼性寄生虫如羊丽蝇（Lucilia cuprina 和 Lucilia sericata）也同样具有危害性2,5,6,7。非寄生性种类，包括腐生性种类，发育于腐败或坏死的有机物中，常见于不卫生的环境。其完全非寄生的生活方式可成功应用于蛆疗，即利用蝇类幼虫清除伤口中的坏死组织11,12,13。丽蝇还被用于法医学，因为它们是最早发现并定植于新近死亡尸体的生物之一，其发育中的幼虫可用于推断死亡时间14。

由于与人类利益密切相关，丽蝇的生活方式已成为多项研究的课题（例如，15,16,17,18,19,20,21）。了解调控某一物种生活方式的生物学机制，有助于改进针对害虫物种的防控方法。此外，丽蝇生活方式的多样性及其演化过程为研究复杂性状（例如寄生性）的起源与机制提供了理想的研究背景。在丽蝇科（Calliphoridae）中，幼虫以活体组织为食而演化的寄生现象已独立发生多次22,23。然而，丽蝇取食习性的演化历史在很大程度上仍不清楚，现有研究仅局限于将这些习性映射到系统发育树上（例如，16,19,22），缺乏功能实验的支持。例如，专性寄生虫究竟是由泛化种（即兼性寄生虫）演化而来，还是直接由食腐物种演化而来，目前尚不确定。伴随生活方式演化转变所涉及的分子、生理和行为过程也大多未知。

在此背景下，兼性寄生虫（例如羊蝇） Lucilia cuprina，这些生物既能作为寄生虫寄生于宿主，也能作为腐生生物以尸体为食，为研究调控其生活方式选择的因素和机制提供了可能。 Lucilia cuprina 是一种世界性分布的物种，以引起绵羊蝇蛆病而闻名，尤其在澳大利亚被视为害虫3,16. 由蝇蛆病导致的 L. cuprina 也可能发生在其他家畜、宠物及人类中3,24,25,26,27,28,29,30然而，其幼虫也可在坏死组织和腐烂物质中发育，该物种已成功应用于法医昆虫学，因其能迅速定位并定殖尸体31,32,33,34. 尽管寄生的 与 丽蝇的非寄生生活方式由其幼虫阶段决定，而选择产卵地点的是成年雌性个体。因此，成年雌性对幼虫的生活方式具有重要影响，因为幼虫的活动能力有限。然而，雌性所选择的产卵基质并不意味着幼虫在有选择的情况下也会偏好相同的基质35一种假说是，导致雌性将卵产在活体组织上的行为改变，可能是向寄生生活方式转变的早期环节之一。由此产生的幼虫所具备的预适应特征或生理能力，对于其在活体组织上的成功发育至关重要，并推动了寄生生活方式的出现。因此，这两个生活阶段所涉及并受到选择的生理过程可能并不完全一致。

在此背景下，开发了两种方法用于测试丽蝇（blowflies）的行为偏好，特别是针对 L. cuprina，关于幼虫取食基质（幼虫偏好实验）和产卵场所（雌性偏好实验）。这些方法考虑了两个相互作用的因素：温度和肉类新鲜度。选择温度作为关键因素，是因为大多数蝇蛆病病例发生在恒温动物中2因此，选择33 °C作为代表性的温度 "寄生生活方式因子"，而25 °C（室温）代表 "非寄生因子"选择25 °C是因为该温度代表了巴西年平均气温（国家气象研究所，INMET）。此外，考虑了两种牛源性肉类基质：（i） 添加血液的新鲜肉类，模拟寄生生活方式所需的基质，用于饲养寄生性丽蝇 Co. hominivorax 在实验室条件下36，以及（ii）模拟腐生生活方式基质的5日腐肉。牛源性基质常用于饲养 L. cuprina 在实验室条件下27,37,38,39 因其在可获得性、成本效益和实用性方面具有多项优势，同时作为一种生态上合理的基质，其他研究40,41 比较腐烂的影响 与 丽蝇在新鲜基质中的研究使用了7天腐烂的基质（厌氧条件下），结果显示腐烂基质对发育速率、存活率和生长具有不利影响。正如 L. cuprina 已知该生物会定殖于通常暴露在空气中的新鲜尸体，因此我们决定使用5天前腐烂的肉类（绞牛肉）置于非密封容器中（模拟有氧与无氧分解环境），以模拟食腐基质。

本文所展示的实验设计具有能够区分个体因素偏好及其综合作用的优势。此外，所评估的表型指标——幼虫取食基质的选择以及产卵数量——直接关联到丽蝇物种的生物学与生态学特性。通过在L. cuprina中验证这些实验方案的有效性，进一步凸显了其适用性。同时，本文提供了一套统计分析脚本，可用于将L. cuprina中获得的实验结果与模拟的随机数据进行比较，从而确保统计分析的严谨性与结果解释的可靠性。

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方案

蝇类样本通过诱捕器获取，而非从受侵袭的动物身上采集。已获得SISBIO许可证（67867-1），允许在实验室条件下采集和饲养丽蝇科（Calliphoridae）的蝇类。在巴西，昆虫样本的研究无需接受伦理审查。牛源肉类和血液均购自商业渠道，无需伦理审批。

1. 幼虫取食偏好

  1. 含有2%琼脂的培养皿的制备
    1. 准备四个含有2%琼脂的培养皿。具体操作为：将6 g细菌学琼脂加入300 mL水中，并在微波炉中熔化该混合物。然后将熔化的琼脂液均匀分装至四个玻璃培养皿（150 × 20 mm）中，每个培养皿使用约70 mL。
      注意：培养皿的数量应根据所需实验重复次数进行准备。本研究中使用了36个重复。
    2. 待琼脂完全凝固后，使用一个50 mL的锥形管（直径3 cm）在琼脂表面打四个孔，每个培养皿两侧各打两个孔，按照提供的切割模式进行（图1）。
      注意：该设置与Fouche等（2021）40和Boulay等（2016）42先前描述的方案类似。
  2. 底物的制备
    1. 制备含血的新鲜肉时，将12 mL稀释的牛血加入200 g新鲜牛肉糜中，充分混合。务必为每种类型的肉使用不同的量筒和勺子，以避免底物之间的交叉污染。
      注意：稀释的血液由50%纯血液与抗凝剂（3.8%柠檬酸钠）和50%过滤水混合而成。
    2. 制备腐烂底物时，将12 mL过滤水加入200 g已存放5天的腐烂牛肉糜中，并充分混合。
      注意：腐烂肉是通过将新鲜肉糜在非密封塑料容器中于25 °C下孵育5天获得的（兼性好氧与厌氧分解混合）。每个容器中含有200 g新鲜肉糜，之后冷冻保存直至使用。
    3. 在每个培养皿的两个孔中填入新鲜肉与血液的混合物，其余两个孔中填入腐烂肉与水的混合物。
      注意：为避免位置偏差，应变化不同类型肉在培养皿中的放置方式。例如，部分培养皿中相同类型的肉应相对放置，而其他培养皿中则应交叉放置，如图2所示。
  3. 实验装置设置
    1. 在室温（RT）25 °C条件下，将加热垫置于光源正下方，以均匀照亮实验区域，避免幼虫行为对光产生趋光或避光偏差。在加热垫周围放置纸板垫，确保实验装置保持水平。
      注意：所用光源为白色低热辐射光源，例如荧光灯管。加热垫放置在桌面上，正对天花板上的灯泡（图3）。
    2. 用黑色纸板覆盖加热垫及用于调平的纸板垫，并开启加热垫。
      注意：使用黑色纸板覆盖是为了避免视觉线索对行为实验造成干扰。
    3. 将六个含有琼脂和肉底物的培养皿放置在黑色纸板上，其中两个底物（每种类型各一个）置于加热垫上，另外两个则置于加热垫之外的区域（图2）。让底物加热约10分钟。
      注意：培养皿盖上可能会形成冷凝水。
  4. 幼虫行为测试
    1. 使用红外测温仪检测底物温度（冷侧：25 ± 2 °C；热侧：33 ± 2 °C）。
      注意：在整个实验过程中加热垫保持开启状态。温度测量在实验开始和结束时进行。尽管温度波动范围为±2 °C，但热侧与冷侧之间仍保持至少8 °C的温差。
    2. 当达到目标温度后，用镊子将五只三龄幼虫放置于每个培养皿的中心位置（图2），并盖上培养皿盖。让选择实验持续进行10分钟。
      注意：部分幼虫可能爬向培养皿边缘或盖子上。若发现幼虫逃逸，应使用镊子将其重新放回培养皿中心。
    3. 10分钟后，将所有培养皿从加热垫上移开，并放置于另一表面，以防止底物继续受热。随后统计每个底物中的幼虫数量，以及未选择任何底物的幼虫数量。
      ​注意：Lucilia cuprina幼虫会停留在其选择的底物中，本实验中已观察到该现象。

2. 雌性产卵地点偏好

  1. 实验设置
    1. 使用一个事先用黑色纸板覆盖的普通架子，并用白色LED灯带均匀照明。
      注意：应使用黑色纸板覆盖物，以避免可能影响行为实验结果的视觉线索。白色LED灯带沿架子长度方向固定在实验装置正上方的中央位置。实验所用架子之间的间距为45 cm。
    2. 在室温（25 °C）下，将加热垫置于架子中央。在加热垫周围使用纸板垫作为支撑，确保实验装置水平。
    3. 用黑色纸板覆盖加热垫及用于调平的纸板垫，以保证所有基底下方具有相同的视觉背景。
    4. 在一个架子上放置两个十字形玻璃容器，每个容器的两条臂应位于黑色纸板和加热垫之上。在实验开始前打开白色LED灯带和加热垫。
    5. 使用70%乙醇清洁十字容器（包括内部和盖子），以避免气味污染。
  2. 基底的制备
    1. 每个十字容器准备四个培养皿（60 mm × 15 mm），其中各放入5 g已腐烂或新鲜的5天龄肉类（每种基底类型各两个）。
      注意：培养皿的数量应等于所需实验重复次数乘以4。本研究中使用了30次重复，共制备了120个培养皿。
    2. 向新鲜肉中加入1 mL稀释的牛血（50%纯血加抗凝剂与50%过滤水混合），向腐烂肉中加入1 mL过滤水。使用不同的勺子分别将液体（血液或水）与对应类型的肉充分混合。
      注意：雌虫实验中肉类的制备方法与幼虫实验非常相似，但由于雌虫实验持续时间更长，因此用量有所不同。请务必为每种类型的肉使用不同的移液枪头和勺子，以避免不同基底之间的气味交叉污染。
    3. 检查十字容器内的乙醇是否已完全挥发。然后，在每个十字容器的每条臂末端放置一个培养皿（其中两个位于加热垫表面之上，另两个位于加热垫之外）（图4）。盖上十字容器的盖子，使基底预热约10分钟。
      注意：此外，为避免位置偏差，应在不同十字容器中改变不同类型肉类的摆放位置。例如，某些十字容器中相同类型的肉应位于相邻臂上，而其他容器中则应相对放置，如图4所示。
  3. 雌虫实验
    1. 从蝇笼中收集 gravid 雌虫，并将其分别隔离至独立的试管中。
      注意：gravid 雌虫的特征是腹部膨大且呈乳白色至淡黄色，与未 gravid 雌虫明显不同（图5）。实验中使用的 gravid 雌虫是在羽化后10至16天内采集的。
    2. 使用红外测温仪检测十字容器中各基底的温度（冷侧：25 ± 2 °C；热侧：33 ± 2 °C）。
      注意：与幼虫实验相同，加热垫在整个实验过程中保持开启状态。温度测量在实验开始和结束时进行。尽管温度波动范围为±2 °C，但热区与冷区之间仍保持至少8 °C的温差。
    3. 将装有1只 gravid 雌虫的试管倒置，插入每个十字容器中心的开口处。待雌虫进入十字容器后，移除试管并用小盖子封闭开口。待所有十字容器均封闭后，在架子前方放置一块黑色纸板，以围蔽整个实验装置。实验持续运行4小时。
    4. 之后，小心用试管捕捉并移出雌虫，检查各基底上是否有产卵。
    5. 标记每个十字容器中各培养皿盖子上的基底类型。使用70%乙醇清洁十字容器（包括内部和盖子），去除本次实验残留的气味。
      注意：若实验结束后无法立即计数卵数，可将含基底的培养皿在-20 °C条件下保存。
  4. 卵数统计
    注意：若培养皿中的基底已被冷冻，请在计数前先解冻。
    1. 使用体视显微镜统计每种基底上的产卵数量。可借助毛刷和水辅助分离卵粒以便计数。

3. 数据分析与统计

  1. 偏好指数的计算
    1. 针对每一份幼虫（n = 36）和雌虫（n = 30）的重复实验，通过计算存在于新鲜（Fresh）基质（Fresh hot 和 Fresh cold）上的幼虫或卵的数量占所有基质上（fresh hot + fresh cold + rotten hot + rotten cold）幼虫或卵总数的比例，来计算肉类偏好指数（记为 PImeat）。
      PImeat = （存在于新鲜基质上的幼虫或卵数量）/ 幼虫或卵总数
      ​注意：术语 "Hot" 和 "Cold" 分别表示温度条件为 33 ± 2 °C 和 25 ± 2 °C。
    2. 同样地，针对每一份幼虫和雌虫的重复实验，计算温度偏好指数（PItemp），即存在于高温（Hot）基质（fresh Hot 和 rotten Hot）上的幼虫或卵数量除以所有基质上（fresh hot + fresh cold + rotten hot + rotten cold）幼虫或卵的总数。
      PItemp = （存在于高温基质上的幼虫或卵数量）/ 幼虫或卵总数
      ​注意：接近 1 的值表示偏好新鲜或高温基质，接近 0 的值表示偏好腐烂或低温基质。偏好指数（PI）可手动计算，也可使用提供的代码（补充文件 S1 和 补充文件 S2）进行计算。
  2. 将观察到的偏好与模拟的随机数据进行比较
    1. 运行提供的代码（补充文件 S1 和 补充文件 S1），以生成模拟数据，并将其与观察数据进行比较。
      注意：该代码为幼虫和雌虫生成 1000 组模拟随机数据集，并计算每组模拟数据以及 L. cuprina 实际观察数据的偏好指数（PI）。模拟假设幼虫和雌虫对基质无偏好，选择行为是随机的。模拟过程纳入了动物行为的关键特征，涵盖多种情景，例如幼虫不选择任何基质的概率，成年雌虫将产卵集中在单一基质上，或在不同基质之间均匀或非均匀地产卵分布。采用广义线性模型（GLM，分布族：拟二项分布；连接函数：logit）将行为实验中获得的观察数据与模拟的随机数据进行比较。由于偏好指数（PI）的取值范围在 0 到 1 之间，具有边界性，所选用的 GLM 非常适合此类分析。广义线性模型能够有效处理非正态分布的响应变量，支持稳健的统计比较。这一模型选择有助于通过将行为实验的观察数据与模拟随机数据生成的复杂模式进行有效对比，获得有意义的结论。对于其他结构化数据集，可能需要对代码进行少量调整。

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结果

为了证明所提出方法的有效性，实验采用实验室种群进行 Lucilia cuprina （丽蝇科），一种兼性寄生的丽蝇2该物种获得的全部原始数据集可在此处找到 补充文件 S3 与幼虫和雌虫基质偏好实验的结果进行比较。为了评估幼虫和雌虫是否对任一基质具有偏好性，将观测数据与1000组模拟数据集进行比较，每组模拟数据代表随机选择（见代码） 补充文件 S1）。具有统计学意义的比较所占的百分比（p < 0.05）被用作评估偏好的指标。分析结果表明，幼虫对腐烂基质表现出显著偏好 25 °C (图6A, 表1）因为观测数据与每个模拟随机选择数据集之间的全部1000次比较在肉类和温度条件下均显示出显著差异。同样，雌性个体也表现出对 25 °C：在观察数据与随机选择之间的比较中，有69.7%具有显著性差异（图6B, 表1）。然而，它们...

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讨论

了解取食习性的演化，特别是在丽蝇寄生行为背景下的取食习性，需要研究丽蝇在不同生活阶段对取食或产卵基质的偏好。因此，本研究提出了一套可靠且简便的方法，用于探究丽蝇幼虫和雌成虫对基质的偏好性。这些方法已在 Lucilia cuprina一种兼性寄生的丽蝇2有趣的是，实验揭示了在25 °C条件下对腐肉具有明显的趋向性 L. cuprina 幼虫，符合腐食性物种通常所利用的条件。这与Fouche等人的一项研究结果不同40，表明其更偏好新鲜的肝脏底物 Lucilia sericata 和 丝光绿蝇 并表明腐烂的基质对存活和生长产生了负面影响。然而，由于肉类腐败程度（七天）不同，很难对这两项研究的结果进行比较。 与 五个（在本例中）以及分解过程（完全厌氧） 与 好氧和厌氧条件（在本研究中）存在差异，所使用的物种也不同。此外，本研究中实验的观察结果表明，雌虫更倾向于在25 °C条件下产卵，而对于腐肉仅表现出轻微的偏好。这些结果表明，幼虫与雌虫的选择并...

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致谢

我们感谢 Patrícia J. Thyssen、Gabriela S. Zampim 和 Lucas de Almeida Carvalho 提供了L. cuprina种群，并在实验建立过程中给予协助。我们还要感谢 Rafael Barros de Oliveira 对视频的拍摄与剪辑。本研究得到了动物行为学会（Animal Behavior Society）向 V.A.S.C. 提供的发展中国家研究资助，以及 T.T.T. 获得的圣保罗研究基金会 FAPESP Dimensions US-Biota-São Paulo 项目资助（20/05636-4）。S.T. 和 D.L.F. 分别获得了圣保罗研究基金会 FAPESP 的博士后资助（19/07285-7）和博士奖学金（21/10022-8）。V.A.S.C. 和 A.V.R. 获得了巴西国家科学技术发展委员会 CNPq 的博士奖学金资助（编号分别为 141391/2019-7 和 140056/2019-0）。T.T.T. 获得了巴西国家科学技术发展委员会 CNPq 的资助（310906/2022-9）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂Sigma-Aldrich05038-500G用于微生物学
黑色纸板--70x50 cm
含抗凝剂的牛血 --50% 纯牛血加抗凝剂（3.8% 枸橼酸钠）+ 50% 过滤水
牛绞肉--脂肪含量约 7-8%
刷子--塑料制成
锥形管Falcon 或通用品牌-50 mL
十字形玻璃容器手工制作NA48x48 cm，高 8 cm，宽 8 cm
锥形瓶VidrolaborNA500 mL
70% 乙醇SynthA1084.01.BL70% 无水乙醇 + 30% 过滤水
量筒Nalgon 或通用品牌-500 mL 和 50 mL
加热垫Thermolux-尺寸 30x40 cm，功率 40 W，电压 127 V
红外测温仪HeTaiDaHTD8808非接触式体温计（采样速率：0.5 S，
精度：±0.2 °C，
测量距离：5-15 cm）
培养皿（玻璃）PrecisionNA尺寸 150x20 mm
          （注：若仅使用一次，培养皿可为塑料材质）
聚苯乙烯培养皿Cralplast18130尺寸 60x15 mm
塑料巴斯德吸管--3 mL（总体积）
枸橼酸钠SynthC11033.01.AG3.8% 枸橼酸钠（38 g 溶于 1 L 过滤水中）
勺子--需准备多个勺子，每种肉类基质各用一把。建议使用不锈钢材质。
不锈钢刮刀通用品牌-一端扁平，另一端呈勺状
体视显微镜Bioptika-WF10X/22 镜头
镊子--金属材质，尖端精细
白色 LED 灯带NANA4.8 W，2x0.05 mm²，320 流明，色温：6500 K（白色）

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