小鼠肺静脉心肌袖的显微解剖与免疫荧光染色

摘要

本方案展示了在显微镜引导下分离小鼠肺静脉并进行免疫荧光染色的方法。我们制备包含左心房、肺静脉及相应肺组织的样本，并对心肌肌钙蛋白T和连接蛋白43进行染色。

摘要

肺静脉（PVs）是心房心律失常中异位搏动的主要来源，在心房颤动（AF）的发生和发展中起着关键作用。肺静脉含有由心肌细胞组成的心肌袖（MS）。由于心肌袖与心脏工作心肌具有相似性，包括产生异位电冲动的能力，因此参与了心房颤动的启动和维持。啮齿类动物被广泛使用，可能是研究肺静脉心肌的优良动物模型，因为其血管壁各处均广泛存在心肌细胞。然而，由于器官体积小且解剖结构复杂，小鼠肺静脉的精确显微解剖和制备具有挑战性。

我们展示了一种在显微镜引导下进行显微解剖的实验方案，用于分离小鼠左心房（LA）及其肺静脉（PVs）。通过使用心肌肌钙蛋白T（cTNT）和连接蛋白43（Cx43）抗体进行免疫荧光染色，完整地显示左心房和肺静脉的结构。在10倍和40倍放大倍数下成像，可全面观察肺静脉的结构，并深入揭示心肌组织的精细架构，尤其突出显示连接蛋白43在心肌袖（MS）中的存在。

引言

心房颤动（AF）是最常见的持续性心律失常¹。随着发病率持续上升，预计到2060年欧洲将有约1790万例AF患者¹。AF在临床上具有重要意义，因其是心肌梗死、心力衰竭和卒中发生的重要危险因素，给个体、社会及社会经济带来巨大负担¹。尽管AF已被认识数十年，但其病理生理机制仍未完全阐明²。

早在20世纪90年代末，研究就已表明肺静脉（PVs）在房颤（AF）的启动和维持中具有重要作用，因为它们是触发房颤的异位搏动的主要来源³。研究表明，肺静脉在结构上与其他血管不同。典型的血管含有平滑肌细胞，而肺静脉的中膜层还包含心肌细胞⁴。在啮齿类动物中，这种心肌组织普遍存在于整个肺静脉，包括肺内和肺外部分以及开口区域⁵。在人类中，肺静脉也含有心肌细胞，这些细胞可见于左心房（LA）心肌的延伸部分——即所谓的心肌袖（MS）^6,7。

肌袖（MS）在形态学上与心房心肌具有相似性

方案

动物饲养和所有实验操作均遵循慕尼黑路德维希-马克西米利安大学动物护理与伦理委员会的指导方针，所有涉及小鼠的操作均获得上巴伐利亚政府批准（ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215、ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46、ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86、ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178、ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170）。C57BL6/N 小鼠为商业购得。

1. 准备

1. 取3 mg琼脂糖与100 mL 1×Tris缓冲盐溶液，加入500 mL锥形瓶中，配制3%琼脂糖凝胶。将溶液置于微波炉中，600 W加热2–3分钟，直至凝胶完全均匀。
2. 将凝胶轻轻倒入直径为100 mm的培养皿中，制备解剖盘，使凝胶填充培养皿一半体积。清除凝胶中的气泡，确保其均匀一致。静置解剖盘，待凝胶完全凝固后冷却备用。
3. 根据表1提供的配方，配制所有所需缓冲液和溶液，包括固定液、通透液、封闭缓冲液和洗涤缓冲液。

2. 器官收获与组织制备

注意：有关小鼠麻醉及心脏采集的详细实验方案已有文献发表^17....

结果

我们对10只12至16周龄的小鼠进行了肺静脉（PV）的显微解剖、染色和成像。按照实验方案，我们在所有实验小鼠中成功地将肺静脉与左心房（LA）一同进行显微解剖，并在其中8只小鼠中获得了能够全面观察肺静脉结构的组织切片。使用10倍物镜拍摄整体图像，以识别左心房-肺静脉连接处的肺静脉口（PVO）区域、肺外肺静脉（PV_ex）（位于肺门与左心房-肺静脉连接处之间的肺静脉）以及肺内肺静脉（PV_in）（被肺组织包绕的肺静脉）（图2）。随后使用40倍物镜对上述区域进行放大成像（图3）。

我们在PVO、PV_ex和PV_in中均检测到具有典型肌性条纹的特异性cTNT信号（图3）。Cx43在所有三个PV区域均有发现，主要分布于相邻心肌细胞之间（图3和

讨论

通过本实验方案，我们分享了一种区分并分离小鼠心脏肺静脉（PVs）的方法，并对其进行免疫荧光染色。器官收获后，将心脏和肺组织置于无菌蔗糖溶液中脱水，随后在显微镜引导下分离心室、心房及肺叶。接着制备心脏基底部以暴露肺静脉，然后在肺门处将其从肺组织上切下。后续的免疫荧光染色采用冷冻切片技术，即将组织包埋于O.C.T. 化合物中，使用冷冻切片机进行切片，并对心肌肌钙蛋白T（cTNT）和连接蛋白43（Cx43）进行免疫荧光染色。

分离肺静脉（PVs）有助于研究其在心房颤动（AF）心律失常发生中的作用。然而，小鼠肺静脉的分离具有挑战性。除了体积微小之外，肺静脉还隐藏在主支气管和心脏基底部显著的血管结构后方，极大地增加了检测难度。本方案提供了一种简单且清晰的方法来研究小鼠肺静脉，并以经济高效的方式详细分析其形态学特征。所提出的组织 harvesting 与制备方法可保持肺静脉、相应肺叶与左心房（LA）之间的解剖关系，便于对完整的左心房-肺静脉组织复合体进行研究。

心外膜下神经节丛（MS）具有异质性排列。在包括大鼠和人类在内的多个物种中，已描.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
黏附载玻片	Epredia	10149870
AF568 二抗	Invitrogen	A11036	宿主：山羊，反应性：兔
琼脂糖	Biozym LE	840104
Alexa Fluor 488 二抗	Cell Signaling Technology	4408S	宿主：山羊，反应性：小鼠
抗连接蛋白 43 /GJA1 抗体	Abcam	ab11370	多克隆抗体，克隆号：GJA1，宿主：兔
抗心肌肌钙蛋白 T 抗体	Invitrogen	MA5-12960	单克隆抗体，克隆号：13-11，宿主：小鼠
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A2153
刷子	Lukas	5486	6 号
盖玻片	Epredia		24 mm × 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70	Epredia		设置：样本温度：-18 °C，刀片温度：-25 °C
DFC365FX 相机	Leica
DM6 B 荧光显微镜	Leica
干冰
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）1× 浓缩液	Gibco	14040133	500 mL
Dumont #5FS 镊子	F.S.T.	91150-20	需 2 把
精细剪刀	F.S.T.	14090-09
荧光封片介质	DAKO	S3023
Graefe 镊子	F.S.T.	11052-10
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	细胞核复染剂
ImageJ	FIJI		图像分析与处理软件
LAS X	Leica		Leica DM6 B 显微镜成像软件
切片机刀片 S35	Feather	207500000
微波炉
正常山羊血清	Sigma-Aldrich	S26-M
O.C.T. 包埋剂	Tissue-Tek	4583
16% 多聚甲醛	Pierce	28908	无甲醇
巴斯德吸管	VWR	612-1681
培养皿	TPP	93100	直径 100 mm
3D 数字摇床	IKA Schüttler	00040010000
染色缸	EasyDip	M900-12
样本模具	Tissue-Tek Cryomold	4557	25 mm × 20 mm × 5 mm
StainTray M920 染色系统	StainTray	631-1923	适用于 20 张载玻片的染色系统
Sterican 针头	Braun	4657705	G 27 — 用于实验步骤（步骤 2）中的注射以及（步骤 3 和 4）中的固定
学生型 Vannas 弹簧剪	F.S.T.	91500-09
Super PAP Pen 液体阻断笔	Super PAP Pen	N71310-N
注射器	Braun	4606108V	10 mL
Tris 碱	Roche	TRIS-RO	1× Tris 缓冲盐水（TBS）的组分
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287