本文介绍了一种通过联合使用慢病毒载体过表达Scleraxis并施加单轴拉伸，由iPSC来源的间充质基质细胞生成诱导性肌腱细胞（iTenocytes）的方法。 通过 二维生物反应器
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本文内容
摘要
摘要
当前肌腱与韧带修复面临的挑战迫切需要确定一种适合且有效的基于细胞的治疗候选方案，以促进肌腱再生。间充质基质细胞（MSCs）已被探索作为肌腱修复的一种潜在组织工程策略。尽管这类细胞具有多向分化潜能和再生潜力 体内，它们的自我更新能力有限，且表现出表型异质性。诱导性多能干细胞（iPSCs）由于具有高度的自我更新能力和无与伦比的发育可塑性，能够克服这些局限。在腱细胞发育过程中，Scleraxis（Scx）是肌腱分化的关键直接分子调控因子。此外，机械调控已被证实是引导胚胎期肌腱发育与修复的核心因素。因此，我们开发了一种实验方案，以包载生物学刺激与机械刺激的协同效应，这可能对生成腱细胞至关重要。首先将iPSCs诱导转化为间充质基质细胞（iMSCs），并通过流式细胞术检测经典的间充质基质细胞标志物对其进行表征。随后，利用慢病毒载体对iMSCs进行转导，使其稳定过表达SCX（iMSCSCX+ 这些iMSCSCX+ 细胞可通过使用二维生物反应器施加单轴拉伸负荷，进一步成熟为诱导型肌腱细胞（iTenocytes）。通过观察早期和晚期肌腱标志物的上调以及胶原蛋白沉积，对所得细胞进行表征。该诱导生成iTenocytes的方法可帮助研究人员开发一种潜在无限、即用型的同种异体细胞来源，用于肌腱细胞治疗应用。
引言
为应对肌腱和韧带修复中的当代难题，需要寻找一种适用于细胞治疗的合适细胞候选物。在组织工程领域，肌腱修复的一个研究方向是探索骨髓来源的间充质基质细胞（BM-MSCs）和脂肪组织来源的基质细胞（ASCs）作为潜在策略。这些细胞具有多向分化潜能、来源丰富且在体内具备再生潜力in vivo。此外，它们在动物模型中已显示出增强的愈合能力和改善的功能性结果1。然而，这些细胞存在自我更新能力有限、表型异质性以及尤为突出的肌腱形成能力不足等问题。诱导性多能干细胞（iPSC）技术因其卓越的自我更新能力和无与伦比的发育可塑性，为克服上述限制提供了可能。本研究团队及其他研究者已成功将iPSC定向分化为类似间充质基质细胞的细胞（iMSCs）2,3。因此，iMSCs有望成为异体来源的肌腱细胞治疗应用的新选择。
Scleraxis（SCX）是一种对肌腱发育至关重要的转录因子，被认为是可检测到的最早期分化肌腱细胞标志物。此外，SCX 可激活下游的肌腱分化标志物，包括I型胶原α1链（COL1a1）、Mohawk（MKX）和Tenomodulin（TNMD）等4,5,
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方案
该诱导成腱细胞（iTenocytes）的实验方案可分为三个主要步骤：iPSCs诱导为iMSCs（10天），iMSC诱导为iMSCSCX+（2周），iMSCSCX+诱导为iTenocytes（至少4天）。根据实验时间安排，该方案的每个主要步骤均可暂停并在后续恢复。涉及细胞培养的操作均应采用无菌技术。本方案中所有细胞均应在37 °C、5% CO2和95%湿度条件下培养。
1. 人类iPSC向诱导型间充质基质细胞（iMSCs）的诱导
- 实验准备
- 制备Iscove改良Dulbecco培养基-拟胚体（IMDM-EB）培养液。
- 在50 mL IMDM基础培养基中添加8.5 mL无血清替代物（knock-out serum replacement）、500 µL最低必需培养基（MEM）非必需氨基酸、0.385 µL（110 mM母液）β-巯基乙醇和500 µL抗生素-抗真菌溶液（AAS）（终浓度分别为17%、1%、110 µM、1%）（参见材料表）。
- 制备间充质基质细胞（MSC）培养液。
- 在440 mL低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中加入50 mL胎牛血清（FBS）、5 m....
- 制备Iscove改良Dulbecco培养基-拟胚体（IMDM-EB）培养液。
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结果
人iPSC向iMSC的分化
如先前所述，将iPSC分化为iMSC的现有方案涉及拟胚体的形成2。该过程约需十天即可从iPSC诱导生成iMSC（图1A）。然而，强烈建议对新生成的iMSC至少传代两次。这不仅有助于避免使用明胶包被的培养板，还能建立稳定的MSC表型表达。分化后经六次传代进行的流式细胞术定量分析显示，细胞群体几乎均一，高表达经典的MSC表面标志物，包括CD44（83.1%）、CD90（88.4%）和CD105（99.2%）17,18（图1B）。在形态学方面，iMSC应与骨髓来源的MSC高度相似，呈细长的成纤维细胞样形态（图1C）。
利用慢病毒转导技术对iMSCs进行基因工程改造.......
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讨论
在本实验方案中，诱导性肌腱细胞（iTenocytes）的生成分为三个主要步骤：（1）将诱导性多能干细胞（iPSCs）诱导为诱导性间充质干细胞（iMSCs）；（2）利用慢病毒载体过表达SCX；（3）通过二维单轴张力促进细胞成熟。
我们课题组此前已描述过将iPSCs诱导分化为iMSCs的实验方案2。自该论文发表以来，已开发出多种新方案，包括已用于临床试验的iMSCs标准化分化方案21,22,23，以及商业化的分化试剂盒。iMSCs的三系分化潜能此前也已有综述报道2。尽管不同方法之间存在差异，但所有方案均强调在诱导分化后需对iMSCs进行多代扩增，以确保间充质干细胞表面标志物的稳定表达。在此阶段，当细胞融合度达到约70%时以1:3的比例传代，传代后4–6天即可获得相对融合的培养板。
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披露
所有作者均无利益冲突需要披露。
致谢
本研究部分得到了美国国立卫生研究院/国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH/NIAMS）K01AR071512 项目以及加州再生医学研究所（CIRM）DISC0-14350 项目对 Dmitriy Sheyn 的资助。两种慢病毒包装质粒由西蒙·诺特（Simon Knott）实验室（加州大学洛杉矶分校西达赛奈医学中心生物医学科学系）惠赠。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | 细胞解离试剂 |
| 抗生素-抗真菌素溶液 | Thermofisher | 15240096 | |
| 抗-CD105 | Ancell | 326-050 | |
| APC标记的小鼠抗人CD44抗体 | BD Biosciences | 559942 | |
| APC标记的小鼠IgG2K同型对照抗体 | BD Biosciences | 555745 | |
| BenchMark胎牛血清 | GeminiBio | 100-106 | |
| 双糖链蛋白聚糖（Biglycan） | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
| 牛血清白蛋白 | Millipore Sigma | A3733 | |
| I型胶原人α1链TaqMan引物 | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
| III型胶原人α1链TaqMan引物 | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
| 二甲基亚砜 | Millipore Sigma | D8418 | |
| DMEM，低糖，含丙酮酸，无谷氨酰胺，无酚红 | Thermofisher | 11054020 | |
| 伊格尔最低必需培养基（EMEM） | ATCC | 30-2003 | |
| 牛血浆纤维连接蛋白 | Sigma Aldrich | F1141 | |
| FITC标记的小鼠抗人CD90抗体 | BD Biosciences | 555595 | |
| 猪皮明胶 | Sigma Aldrich | G1890 | |
| 山羊抗小鼠IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
| HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
| IMDM，无酚红 | Thermofisher | 21056023 | |
| iPSCs: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC核心设施 | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
| 同型对照抗体，小鼠IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
| KnockOut血清替代物 | Thermofisher | 10828010 | |
| L-抗坏血酸 | Sigma Aldrich | A4544 | |
| L-谷氨酰胺 | Thermofisher | 2503081 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | 基底膜基质 |
| MechanoCulture FX | CellScale | N/A | 拉伸装置 |
| MEM非必需氨基酸溶液 | Thermofisher | 11140050 | |
| Mohawk人TaqMan引物 | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
| PBS | Thermofisher | 10010023 | |
| 血小板源性生长因子受体A人TaqMan引物 | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
| 聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯） | Sigma Aldrich | 192066 | |
| Polybrene感染/转染试剂 | Millipore Sigma | TR-1003 | |
| 重组人 TGF-β1蛋白人TaqMan引物 | RnD Systems | 240-B | |
| Scleraxis人TaqMan引物 | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
| SCXA（SCX）（NM_00108050514）人标签ORF克隆 | OriGene | RC224305L4 | |
| 硅胶培养板 | CellScale | N/A | |
| 叠氮化钠 | Millipore Sigma | S2002 | |
| 腱生蛋白C人TaqMan引物 | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
| 腱调节蛋白人TaqMan引物 | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
| 血小板反应蛋白4人TaqMan引物 | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
| 转染试剂BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | Thermofisher | 25200072 | |
| 微管蛋白聚合促进蛋白家族成员3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
| Y-27632二盐酸盐 | Biogems | 1293823 |
参考文献
- Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. Current progress in tendon and ligament tissue engineering. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).
- Sheyn, D., et al.
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