诱导多能干细胞来源的诱导型肌腱细胞的生成 通过 联合Scleraxis过表达与二维单轴拉伸

摘要

本文介绍了一种通过联合使用慢病毒载体过表达Scleraxis并施加单轴拉伸，由iPSC来源的间充质基质细胞生成诱导性肌腱细胞（iTenocytes）的方法。 通过 二维生物反应器

摘要

当前肌腱与韧带修复面临的挑战迫切需要确定一种适合且有效的基于细胞的治疗候选方案，以促进肌腱再生。间充质基质细胞（MSCs）已被探索作为肌腱修复的一种潜在组织工程策略。尽管这类细胞具有多向分化潜能和再生潜力 体内，它们的自我更新能力有限，且表现出表型异质性。诱导性多能干细胞（iPSCs）由于具有高度的自我更新能力和无与伦比的发育可塑性，能够克服这些局限。在腱细胞发育过程中，Scleraxis（Scx）是肌腱分化的关键直接分子调控因子。此外，机械调控已被证实是引导胚胎期肌腱发育与修复的核心因素。因此，我们开发了一种实验方案，以包载生物学刺激与机械刺激的协同效应，这可能对生成腱细胞至关重要。首先将iPSCs诱导转化为间充质基质细胞（iMSCs），并通过流式细胞术检测经典的间充质基质细胞标志物对其进行表征。随后，利用慢病毒载体对iMSCs进行转导，使其稳定过表达SCX（iMSC^SCX+ 这些iMSC^SCX+ 细胞可通过使用二维生物反应器施加单轴拉伸负荷，进一步成熟为诱导型肌腱细胞（iTenocytes）。通过观察早期和晚期肌腱标志物的上调以及胶原蛋白沉积，对所得细胞进行表征。该诱导生成iTenocytes的方法可帮助研究人员开发一种潜在无限、即用型的同种异体细胞来源，用于肌腱细胞治疗应用。

引言

为应对肌腱和韧带修复中的当代难题，需要寻找一种适用于细胞治疗的合适细胞候选物。在组织工程领域，肌腱修复的一个研究方向是探索骨髓来源的间充质基质细胞（BM-MSCs）和脂肪组织来源的基质细胞（ASCs）作为潜在策略。这些细胞具有多向分化潜能、来源丰富且在体内具备再生潜力in vivo。此外，它们在动物模型中已显示出增强的愈合能力和改善的功能性结果¹。然而，这些细胞存在自我更新能力有限、表型异质性以及尤为突出的肌腱形成能力不足等问题。诱导性多能干细胞（iPSC）技术因其卓越的自我更新能力和无与伦比的发育可塑性，为克服上述限制提供了可能。本研究团队及其他研究者已成功将iPSC定向分化为类似间充质基质细胞的细胞（iMSCs）^2,3。因此，iMSCs有望成为异体来源的肌腱细胞治疗应用的新选择。

Scleraxis（SCX）是一种对肌腱发育至关重要的转录因子，被认为是可检测到的最早期分化肌腱细胞标志物。此外，SCX 可激活下游的肌腱分化标志物，包括I型胶原α1链（COL1a1）、Mohawk（MKX）和Tenomodulin（TNMD）等^4,5,6。在肌腱成熟过程中表达的其他基因还包括微管聚合促进蛋白家族成员3（TPPP3）和血小板源性生长因子受体α（PDGFRa）⁷。尽管这些基因对肌腱的发育和成熟至关重要，但遗憾的是它们并非肌腱组织所特有，也在骨或软骨等其他肌肉骨骼组织中表达^5,7。

除了肌腱发育过程中标志物的表达外，机械刺激也是胚胎期肌腱发育和修复的关键因素^4,5,6。肌腱具有力学响应性，其生长模式会随环境变化而改变。在分子层面，生物力学信号影响腱细胞的发育、成熟、维持及修复反应⁸。已有多种生物反应器系统被用于模拟生理负荷和生物力学信号。这些模型系统包括离体（ex vivo）组织加载、应用于细胞的二维（2D）双向或单向拉伸加载系统，以及利用支架和水凝胶的三维（3D）系统^9,10。在研究机械刺激对腱特异性基因表达或细胞形态（在细胞命运背景下）的影响时，2D系统具有优势；而3D系统则能更准确地模拟细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用^9,10。

在二维加载系统中，细胞与培养基质之间的应变是均匀的，这意味着可以完全控制施加在细胞骨架上的载荷。与双轴加载相比，单轴加载更具生理相关性，因为腱细胞在体内主要受到来自胶原纤维束的单轴加载in vivo⁹。研究发现，在日常活动中，肌腱所承受的单轴拉伸载荷可高达6%的应变¹¹。具体而言，先前的研究表明，在4%–5%的生理应变范围内加载可促进成腱分化，表现为维持腱相关标志物（如SCX和TNMD）的表达以及增加胶原蛋白的生成^9,10。超过10%的应变可能具有创伤相关性，但不具生理相关性^12,13。

在此，我们介绍一种方案，该方案考虑了机械刺激与生物刺激的协同效应，这种协同效应可能对肌腱细胞的生成至关重要。我们首先描述了一种可重复的方法，用于将诱导性多能干细胞（iPSCs）诱导为诱导性间充质干细胞（iMSCs） 通过 短时间暴露类胚体于生长因子，通过流式细胞术检测间充质干细胞表面标志物加以验证。随后，我们详细描述了一种慢病毒转导方法，用于构建稳定过表达SCX的iMSC（诱导性间充质干细胞）^SCX+）。为进一步促进细胞成熟，iMSC^SCX+ 接种于纤维连接蛋白包被的硅胶培养板中，并使用CellScale MCFX生物反应器进行优化的单轴拉伸处理。通过检测早期和晚期肌腱标志物的上调以及胶原沉积，验证了其向肌腱分化的潜能。¹⁴该方法生成诱导性肌腱细胞是一种概念验证，可能为肌腱细胞治疗应用提供一种无限、即用型、同种异体的细胞来源。

方案

该诱导成腱细胞（iTenocytes）的实验方案可分为三个主要步骤：iPSCs诱导为iMSCs（10天），iMSC诱导为iMSC^SCX+（2周），iMSC^SCX+诱导为iTenocytes（至少4天）。根据实验时间安排，该方案的每个主要步骤均可暂停并在后续恢复。涉及细胞培养的操作均应采用无菌技术。本方案中所有细胞均应在37 °C、5% CO₂和95%湿度条件下培养。

1. 人类iPSC向诱导型间充质基质细胞（iMSCs）的诱导

1. 实验准备
   1. 制备Iscove改良Dulbecco培养基-拟胚体（IMDM-EB）培养液。
      1. 在50 mL IMDM基础培养基中添加8.5 mL无血清替代物（knock-out serum replacement）、500 µL最低必需培养基（MEM）非必需氨基酸、0.385 µL（110 mM母液）β-巯基乙醇和500 µL抗生素-抗真菌溶液（AAS）（终浓度分别为17%、1%、110 µM、1%）（参见材料表）。
   2. 制备间充质基质细胞（MSC）培养液。
      1. 在440 mL低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中加入50 mL胎牛血清（FBS）、5 mL抗生素-抗真菌溶液（AAS）和5 mL L-谷氨酰胺（终浓度分别为10%、1%、2 mM）。
   3. 制备聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）（poly-HEMA）包被的培养板。
      1. 将10 g poly-HEMA（参见材料表）加入无菌瓶中。
      2. 向瓶中加入磁力搅拌子，在搅拌下缓慢加入500 mL 95%乙醇（EtOH）。
      3. 待所有乙醇加入后，以1200 rpm转速搅拌，并辅以低热加热至少6小时。poly-HEMA溶液可在室温下保存长达一年。
      4. 在无菌条件下，向T75培养瓶中每瓶加入9 mL含2.5 µg/cm²的溶液。根据培养容器的大小调整体积。
      5. 保持无菌状态，让容器自然晾干，使乙醇完全挥发后再使用。通常需要24–72小时。
   4. 制备明胶包被的培养瓶。
      1. 用NaOH清洗一个玻璃瓶，并专用于明胶制备。请勿使用洗涤剂。
      2. 配制1%明胶溶液（5 g明胶溶于500 mL无内毒素水）。将装有明胶溶液的玻璃瓶高压灭菌30分钟。
      3. 让明胶溶液冷却，可在室温下保存。
      4. 每个T75培养瓶加入5 mL明胶溶液进行包被，并在接种细胞前孵育至少1小时。明胶包被的培养瓶可提前一天制备。
   5. 制备荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液。
      1. 将PBS与2%牛血清白蛋白和0.1%叠氮化钠混合。4 °C保存。
2. 拟胚体（EBs）的生成
   注意：诱导多能干细胞（iPSCs）应在6孔板中培养，并在使用前达到70%–80%汇合度。
   1. 第0天，将一个384孔透明底PCR板放入组织培养超净台中，打开盖子进行紫外线照射15分钟。
   2. 从iPSCs（参见材料表）中移除生长培养基，并用PBS洗涤各孔。
   3. 向每孔加入0.5 mL预热的温和细胞解离试剂（参见材料表），在37 °C孵育5分钟。每隔5分钟观察一次细胞，直至iPSCs变为单细胞或小细胞团块悬浮起来。
   4. 用1 mL移液器吹打重悬细胞，确保形成单细胞悬液。
   5. 在室温下以300 × g离心5分钟。
   6. 弃去上清液，用IMDM-EB培养基（步骤1.1.1）重悬细胞，并使用血细胞计数板或细胞计数仪计数活细胞。
   7. 计算所需细胞悬液体积，使每个384孔板的每孔含有5,000–25,000个细胞，每孔加25 µL细胞悬液。
      注意：通常，2–3个汇合度为70%–80%的6孔板可制备一个384孔板的拟胚体。每个拟胚体的细胞数量需通过实验确定。对于整个384孔板，需使用9.6 mL细胞悬液，每孔25 µL。
   8. 再次在室温下以300 × g离心5分钟。
   9. 弃去上清液，将细胞重悬于适量IMDM-EB培养基中，并加入10 µM Y-27632二盐酸盐（母液：10 mM，1000倍稀释，参见材料表），置于预冷的15 mL锥形管中。
   10. 向锥形管中加入冷的溶解基底膜基质（每384孔板EBs对应1 mg）（参见材料表）。
   11. 向每孔加入25 µL细胞悬液。盖上无菌盖，于4 °C以450 × g离心7分钟。随后在37 °C孵育48小时。
   12. 第2天，将细胞转移至100 mm培养皿中，加入3 mL预热的IMDM-EB培养基。
   13. 将拟胚体转移至已准备好的poly-HEMA包被的T75培养瓶中，加入10 mL IMDM-EB培养基。根据培养容器大小调整体积。让拟胚体继续生长3天。
   14. 第5天，将拟胚体转移至已制备的明胶包被T75培养瓶中，加入10 mL IMDM-EB培养基。根据培养容器大小调整体积。继续在悬浮状态下培养3天。
   15. 第8天，应观察到两种类型的拟胚体：贴壁的拟胚体和未贴壁的拟胚体。用PBS冲洗去除未贴壁的拟胚体。
   16. 向贴壁的拟胚体中加入补充TGFβ-1（10 ng/mL）（参见材料表）的IMDM-EB培养基，并继续培养2天。
   17. 第10天，更换为MSC培养基。细胞应每周换液两次。当细胞达到70%汇合度时，执行"标准细胞传代操作流程"进行细胞重铺。将细胞重铺至明胶包被的培养板上。
3. 标准细胞传代操作流程
   1. 当贴壁细胞达到70%汇合度时，吸除培养板中的生长培养基，并用PBS洗涤。
   2. 向每个150 mm培养板中加入5 mL预热的0.25%胰蛋白酶，37 °C孵育5分钟。根据培养容器大小调整胰蛋白酶用量。
   3. 在显微镜下检查，确认大部分细胞已从培养板上脱落。若仍有细胞贴壁，可轻轻敲击培养板边缘以帮助细胞脱落。
   4. 加入两倍体积的预热生长培养基，将细胞收集至锥形管中。
   5. 在室温下以300 × g离心5分钟。弃去上清液，进行后续步骤。
4. 流式细胞术检测MSC标志物表达
   ​注意：应使用人源MSCs（如骨髓来源MSCs）作为阳性对照。
   1. 执行"标准细胞传代操作流程"（步骤1.3）。
   2. 用3 mL FACS缓冲液重悬沉淀，将全部液体转移至FACS管中。
   3. 在室温下以300 × g离心5分钟。再用FACS缓冲液洗涤两次。
   4. 向染色管中加入2 µL小鼠抗人CD90-FITC、小鼠抗人CD44-APC和抗人CD105-PE抗体（参见材料表），4 °C避光孵育45分钟。
   5. 向同型对照管中加入20 µL小鼠IgG2a-FITC、小鼠IgG1-PB和小鼠IgG1-PE抗体（参见材料表）。
   6. 4 °C避光孵育15分钟。每管加入3 mL FACS缓冲液，以300 × g离心5分钟（室温）进行洗涤。每管用250 µL FACS缓冲液重悬细胞。
   7. 使用流式细胞术分析MSC表面标志物的表达¹⁴。激发和发射波长应为：CD90-FITC，激发峰495 nm，发射峰519 nm；CD44-APC，激发峰640 nm，发射峰660 nm；CD105-PE，激发峰561 nm，发射峰574 nm。

2. iMSC 传代与扩增

1. 准备试剂
   1. 制备MSC冻存培养基。
      1. 将30 mL低糖DMEM、5 mL DMSO和15 mL FBS混合（终浓度分别为60%、10%、30%）。
      2. 使用无菌0.45 µm滤器过滤溶液，4 °C保存。
2. 传代
   注意：诱导后，iMSCs需在明胶包被的培养板上继续传代2次，之后再逐步过渡至普通塑料组织培养板。此外，当细胞融合度达到70%时，应以1:3的传代比例进行传代。
   1. 执行"标准细胞消化程序"（步骤1.3）。
   2. 将细胞重悬于MSC培养基中，并将细胞等量分至三个新的T175培养瓶（每个培养瓶直径150 mm），每瓶加入20 mL培养基。将细胞放回37 °C培养箱中。
   3. 每周更换两次培养基，使用预热的MSC培养基替换原有生长培养基。
3. 冻存
   1. 执行"标准细胞消化程序"。
   2. 将细胞重悬于1 mL MSC冻存培养基中。将1 mL细胞悬液加入冻存管，置于冻存盒中于-80 °C保存24小时，之后转移至液氮中长期保存。
4. 复苏
   1. 在15 mL离心管中准备10 mL预热的MSC培养基。
   2. 取出冻存管，浸入37 °C水浴中，轻轻摇动直至仅剩豌豆大小的冰块（约1-2分钟）。
   3. 在细胞培养超净台中，缓慢向冻存管中加入1 mL预热培养基，用移液器轻轻吹打混匀。
   4. 将冻存管中的细胞悬液转移至已准备好的含预热培养基的15 mL离心管中，于室温下以300 x g离心5分钟。
   5. 弃去上清液，用新鲜培养基重悬细胞，将细胞悬液加入一个150 mm培养板中，总体积为20 mL。根据培养瓶的大小调整体积。
   6. 将细胞在37 °C培养箱中孵育，直至可进行传代。

3. 利用慢病毒转导技术对iMSCs进行基因工程改造以过表达SCX

注意：本实验方案的此部分需要两周时间完成。

1. 培养基与试剂的制备
   1. 准备 HEK293T/17 细胞培养基。
      1. 补充材料 445 毫升 Eagle最小必需培养基 （EMEM）中加入50 mL胎牛血清和5 mL AAS（终浓度分别为10%、1%）。
   2. 制备MSC慢病毒包装培养基。
      1. 将50 mL室温FBS置于60 °C水浴中加热30 min，制备热灭活血清。
      2. 合并 445 含热灭活胎牛血清和5 mL L-谷氨酰胺的低糖DMEM（终浓度分别为10%、2 mM）
   3. 制备转染复合物。
      1. 孵育转染复合物组分（参见 材料表) 在冰上解冻：包装质粒 VSV-G 和 Delta、SCX 质粒以及 BioT^15,16.
      2. 轻轻涡旋混匀质粒并离心。测定DNA浓度。
      3. 根据DNA浓度和拟转染的培养瓶数量，计算每种组分所需的体积：对于一个T75培养瓶，转染复合物包含750 µL无血清培养基（如无血清DMEM或PBS）、7.5 µg SCX质粒、0.75 µg VSV-G质粒、6.75 µg Delta质粒和22.5 µL BioT。需额外预留体积以补偿移液误差。
      4. 轻轻吹打混匀，短暂离心。室温孵育15分钟，立即使用。
2. 转染与慢病毒制备
   警告：从第3天开始，本实验涉及慢病毒操作，因此必须采用生物安全二级以上（BSL-2+）的操作规程。工作人员必须穿戴个人防护装备，包括两层手套、护腕、护目镜、口罩、长裤和封闭式鞋具。所有废弃物和材料（包括移液器吸头、培养瓶和液体培养基）必须使用漂白剂（终浓度1%次氯酸钠）消毒至少20分钟。禁止使用真空泵。
   1. 接种 HEK293T/17 细胞。
      1. 转染前约18–24小时（第0天），将293T细胞消化并接种至T75培养瓶中。以下体积均以T75培养瓶为培养容器进行估算。请根据实际使用的细胞培养容器调整体积。
      2. 从培养瓶中移除培养基，并用 5 mL PBS 洗涤。
         注意：细胞极易从培养瓶表面脱落。加入 PBS 时应沿培养瓶壁缓慢添加，避免将溶液直接加到细胞上。
      3. 向每个培养瓶中加入 3 mL 预热的 0.25% 胰蛋白酶，于 37 °C 孵育 5 min。将细胞收集至锥形管中，在室温下以 300 x g 离心 5 min。 g.
      4. 移除上清液，用293T培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板或细胞计数仪对活细胞进行计数。
      5. 以 5.3 x 10⁴ 细胞/厘米²² 并在37 °C孵育过夜。
      6. 第二天（第1天），制备转染复合物。将细胞中的生长培养基更换为5 mL预热的MSC慢病毒包装培养基（步骤3.1.2）。
      7. 将转染复合物逐滴加入细胞中。轻轻倾斜培养皿，确保转染复合物均匀接触细胞。将细胞放回培养箱中孵育48小时。
         注意：应在24小时后（第2天）观察毒性。
      8. 48 小时后（第 3 天），用移液器小心收集含病毒的培养基至另一个锥形管中，于 300 × g 离心 5 分钟 g （室温下）
      9. 向T75培养瓶中的293T细胞加入5 mL预热的MSC慢病毒包装培养基，放回培养箱过夜。
      10. 离心后，用移液管直接将上清液通过0.45 µm无菌滤器进行过滤。将含有病毒的培养基在4 °C下保存过夜。
      11. 再过24小时（第4天），用移液器小心地将含有病毒的培养基收集到另一个锥形管中，300 × g离心5分钟。 g （室温下）
      12. 将病毒与前次收集日的病毒混合，确保溶液均匀。此时可根据实验时间安排暂停实验并后续继续。慢病毒可分装后于 -80 °C 冻存，或在继续下一步操作时暂时置于冰上保存。 "iMSCs 的 SCX 转导" （步骤 3.3）
          注意：慢病毒分装液冻融后请勿再次冻存。
3. iMSCs 的 SCX 转导
   1. 进行滴度板转导。
      1. 第0天，进行以下操作 "标准细胞传代培养操作规程".
      2. 用MSC培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板或细胞计数仪对活细胞进行计数。
      3. 在6孔板中，加入4 × 10³ 细胞/厘米²²将剩余细胞接种至另一块150 mm培养皿中，加入20 mL MSC培养基（作为对照组）。于37 °C培养24 h。
      4. 第二天（第1天），细胞融合度应达到约40%。提前将慢病毒包装生长培养基预热，并将polybrene和约3 mL慢病毒置于冰上解冻（若与病毒收集同一天进行，则保存在冰上直至使用）。
      5. 根据所需的滴度（即 12.5%、25%、50%、75%、100%），向各孔中加入含慢病毒的慢病毒包装生长培养基。加入 0.5 µL 聚凝胺（polybrene），使终浓度为 5 µg/mL（储存液浓度：10 mg/mL，参见 材料表).
      6. 轻轻晃动培养板，确保所有细胞均匀接触试剂。将培养板放回37 °C培养箱中孵育48 h。
   2. 使用流式细胞术评估SCX慢病毒滴度效率。
      1. 48小时后，进行 "标准细胞传代培养操作规程".
      2. 将细胞重悬于 PBS 中，使用血细胞计数板或细胞计数仪计数活细胞。室温下以 300 × g 离心 5 分钟 g.
      3. 吸除上清液，加入 3 mL FACS 缓冲液重悬细胞以进行洗涤。将细胞悬液转移至流式细胞术检测管中，在 300 x g 条件下离心 5 分钟 g.
      4. 重复使用FACS缓冲液洗涤两次，最后将细胞沉淀重悬于300 µL FACS缓冲液中。使用流式细胞仪检测每种滴度下GFP的表达情况。
      5. 根据滴度和细胞活力计数，确定用于转导的合适慢病毒滴度。此时可根据实验时间安排暂停实验，并在后续重新启动。
   3. 进行大规模 SCX 转导。
      注意：所列体积是针对1个150 mm培养皿或1个T175培养瓶。可根据所需的容器大小和转导规模相应调整。
      1. 第0天，进行以下操作 "标准细胞传代培养操作规程".
      2. 用MSC培养基重悬细胞，使用血细胞计数板或细胞计数仪对活细胞进行计数。以4 × 10⁴个细胞/平方厘米的密度接种细胞。³ 细胞/厘米²²在37 °C下孵育细胞24小时。
      3. 第二天（第1天），细胞汇合度应达到约40%。提前将慢病毒包装生长培养基预热，并将polybrene及预先计算好用量的慢病毒在冰上解冻。
      4. 根据确定的滴度，向各孔中加入所需量的慢病毒包装生长培养基和慢病毒。加入聚凝胺（polybrene），使其终浓度为 5 µg/mL（储存液浓度：10 mg/mL）。
      5. 第3天，在荧光显微镜下观察细胞。新生成的iMSC^SCX+ 应发出绿色荧光蛋白（GFP）荧光。将含有病毒的培养基更换为预热的MSC培养基。此时可根据实验时间安排暂停实验，随后再继续进行。

4. iMSC^SCX+ 的传代与扩增

1. 按照方案第2步所述，对iMSC^SCX+进行传代、扩增、冻存和复苏，操作与iMSCs相同。

5. 机械加载

注意：本步骤至少需要 4 天，具体时间取决于是否观察到细胞收缩现象。

1. 实验准备
   1. 准备硅胶板。
      1. 将2块硅胶板进行高压灭菌（参见材料表）。随后在无菌条件下从灭菌袋中取出硅胶板，并放入150 mm培养皿中。
      2. 在15 mL锥形管中，将130 µL纤连蛋白溶液（100倍浓缩液，参见材料表）与13 mL无菌PBS混合。反复倒置混匀数次。
      3. 向每孔硅胶板中加入400 µL纤连蛋白溶液。将培养板置于37 °C孵育至少2小时或过夜。
      4. 使用前，吸除纤连蛋白溶液，并在细胞培养超净台中晾干至少30分钟，以确保纤连蛋白溶液完全蒸发。
         注：纤连蛋白溶液可提前从孔中移除，已包被的硅胶板可在37 °C保存数周，直至使用。
   2. 制备MSC拉伸培养基。
      1. 在15 mL锥形管中，将140 µL抗坏血酸（储存液：100倍浓缩液，终浓度：50 µg/mL）加入14 mL预热的MSC培养基中，制备MSC拉伸培养基。
         注：每次更换培养基前，必须新鲜添加抗坏血酸。
2. 在硅胶板中接种iMSC^SCX+
   1. 执行"标准细胞传代操作流程"（步骤1.3）。
   2. 用MSC培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板或细胞计数仪计数活细胞。
   3. 计算获得1.25 × 10⁴ 个细胞/cm²所需的细胞悬液体积。
   4. 从15 mL锥形管中移除相应体积的MSC拉伸培养基，加入目标细胞。反复倒置以使新的细胞悬液均匀混合。
   5. 向两块硅胶板的每孔中加入400 µL新的细胞悬液。
   6. 盖上150 mm培养皿的盖子，放回37 °C培养箱中孵育24小时。
3. 单轴拉伸
   1. 次日，先用ddH₂O冲洗拉伸装置（参见材料表），再用70%乙醇冲洗。擦拭装置后置于细胞培养超净台中，并进行15分钟紫外照射灭菌。
   2. 取出已接种细胞的培养板，检查各孔细胞贴壁情况是否良好。
   3. 将一块培养板留在培养箱中作为静态对照，将另一块接种后的硅胶板放入拉伸装置中，对齐螺丝与硅胶板上的孔位。重新盖上装置盖子以维持无菌环境。
   4. 将装有接种硅胶板的装置连接至电子源（参见材料表），并放入37 °C培养箱中。
   5. 在程序中设置循环拉伸参数为4%正弦应变，0.5 Hz，每日2小时。按下启动按钮一次，开始拉伸。拉伸应立即开始。
   6. 至少持续拉伸3天。每天观察细胞状态，若观察到细胞收缩现象，则停止拉伸程序。每隔一天更换为新鲜的MSC拉伸培养基。

结果

人iPSC向iMSC的分化
如先前所述，目前将iPSC分化为iMSC的方案涉及拟胚体的形成²。该过程约需十天即可从iPSC诱导生成iMSC（图1A）。然而，强烈建议对新生成的iMSC至少传代两次。这不仅有助于避免使用明胶包被的培养板，还能建立稳定的MSC表型表达。分化后经六次传代进行的流式细胞术定量分析显示，细胞群体几乎均一，高表达经典的MSC表面标志物，包括CD44（83.1%）、CD90（88.4%）和CD105（99.2%）^17,18（图1B）。在形态学方面，iMSC应与骨髓来源的MSC高度相似，呈细长的成纤维细胞样形态（图1C）。

利用慢病毒转导技术对iMSCs进行基因工程改造以过表达SCX
通过将pLenti-C-mGFP载体（其中已插入SCXB以表达SCX-GFP⁺）及两种包装质粒共转染至HEK293T/17细胞中来产生慢病毒。转染采用BioT法^15,16，BioT（µl）与DNA（µg）的用量比为1.5:1。

转染前18-24小时，将HEK293T/17细胞以5.3 × 10⁴ 个细胞/cm²的密度接种。转染时，细胞融合度应达到80%-95%，以避免转染效率低下（图2B1，左图）。加入质粒混合物后24小时内可观察到一定程度的细胞毒性，48小时时达到峰值（图2B2）。由于SCX慢病毒载体与GFP偶联，转染后48小时应可观察到GFP表达（图2B3）。在出现明显细胞毒性的前提下，若同时观察到GFP表达，则是转染成功的可靠指标。慢病毒颗粒分别在转染后48小时和72小时收集，并通过流式细胞术和基因表达分析评估转导效率。以GFP阳性细胞的绝对荧光强度作为SCX整合拷贝数的替代指标，结果显示高滴度组的信号显著更强（图3A）。转导效率以SCX-GFP⁺细胞所占百分比表示，其呈现明显的剂量-反应关系，随慢病毒载量增加而提高（图3B）。对不同传代次数的iMSC^SCX+ 进行流式细胞术检测，也显示出高度稳定性，外源基因表达水平及转导细胞比例均无变化（图3C）。此外，在未经分选、常规培养4周后，iMSC^SCX+ 仍维持SCX的稳定高表达（图3D）。大规模转导实验根据病毒滴度进行，使用了75%的慢病毒上清（图2C）。

iMSC^SCX+的机械加载
将iMSC^SCX+细胞以1.25 × 10⁴ cells/cm²的细胞密度接种于可变形的硅胶板上（图4A、B），以在启动拉伸程序前允许细胞贴附。最终接种密度经过优化，以防止单层细胞过度生长。值得注意的是，过高的接种密度会导致细胞过早收缩和早期死亡（图4D）。对于静态对照组，细胞接种于相同的板中，但不进行任何拉伸处理。iMSC^SCX+细胞在二维生物反应器中接受拉伸处理，持续至少三天，最长七天，拉伸参数为4%单轴应变、0.5 Hz，每天2小时。该拉伸方案与文献中描述的生理相关条件一致⁹。经过数天拉伸后，与呈现随机排列的静态组相比，可观察到一定程度的细胞有序排列（图4C）。对肌动蛋白纤维进行鬼笔环肽染色进一步显示，细胞趋向于垂直于拉伸方向生长，而静态组的细胞则呈随机排列（图4E）。为表征新生成的iTenocytes，按照先前报道的方法¹⁴，在拉伸后第3天和第7天收集细胞进行基因表达分析。基因表达分析表明，iMSC^SCX+细胞具有力学响应性，与第0天的iMSCs相比，在第3天和第7天，成腱相关基因（SCX、THBS4、COL1a1、BGN、MKX和TPPP3）均显著上调^5,7,19,20（图5A）。此外，在拉伸7天后，iMSC^SCX+拉伸组培养基中的胶原沉积量显著高于所有其他组（图5B）。

图 1：iMSC 分化示意图及流式细胞术表征。（A）iTenocyte 生成的整体示意图及 iMSC 诱导的时间线。经 Papalamprou A. 等人¹⁴许可转载。（B）流式细胞术定量结果显示，在分化后经过6代培养的iPSC来源的MSC中，表达经典MSC表面标志物的细胞比例较高。经 Sheyn D. 等人²许可改编。（C）分化后细胞的相差显微图像显示成纤维细胞样形态。比例尺 = 200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图2iMSC^SCX+ 生产示意图 (A) 转染实验的整体示意图，使用 2^nd 生成SCX慢病毒载体并转导iMSCs。经Papalamprou A.等人许可转载。¹⁴. (B1) 加入质粒混合物之前的 HEK293T/17 细胞。 (B2) HEK293T/17细胞在48小时后表达GFP并表现出毒性。B3在HEK293T/17细胞中可观察到GFP的表达，表明转染成功。C) 生成的iMSC^SCX+ 细胞（75% 滴度）表达 SCX-GFP⁺ 在细胞核中。比例尺 = 400 µm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图3：通过流式细胞术和基因表达分析确定转导效率。 使用流式细胞术检测GFP阳性细胞的绝对荧光强度，作为SCX整合的替代指标。通过流式细胞术分析所有细胞以验证病毒滴度，评估慢病毒的感染复数（MOI）。(A) 每单位病毒滴度的绝对荧光强度。(B) 转导效率以SCX-GFP⁺细胞所占百分比表示。当流式结果以GFP+细胞百分比呈现时，可观察到慢病毒载量对转导效率的剂量-反应效应。MOI，感染复数，n = 3次独立转导实验。采用单因素方差分析比较不同滴度；数据表示为均值 ± 标准差；*p < 0.05。(C) 多次传代后iMSC^SCX+ 的流式细胞术分析显示，稳定转基因表达水平及转导细胞比例均无变化。需注意，使用100%滴度转导的iMSC在P3代停止增殖。(D) 使用SCX-GFP⁺慢病毒载体（75%，MOI = 2.9 e5 TU/mL）转导iMSC，并在未分选的情况下常规培养4周后检测SCX基因表达。结果显示iMSC^SCX+中SCX表达显著上调，表明在培养4周后仍维持稳定的SCX过表达。TU，转导单位；数据表示为均值 ± 标准差，**p > 0.01。经Papalamprou A. 等人¹⁴许可转载。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：接种于二维生物反应器中的 iMSC^SCX+ 接受周期性拉伸。（A）二维生物反应器示意图。经 Papalamprou A. 等人¹² 许可转载。（B）首先将细胞接种至柔性硅胶板中，并在 37 °C 下孵育，以在二维生物反应器中进行周期性拉伸前促进细胞贴壁。（C）iMSC^SCX+ 在二维生物反应器中接受最多 7 天的拉伸处理；静态对照组细胞则接种于相同板中，但不施加拉伸。（C1）静态对照组培养 7 天后，细胞呈随机排列。（C2）拉伸组培养 7 天后，细胞排列相对更有序。（D）三种不应出现的情况示例。当细胞接种密度过高或拉伸时间过长时，细胞开始脱落。（D1）细胞轻微过度生长，黄色箭头指示细胞提前收缩的迹象。（D2）中度过度生长，细胞开始从板上脱落。（D3）严重过度生长，细胞不再以单层形式生长，已形成三维结构。黑色标尺 = 400 µm；白色标尺 = 1000 µm。（E）经过 7 天拉伸处理（或静态培养）后，细胞用鬼笔环肽标记肌动蛋白纤维（红色），并用 DAPI 复染细胞核（蓝色）。白色标尺 = 200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图5通过Scx过表达和在二维生物反应器中施加单轴拉伸刺激腱源性标志基因的表达 (A) iMSC^SCX+ 在二维生物反应器中拉伸培养7天。静态对照组细胞接种于相同的培养板中，但不进行拉伸。基因表达分析显示，iMSC^SCX+ 具有机械响应性。ND = 未检测到。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）比较每个时间点的基因表达水平 与. d0. N = 8/组。B二维生物反应器中拉伸7天后的胶原沉积。数据以均值 ± 标准差表示；n = 每组8个样本； *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。经 Papalamprou A. 等人许可转载。¹². 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

在本实验方案中，诱导性肌腱细胞（iTenocytes）的生成分为三个主要步骤：（1）将诱导性多能干细胞（iPSCs）诱导为诱导性间充质干细胞（iMSCs）；（2）利用慢病毒载体过表达SCX；（3）通过二维单轴张力促进细胞成熟。

我们课题组此前已描述过将iPSCs诱导分化为iMSCs的实验方案²。自该论文发表以来，已开发出多种新方案，包括已用于临床试验的iMSCs标准化分化方案^21,22,23，以及商业化的分化试剂盒。iMSCs的三系分化潜能此前也已有综述报道²。尽管不同方法之间存在差异，但所有方案均强调在诱导分化后需对iMSCs进行多代扩增，以确保间充质干细胞表面标志物的稳定表达。在此阶段，当细胞融合度达到约70%时以1:3的比例传代，传代后4–6天即可获得相对融合的培养板。

在选择最佳转导滴度时，必须在细胞活力和转导效率之间取得平衡。尽管使用100%滴度转导的iMSCs可能表现出最高比例的SCX-GFP阳性细胞，但值得注意的是，这些细胞在转导后经过三次传代即停止分裂（图3C），可能是由于DNA诱导的细胞毒性所致。因此，建议使用低于100%的滴度。在接种硅胶培养板之前，建议通过流式细胞术重新评估SCX-GFP的表达水平。如果数据显示转导效率低于预期阈值，则建议在接种前对iMSC^SCX+ 细胞进行分选，尤其是在进行体内实验时。

将 iMSC^SCX+ 细胞接种至硅胶培养板后，必须在 37 °C 条件下孵育过夜，以确保细胞充分贴壁后再进行拉伸。硅胶培养板中所述的 1.25 × 10⁴ 个细胞/cm² 的细胞密度经过优化，可防止单层细胞过度生长，从而避免产生静态张力²⁴。此外，研究表明，在不同刚度的基质上，汇合培养中细胞间的直接接触可能改变细胞行为^24,25,26。在预实验中，观察到部分细胞从硅胶板上明显脱落，尤其是在较晚的时间点（图 4D）。这可能是由于过度汇合导致细胞外基质（ECM）细胞片形成所致²⁴。因此，关键参数包括细胞密度和拉伸循环次数。在本研究方法中，细胞在第 3 天和第 7 天收集，通过基因表达分析评估其成腱潜能。然而，建议将细胞在二维生物反应器中至少拉伸三天，并持续监测拉伸组与静态对照组的培养板，以防止过度生长和细胞脱落。

经过多次拉伸后，可观察到一定程度的细胞排列与组织化现象（图4C1，E）。这与许多研究结果一致，即在体外条件下，细胞在单轴应变作用下会垂直于应变轴方向排列in vitro^24，27。相比之下，静态培养皿中的细胞呈现随机分布的组织模式（图4C2，E）。

据我们所知，目前仅有少数研究探讨了SCX过表达与机械刺激协同作用对间充质干细胞（MSCs）向腱细胞或韧带细胞分化的效应^24,28,29。Gaspar等人采用了一种与本文所述相似的二维生物反应器系统，但施加了更高的总应变（每天12小时，10%应变，1 Hz）。有趣的是，他们未能检测到骨髓来源的MSCs和人源腱细胞中SCX、TNMD和COL1a1表达的变化。然而，这可能归因于其研究中所使用的较高应变水平²⁴。Chen等人利用慢病毒载体在多层片状结构的人胚胎干细胞来源的MSCs（hESC-MSCs）中过表达SCX，并施加单轴循环载荷（每天2小时，10%应变，1 Hz，持续最长21天），观察到COL1a1、COL1a2、COL14和TNMD表达上调，并伴有细胞外基质（ECM）沉积增加²⁹。Nichols等人则将全长小鼠Scx cDNA瞬时转染至C3H10T1/2细胞，并将细胞培养于三维胶原水凝胶中，施加单轴循环应变（每天30分钟，1%应变，1 Hz，最长14天）。与我们的研究结果类似，该团队发现，在施加应变且SCX过表达的条件下，SCX和COL1A1表达升高，但在周期性拉伸刺激下，TNMD的表达未发生改变²⁸。

此外，考虑过表达其他与肌腱相关的标志物（如 MKX）也可能具有重要意义。Tsutsumi 等人研究了在 C3H10T1/2 细胞中过表达 MKX 并结合三维系统中周期性机械拉伸的联合效应。他们证明了 SCX、COL1a1、DCN 和 COL3a1 的显著上调，同时观察到胶原原纤维束和肌动蛋白丝的有序排列³⁰。

必须承认，这种生成iTenocytes的方法存在一定的局限性。尽管市面上可获得的二维生物反应器在概念验证工作中具有优势，但其尺寸限制了细胞产量。如果需要将这些细胞用于高通量检测，或作为现成的肌腱修复治疗细胞来源，则应考虑探索能够在更大规模上实现单轴拉伸的培养系统。此外，还需进一步研究以扩大iTenocytes的扩增能力，验证其成腱基因表达的稳定性，并评估其在肌腱修复中的贡献 在体 再生能力对于评估其成腱潜能至关重要。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Sigma Aldrich	M3148
Accutase	StemCell Technologies	7920	细胞解离试剂
抗生素-抗真菌素溶液	Thermofisher	15240096
抗-CD105	Ancell	326-050
APC标记的小鼠抗人CD44抗体	BD Biosciences	559942
APC标记的小鼠IgG2K同型对照抗体	BD Biosciences	555745
BenchMark胎牛血清	GeminiBio	100-106
双糖链蛋白聚糖（Biglycan）	Thermofisher	Hs00959143_m1
牛血清白蛋白	Millipore Sigma	A3733
I型胶原人α1链TaqMan引物	Thermofisher	Hs00164004_m1
III型胶原人α1链TaqMan引物	Thermofisher	Hs00943809_m1
二甲基亚砜	Millipore Sigma	D8418
DMEM，低糖，含丙酮酸，无谷氨酰胺，无酚红	Thermofisher	11054020
伊格尔最低必需培养基（EMEM）	ATCC	30-2003
牛血浆纤维连接蛋白	Sigma Aldrich	F1141
FITC标记的小鼠抗人CD90抗体	BD Biosciences	555595
猪皮明胶	Sigma Aldrich	G1890
山羊抗小鼠IgG1-PE	Bio-Rad	STAR117
HEK 293T/17	ATCC	CRL-11268
IMDM，无酚红	Thermofisher	21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1	Cedars-Sinai iPSC核心设施	N/A	https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
同型对照抗体，小鼠IgG2a-FITC	Miltenyi Biotec	130-113-271
KnockOut血清替代物	Thermofisher	10828010
L-抗坏血酸	Sigma Aldrich	A4544
L-谷氨酰胺	Thermofisher	2503081
Matrigel	Corning	354230	基底膜基质
MechanoCulture FX	CellScale	N/A	拉伸装置
MEM非必需氨基酸溶液	Thermofisher	11140050
Mohawk人TaqMan引物	Thermofisher	Hs00543190_m1
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276
PBS	Thermofisher	10010023
血小板源性生长因子受体A人TaqMan引物	Thermofisher	Hs00998018_m1
聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）	Sigma Aldrich	192066
Polybrene感染/转染试剂	Millipore Sigma	TR-1003
重组人 TGF-β1蛋白人TaqMan引物	RnD Systems	240-B
Scleraxis人TaqMan引物	Thermofisher	Hs03054634_g1
SCXA（SCX）（NM_00108050514）人标签ORF克隆	OriGene	RC224305L4
硅胶培养板	CellScale	N/A
叠氮化钠	Millipore Sigma	S2002
腱生蛋白C人TaqMan引物	Thermofisher	Hs00370384_m1
腱调节蛋白人TaqMan引物	Thermofisher	Hs00223332_m1
血小板反应蛋白4人TaqMan引物	Thermofisher	Hs00170261_m1
转染试剂BioT	Bioland Scientific LLC	B01-01
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	Thermofisher	25200072
微管蛋白聚合促进蛋白家族成员3	Thermofisher	Hs03043892_m1
Y-27632二盐酸盐	Biogems	1293823