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方法文章

小鼠双侧肾缺血-再灌注急性肾损伤模型

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DOI：

10.3791/65838

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2024年2月2日

 ,  ,  ,  , 
1Kidney Disease Center, the First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2International Institute of Medicine, The Fourth Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

缺血-再灌注损伤（IRI）模型可用于急性肾损伤（AKI）发展的不同阶段，尤其是在AKI向慢性肾病（CKD）进展的过程中。本文介绍了通过经腹途径在小鼠中建立IRI模型的操作步骤，即使用血管夹夹闭肾蒂以诱导缺血性损伤。

摘要

急性肾损伤（AKI）是指肾功能迅速下降的一种病理状态，由于肾单位不可逆地丧失及其适应不良的修复，持续的肾功能障碍会逐渐进展为慢性肾病（CKD）。近年来，AKI 的发病率呈上升趋势，其病因多样，包括容量不足、脓毒症、肾毒性、肌肉损伤和重大创伤等，其中缺血-再灌注损伤（IRI） 是导致大多数 AKI 发作的主要原因。小鼠 IRI 模型通过手术夹闭肾蒂来建立，为 AKI 的临床前研究提供了强大且可控的实验工具。尤为重要的是，该模型可用于模拟 AKI 发展过程中的不同阶段，特别是在 AKI 向 CKD 转变的过程中。尽管 IRI 模型已在众多实验室中广泛应用，但仍存在一系列变量会影响该模型的实验结果。本文详细描述了 IRI 模型的建立步骤，旨在为研究人员提供一种可重复且可靠的方法，以深入探究 AKI 发生机制及其向 CKD 进展的病理过程。

引言

急性肾损伤（AKI）是一种严重的临床综合征，具有显著的发病率和死亡率，其定义为48小时内血清肌酐升高≥0.3 mg/dL（26.5 µM/L），或7天内血清肌酐升高至基线值的≥1.5倍，或尿量<0.5 mL/kg/h持续6小时1,2,3。尽管已有数十年的研究，目前仍缺乏有效的AKI治疗手段以减轻肾脏损伤或促进肾功能恢复，且相当比例的AKI患者会进展为慢性肾脏病（CKD）4,5,6。AKI的发生及其进展涉及复杂的分子和信号通路，因此，临床前模型为解析这些复杂机制、开发高效治疗策略提供了有力工具。

临床上，缺血-再灌注损伤（IRI）是多种情况下急性肾损伤（AKI）的主要病因，包括心脏和肝脏手术、循环性休克、容量耗竭、脓毒症、肾血管闭塞或梗阻、肾移植等7。IRI-AKI小鼠模型自20世纪60年代起开始使用，该模型通过使用无创血管夹夹闭小鼠肾蒂以诱导缺血，随后松开血管夹恢复肾脏血流，实现再灌注。IRI-AKI模型通常表现为肾小管上皮细胞死亡及进行性肾组织损伤。IRI模型之所以成为研究AKI发病机制和治疗干预最常用的模型之一，主要原因包括：（1）手术操作简单且安全性高，可提高IRI-AKI模型的存活率和成功率8；（2）由于缺血是人类AKI的主要病因，因此IRI-AKI模型更适用于评估临床AKI事件9；（3）IRI模型可在AKI不同阶段呈现肾脏损伤及组织病理学变化，也适用于研究AKI向慢性肾病（CKD）的进展过程10。根据实验设计的不同，IRI诱导的AKI模型包括双侧IRI、单侧IRI保留对侧正常肾脏，以及单侧IRI同时行对侧肾切除。值得注意的是，双侧IRI模型被认为更贴近人类AKI的病理生理状态，因为双侧肾脏的血液供应均受到影响11。IRI模型可用于模拟肾移植、心脏旁路手术、肾血管手术或保留肾单位手术后肾血流减少的情况，也适用于低血压状态下的肾脏损伤研究9。本文描述了双侧IRI模型的建立方法，旨在为研究人员提供一种稳定且可靠的手段，以深入探究缺血诱导AKI的潜在发病机制。

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方案

采用8周龄、体重25 g的雄性C57BL/6J小鼠，通过双侧缺血-再灌注建立急性肾损伤（AKI）模型。根据既往研究，手术过程中维持小鼠体温在约36.5 °C–37 °C，缺血再灌注损伤（IRI）手术中肾脏缺血时间为30 min12,13。每组需要6只小鼠，假手术小鼠作为对照。本研究中的动物实验已获得浙江大学实验动物福利与使用委员会（IACUC）的批准，以保障实验动物的福利。所有动物实验操作均遵循浙江大学的伦理准则与原则。

1. 术前准备

  1. 将所有手术器械进行高压灭菌。
  2. 在7.6 mL无菌生理盐水中加入2 mL氯胺酮和0.4 mL甲苯噻嗪，配制麻醉液。通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（80 mg/kg）和甲苯噻嗪（16 mg/kg）混合物进行麻醉。使用脚趾夹捏反射评估麻醉深度。
  3. 将麻醉后的小鼠置于恒温毯上，确保其气道保持通畅。维持体温在36.5–37 °C范围内。
  4. 用1%盐酸四环素眼膏覆盖小鼠眼睛，防止麻醉期间角膜干燥。
  5. 使用毛发剪剃除腹部毛发，并用聚维酮碘溶液对术区皮肤消毒3次。

2. 手术

  1. 使用手术剪通过皮肤和肌层做长约1-1.5 cm的腹部正中切口，并用牵开器打开腹腔。
  2. 用棉签将腹膜后脂肪移开，并将肠道及其他器官推向对侧，以暴露肾脏。肾脏位于腹膜后间隙，约在脊柱外侧0.5 cm处，第13肋下方th 肋
  3. 使用精细尖头镊子解剖肾蒂，分离并去除筋膜和脂肪组织，暴露左侧肾蒂。
  4. 使用持针钳用血管夹夹闭肾蒂，确保血管损伤尽可能轻微。避免夹闭多余的肾窦脂肪，以免导致肾缺血不完全。
  5. 设定肾脏缺血时间，从夹闭30分钟开始。成功的缺血特征是肾脏在数分钟内逐渐由红色变为深紫色。
  6. 将肾脏移至腹膜后间隙。在对侧重复该操作，暴露并夹闭右侧肾蒂。
  7. 分别记录每侧肾脏的缺血时间，以确保双侧肾脏接受完全相同的缺血时长。在缺血时间结束后，重新打开切口并松开血管夹。
  8. 将肾脏放回腹膜后间隙，然后使用Vicryl 4-0缝线逐层缝合肌肉和皮肤。
    注意：手术操作应在无菌条件下进行。必要时，使用75%乙醇清洁手术台和器械。

3. 术后护理

  1. 通过腹腔注射0.5-1 mL温热且无菌的生理盐水，以补偿体液流失。
  2. 保持小鼠胸卧位，并密切观察，直至其恢复足够的意识。将小鼠置于恒温毯上，直至完全清醒，然后放回笼中。在小鼠完全恢复之前，不得将其与其他动物放在一起。
  3. 术后前3天内，每12小时给予一次0.05-0.10 mg/kg的丁丙诺啡，以缓解术后疼痛。每天监测手术后的小鼠。

4. 模型评估

  1. 苏木精-伊红（HE）染色
    1. 在缺血再灌注损伤（IRI）后第1、3、7或14天，通过腹腔注射戊巴比妥钠处死动物。
    2. 用4%多聚甲醛（PFA）固定新鲜肾组织过夜，并在4 °C下保存于75%乙醇中。
    3. 脱水并包埋后，将所得样品切成8 µm厚度用于染色。
    4. 在二甲苯中脱蜡，然后用浓度递减的乙醇进行再水化。
    5. 用苏木精和伊红对组织切片进行染色。
    6. 用浓度递增的乙醇和二甲苯对组织切片进行脱水。
  2. 肾功能检测
    1. 麻醉后采用眼球取血法采集血液样本。
    2. 将血液样本在12000 x g 条件下离心10分钟以分离血清。
    3. 使用全自动干式化学分析仪测定血清肌酐和血尿素氮（BUN）水平，以监测肾功能。
  3. 实时PCR（RT-PCR）
    1. 使用快速RNA提取试剂盒从肾组织中提取总RNA，然后利用逆转录酶混合试剂盒合成cDNA。使用SYBR Green Premix试剂盒进行RT-PCR，并在RT-PCR仪上运行。本实验所用引物序列此前已有报道14：KIM1上游引物，5'-GCTGCTACTGCTCCTTGTGA-3'；下游引物，5'-GGAAGGCAACCACGCTTAGA-3'；NGAL上游引物，5'-GGCCAGTTCACTCTGGGAAA-3'；下游引物，5'-TGGCGAACTGGTTGTAGTCC-3'；GAPDH上游引物，5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'；下游引物，5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'。

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结果

手术期间肾脏的状态

成功缺血的特征是肾脏在1-2分钟内由红色逐渐变为深紫色，成功再灌注的特征是肾脏在1-2分钟内由深紫色逐渐恢复为红色。

术后肾脏组织学

苏木精-伊红（HE）染色和过碘酸-雪夫（PAS）染色是验证急性肾损伤的直接方法。在缺血-再灌注损伤模型中，主要受损部位为近端小管的S3节段。肾小管损伤的经典表现包括明显的小管扩张和结构破坏、刷状缘丢失、脱落碎片以及细胞凋亡。小管损伤程度还通过受损小管所占百分比进行盲法评分：评分0分，无损伤；评分1分，<25%的小管受损；评分2分，25%–50%的小管受损；评分3分，50%–75%的小管受损；评分4分，>75%的小管受损。我们证实了缺血诱导的急性肾损伤（AKI）中存在典型的肾小管病理改变，并观察到小管损伤评分升高（图1A-B）。

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讨论

本文中，我们详细介绍了肾缺血-再灌注损伤（IRI）模型的建立步骤，并进一步阐明该模型是研究急性肾损伤（AKI）及其向慢性肾病（CKD）进展的可靠模型。此外，我们展示了评估肾脏损伤的两个主要指标——肾脏组织学和肾功能——所受到的影响。

在手术操作中，有几个关键点需要强调，以确保模型的可重复性和可靠性。对于腹部手术，建议采用正中切口暴露肾脏，以尽量减少手术相关创伤。由于肾蒂周围存在后腹膜脂肪，完全游离肾蒂较为困难，因此应使用镊子从肾脏后方来回将肾蒂从脂肪组织中剥离。此外，建议使用相同的血管夹以保持手术过程的稳定性，并注意观察血管夹在使用过程中是否存在磨损。另外，由于术中液体丢失可能加重肾脏损伤，因此通过补充生理盐水防止小鼠脱水也十分重要。

在缺血-再灌注损伤（IRI）的手术操作中，有几个重要的故障排除方法需要强调。首先，在分离肾脏及其血管蒂时，难以处理肾脏出血问题。大多数出血可通过充分压迫渗血点来控制，但若出血量> 0.5 mL，则可能引发失血性休克。此时应实施安乐死，并将该小鼠排除出研究。其次，需注意肾脏缺血不完全的问题...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢所有参与者在本研究中的合作。本研究获得了中国浙江省自然科学基金（LZ22H050001）以及浙江省高水平创新型卫生人才培养项目对林伟强的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
动物毛发剪毛器FEIYUBIO19-7002
1 ml 注射器LongreenSR60061
乙醇MacklinE885996
纱布FEIYUBIO19-5022
恒温监测系统Warmmate40 x 50
持针器DKBTCZQ-00160
涂布棒RWDR22029-03
无菌生理盐水BiosharpBL158A
组织剪刀DKBTDC-YKJ1002
组织镊子DKBTDK079904
血管夹Fine Science Tools18055-02
薇乔缝合线上海金环4 -0 

参考文献

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