基于化学亲和力的生物流体细胞外囊泡分离用于蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析

摘要

本方案为利用功能化磁珠有效分离尿细胞外囊泡提供了详细的描述。此外，它还包括后续分析，包括蛋白质印迹、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学。

摘要

来自生物流体的细胞外囊泡 （EV） 最近在液体活检领域引起了极大的关注。它们由几乎所有类型的细胞释放，提供宿主细胞的实时快照，并包含丰富的分子信息，包括蛋白质，特别是那些具有翻译后修饰 （PTM） 的蛋白质，如磷酸化，作为细胞功能和疾病发生和进展的主要参与者。然而，由于当前 EV 分离方法的产量和杂质低，从生物流体中分离 EV 仍然具有挑战性，这使得 EV 货物（如 EV 磷蛋白）的下游分析变得困难。在这里，我们描述了一种基于功能化磁珠的快速有效的 EV 分离方法，用于从生物流体（如人尿液）中分离 EV 和 EV 分离后的下游蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。该方案实现了尿 EV 的高回收率以及 EV 蛋白质组和磷酸化蛋白质组的敏感谱。此外，本文还讨论了该协议的多功能性和相关技术考虑因素。

引言

细胞外囊泡 （EV） 是由所有类型的细胞分泌的膜包膜纳米颗粒，存在于血液、尿液、唾液等生物流体^中1,2,3,4。EV 携带多种生物活性分子，这些分子反映了宿主细胞的生理和病理状态，因此是疾病进展的关键因素 ^4,5,6。此外，广泛的研究已经确定，基于 EV 的疾病标志物可以在症状出现或肿瘤生理检测之前被识别出来 ^5,6,7。

磷酸化是细胞信号传导和调节的关键机制。因此，磷蛋白为生物标志物的发现提供了有价值的来源，因为异常的磷酸化事件与失调的细胞信号通路和转移性疾病的发展（^如癌症）有关8,9,10。

方案

所有尿液样本均在知情同意后从健康个体中收集。这些实验符合涉及人体样本的所有伦理标准，并符合普渡大学人类研究保护计划的指导方针。

1. 样品采集

1. 在2,500× g，4°C下将12mL尿液样品在15mL锥形离心管中离心10分钟，以除去细胞碎片和大凋亡体。
2. 将 10 mL 上清液转移到新的 15 mL 试管中，然后进行 EV 分离。
   注意:方案可以在这里暂停，样品可以储存在-80°C，并在使用时在37°C解冻。

2. 使用EVtrap方法进行EV隔离

1. 根据制造商的说明，向样品中加入 0.5 mL 上样缓冲液（1:10 v/v 比）和 100 μL EVtrap 珠浆（1:50 v/v 比）。
2. 在室温下通过端到端旋转孵育样品30分钟。
3. 通过将 15 mL 锥形管放在磁性分离器架上来沉淀样品。除去上清液。
4. 将珠子重悬于 1 mL 洗涤缓冲液中，并将悬浮液转移到 1.5 mL 微量离心管中。轻轻移液以重新悬浮与 EV 结合的磁珠。
5. 将试管放在 1.5 mL 微量离心管磁性分离器架上并吸出上清液。使用P200移液管完全吸出上清液并避免吸出珠子。
6. 用 1 mL 洗涤缓冲液洗涤....

结果

该协议展示了从EV分离到下游蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析的综合工作流程（图1）。对一式三份的尿液样本进行EV分离。分离的 EV 通过蛋白质印迹进行表征，随后进行基于质谱的蛋白质组学样品制备，包括蛋白质提取、酶消化和肽纯化。对于磷酸化蛋白质组学分析，基于金属离子功能化的可溶性纳米聚合物进一步富集了磷酸肽。多肽和磷酸肽样品均在数据无关模式下通过高分辨率离子淌度质谱分析。根据 智人 数据库搜索结果原始文件，并执行无库数据独立采集工作流程进行鉴定和 MS2 水平定量。

为了表征分离的 EV 并估计回收率，我们首先将相当于 0.5 mL 的含有 EV 的尿液加载到凝胶上进行蛋白质印迹，以检测 EV 标志物 CD9（图 2A）。此外，我们纳入了使用最常用的 EV 分离方法差示超速离心 （DUC） 从相同体积的尿液中分离出的 EV 进行比较。结果表明，与 DUC 相比，EVtrap 能够产生更高的 CD9 信号，表明磁珠可以有效捕获 EV。每个 CD9 条.......

讨论

有效的EV分离是检测EV中低丰度蛋白质和磷蛋白的重要先决条件。尽管开发了许多方法来满足这一需求，但大多数方法仍然存在局限性，例如恢复率差或可重复性低，这阻碍了它们在大规模研究和常规临床环境中的使用。DUC 通常被认为是最常见的 EV 隔离方法，通常应用额外的洗涤步骤来帮助提高目标 EV 的纯度^27,28。此过程会导致更繁琐和耗时的 DUC 过程（> 6 小时）。此外，多项研究报道了DUC后的EV回收率低，^29,30，如图2所示。相比之下，EVtrap 提供高效的 EV 隔离（< 1 小时）和高回收率（图 2）。值得注意的是，该工作流程的成功应用标志着鉴定各种疾病和癌症的重要 EV 标志物 19,21,22 的关键进展^然而，EVtrap 无法.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	生命科学产品	M-1700C-LB
1.5 mL 管 磁力分离器架	Sergi 实验室用品	1005
15 mL 锥形离心管	康宁
15 mL 管式磁力分离器架	Sergi 实验室备件	1002
抗兔 IgG、HRP 偶联抗体	Cell Signaling Technology	7074P2
台式孵育摇床	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell 混合模块 MB-101
CD9 （D3H4P） 兔 mAb	Cell Signaling Technology	13403S
氯乙酰胺	Sigma-Aldrich	C0267-100G	用于还原硫化物基团的烷基化反应。用水新鲜制备 400 mM 作为储备液。
乙酸乙酯	费舍尔科技	E145-4	沉淀去污剂
Evosep One	Evosep		液相色谱系统
Evotips	Evosep	EV2013	用于 Evosep One 系统的样品上样
EVtrap	Tymora 分析		官能化磁珠、上样缓冲液和洗涤缓冲液
Immobilon-FL PVDF 膜	Sigma -Aldrich	IPFL00010	印迹膜
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 凝胶	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 至 12%，Bis-Tris，1.0 mm，小型蛋白凝胶，12 孔
NuPAGE LDS 样品缓冲液 （4X）	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9	Bruker	1893473	分离柱
磷酸酶抑制剂混合物 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X，磷酸酶抑制剂。
磷酸酶抑制剂混合物 3	西格玛 -Aldrich	P0044-1ML	100X， 磷酸酶抑制剂。
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	ThermoFisher	23225
Pierce ECL 蛋白质印迹底	ThermoFisher	32106	HRP 底物
PolyMAC 磷酸肽富集试剂盒	Tymora 分析		基金属离子亲和捕获 （PolyMAC），用于磷酸肽富集
脱氧胆酸盐钠	Sigma -Aldrich	D6750-10G	裂解缓冲液去污剂。在水中制备 120 mM 作为储备液。
月桂酰肌氨酸钠	Sigma -Aldrich	L9150-50G	裂解缓冲液去污剂。在水中制备 120 mM 作为储备液。
timsTOF HT	Bruker		捕获离子淌度飞行时间质谱仪
TopTip C-18 （10-200 μL） 提示	Glygen	TT2C18.96	脱盐法
三乙胺	Sigma -Aldrich	471283-100ML	用于 EV 洗脱。
三乙基硼酸铵缓冲液	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
三氟乙酸	Sigma -Aldrich	302031-100ML
三 - （2-羧乙基）膦盐	Sigma -Aldrich	C4706	用于还原二硫键。在水中制备 200 mM 作为储备液。将储备液分装成小体积，并储存在 -20°C 中;C（避免多次冻融循环）。
胰蛋白酶/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007