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可视化单羧酸盐及其他相关代谢物在 离体果蝇实验 利用基因编码传感器研究幼虫大脑

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DOI：

10.3791/65846

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2023年10月27日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Neuroscience Institute, Universidad de Chile, 2Advanced Scientific Equipment Network (REDECA), Faculty of Medicine, Universidad de Chile, 3Department of Neuroscience, Faculty of Medicine, Universidad de Chile

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用基因编码的基于 Förster 共振能量转移的传感器，在果蝇幼虫脑离体标本中可视化单羧酸盐、葡萄糖和 ATP 在胶质细胞和神经元中转运的实验方案。

摘要

由于电活动导致大脑具有高能量需求，这是大脑最显著的特征之一。这些能量需求通过葡萄糖及其代谢物（如单羧酸盐乳酸和丙酮酸）生成ATP来满足。目前尚不清楚这一过程是如何被调控的，以及其中的关键参与者有哪些，特别是在Drosophila中。

使用基于基因编码的福斯特共振能量转移传感器，我们介绍了一种简单的方法，用于测量单羧酸盐和葡萄糖在胶质细胞和神经元中的转运过程 离体果蝇 幼虫脑组织制备。该方案描述了如何将表达某种传感器的幼虫脑组织解剖并固定于玻璃盖玻片上。

我们展示了整个实验的结果，该实验通过在胶质细胞中敲低已鉴定的单羧酸转运蛋白，来测量幼虫大脑中的乳酸转运。此外，我们还演示了如何快速提高神经元活性，并追踪活跃大脑中代谢物的变化。所述方法提供了所有必要信息，可用于分析其他 Drosophila 活体组织。

引言

由于神经元在产生和传递电信号以及突触传递过程中需要消耗大量能量来恢复离子梯度，因此大脑具有很高的能量需求1,2。长期以来，人们认为这种高能量需求主要依赖于葡萄糖的持续氧化以生成ATP3。血脑屏障上的特异性转运蛋白将血液中的葡萄糖转运至大脑，稳定的血糖水平可确保大脑持续获得葡萄糖供应4。有趣的是，越来越多的实验证据表明，葡萄糖代谢产生的分子（如乳酸和丙酮酸）在脑细胞的能量生成过程中也发挥着重要作用5,6。然而，这些分子在能量生成中的具体重要性，以及大脑中哪些细胞负责产生或利用这些分子，目前仍存在争议7,8。由于缺乏具备足够高时空分辨率的合适分子工具，这一争议至今尚未得到彻底解决，这已成为该领域研究中的一个重大难题。

多种工程化荧光代谢传感器的开发与应用极大地加深了我们对代谢物产生与利用的部位及机制，以及基础状态和高神经元活动期间代谢通量变化的理解9。基于荧光共振能量转移（FRET）显微技术的基因编码代谢传感器，如 ATeam（ATP）、FLII12Pglu700µδ6（葡萄糖）、Laconic（乳酸）和 Pyronic（丙酮酸），已为脑能量代谢的研究提供了重要见解10,11,12,13。然而，由于在活体动物或组织上开展实验所需设备复杂且成本高昂，目前在脊椎动物模型中的研究结果仍主要局限于细胞培养体系（胶质细胞和神经元）。

利用 Drosophila 模型表达这些传感器的新兴应用表明，关键的代谢特征在不同物种间是保守的，且该工具可便捷地研究其功能。更重要的是，Drosophila 模型揭示了葡萄糖和乳酸/丙酮酸在果蝇脑中的转运与代谢机制，单羧酸类物质摄取与记忆形成之间的关联，以及神经活动增强与代谢通量增加之间高度重叠的显著证据14,15,16,17。本文所述通过在幼虫脑中表达基因编码的FRET传感器来测定单羧酸、葡萄糖和ATP水平的方法，可帮助研究人员进一步了解 Drosophila 脑组织的能量利用方式，并可推广应用于其他动物脑组织的研究。

我们证明了该方法可用于检测胶质细胞和神经元中的乳酸和葡萄糖，并且单羧酸转运蛋白（Chaski）参与了乳酸向胶质细胞的导入过程。我们还展示了一种研究神经元活动增强时代谢物变化的简单方法，该过程可通过浴式施加GABAA受体拮抗剂轻松诱导。最后，我们证明该方法还可用于测量其他具有重要代谢意义的组织（如脂肪体）中的单羧酸和葡萄糖转运。

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方案

1. 果蝇品系的维持与幼虫同步化

  1. 进行这些实验时，使用在25 °C下于标准培养基中培养的果蝇品系 果蝇 由10%酵母、8%葡萄糖、5%小麦粉、1.1%琼脂、0.6%丙酸和1.5%对羟基苯甲酸甲酯组成的培养基。
  2. 按照本方案操作时，请使用以下品系： w1118 （实验对照背景），OK6-GAL4（运动神经元驱动子），repo-GAL4（所有胶质细胞驱动子），CG-GAL4（脂肪体驱动子），UAS-Pyronic（丙酮酸传感器），UAS-FLII12Pglu700µδ6（葡萄糖传感器）、UAS-Laconic（乳酸传感器）、UAS-GCaMP6f（钙离子传感器）、UAS-AT1.03NL（ATP传感器）和UAS-Chk RNAi GD1829。所有表达传感器或RNAi的品系均位于 w1118 遗传背景
  3. 为获得同步化的三龄游走期幼虫，将300只所需基因型的果蝇（3–5日龄，100只雄蝇，200只未交配雌蝇）放入产卵室中，产卵室内放置一个直径60 mm的培养皿，其中铺有含1%琼脂糖的磷酸盐缓冲液（PBS）。在培养皿中央加入一滴液体或奶油状酵母（直径1.5 cm），以促进果蝇产卵。图1).
  4. 将果蝇置于25 °C条件下培养3天，每天两次更换新的琼脂糖培养皿和新溶解的酵母。
  5. 在第四天让果蝇在培养皿中产卵4小时，然后更换培养皿。移除该琼脂糖块，随后将果蝇转移到含有新溶解酵母的新鲜琼脂糖块中，继续让其产卵3小时。使用由此获得的幼虫进行实验。
  6. 孵育3小时后，取出含有卵的培养板，置于25 °C培养箱中继续孵育24小时。
  7. 从该菌斑中收集50至100条新孵化的幼虫（孵化后0小时），放入含有标准食物的塑料小瓶中。为确保幼虫正常摄食，需将食物研磨至柔软状态。在转移后96小时使用这些幼虫。

2. 使用多聚-L-赖氨酸制备玻璃盖玻片

  1. 在进行幼虫解剖前1小时执行此步骤。在6孔细胞培养板中，放置25 mm的玻璃盖玻片（所用盖玻片的直径需根据显微镜配备的记录室而定）。
  2. 在每张盖玻片中央滴加300 µL多聚-L-赖氨酸，室温孵育30分钟。
  3. 用蒸馏水将每张盖玻片清洗3次，再用无Ca2+的生理盐水清洗2次（该盐溶液与解剖幼虫时所用溶液相同，参见步骤3.2）。将盖玻片安装至记录室中，并用无Ca2+的生理盐水充满记录室。
    ​注意：尽管幼虫脑组织可直接黏附于玻璃盖玻片上，但黏附力较弱，在实验过程中由于生理盐水持续流动，脑组织偶尔会发生移动或移位。加入多聚-L-赖氨酸处理步骤可降低因冲洗导致脑组织移动甚至脱落的风险。

3. 解剖腹神经索（VNC）和脂肪体（FBs）

  1. 从所需的遗传杂交组合（步骤1.7）中收集游走期三龄幼虫，并用蒸馏水彻底清洗3次。
  2. 将幼虫置于含有 750 µL 无钙溶液的玻璃解剖皿中2+ 由 128 mM NaCl、2 mM KCl、4 mM MgCl 组成的冰冻生理盐水溶液25 mM 海藻糖、5 mM HEPES 和 35 mM 蔗糖（pH = 6.7，使用 pH 计测定，并用 1 M NaOH 和 37% v/v HCl 调节）。
    注意：将pH值调至6.7至关重要，因为如先前观察所示，单羧酸转运对溶液的pH值高度敏感。此外，6.7对应于三龄幼虫血淋巴中的pH值。17,18.
  3. 将幼虫置于体视显微镜下，用镊子在其腹部背面进行横向剪切。
  4. 用镊子推动下颌，同时将幼虫翻转。
  5. 观察位于颚附近的腹神经索。小心移除成虫盘和残留的脑尾侧组织。
  6. 用镊子夹住腹神经索（VNC）并切断神经，将其与中枢脑和视叶从其余组织中分离。将分离出的VNC从残留的神经中拾取后转移至含有Ca的记录室中2+无酶记录溶液（与步骤3.2中相同的溶液）。VNC将立即贴附于盖玻片上。
  7. 为避免残留神经的干扰，使用镊子将神经固定在盖玻片底部（神经的荧光情况取决于所使用的驱动品系）图2).
  8. 为了在脂肪体（FBs）中开展葡萄糖或单羧酸转运的实验，在另一组实验中，请按照步骤 3.1–3.4 分离组织。将幼虫翻转至内向外后，可观察到脂肪体为白色、成对且扁平的组织。
  9. 将表达FRET传感器的分离FBs（通过使用适当驱动子的遗传杂交获得）置于含有无Ca记录液的记录室中2+.
    注意：FB具有高度疏水性（易漂浮于溶液表面），且对镊子操作极为敏感，必须小心处理。对该组织的任何粗暴操作均会导致后续细胞死亡（表现为传感器荧光信号减弱）。
  10. 将含有VNCs/FBs的记录室置于显微镜载物台上。

4. 活细胞成像

  1. 使用配备发射光分离系统和CCD相机的正置荧光显微镜获取表达传感器的组织图像。在开始任何实验前30分钟打开显微镜的照明系统。
    注意：此处我们使用配备20x/0.5水浸物镜的转盘式荧光显微镜观察VNCs和FBs。 图2 还展示了使用40倍/0.8数值孔径的水浸物镜。
  2. 为了观察 GCaMP6f 荧光，设置 激发 和 发射 波长在 488 nm 和 540 nm分别。对于Laconic/Pyronic/ATP/葡萄糖传感器，设置 激发 波长在 440 nm 以及 发射 波长在 488 nm （mTFP，CFP）和 540 nm （Venus，黄色荧光蛋白）
  3. 获取图像 512 x 512 像素 大小 每2秒 用于 GCaMP6f 以及每一个 10-30 秒 用于 简洁型/花青素/ATP/葡萄糖传感器. 通过观察所获图像的质量来确定光源的最佳曝光条件。为遵循本方案，请确保图像具有 300 毫秒曝光 用于 简洁的 和 Pyronic 传感器和 100-150 毫秒 对于 葡萄糖 和 ATP 传感器
    注意：曝光时间可能因使用共聚焦显微镜或普通荧光显微镜而有所不同。
  4. 将记录室安装到显微镜载物台上后，小心放置水浸物镜，并确保整个实验过程中物镜始终浸没在水中。保持室温为 25 °C。
  5. 将记录室连接至灌流系统，并用含有 128 mM NaCl、2 mM KCl、1.5 mM CaCl₂ 的记录液持续灌流以保持组织浸没状态2，4 mM MgCl25 mM 海藻糖、5 mM HEPES 和 35 mM 蔗糖，pH 6.7（使用 pH 计测定，并用 NaOH 和 HCl 调节）。
  6. 使用重力维持灌流液以3 mL/min的恒定流速流经组织，同时结合低流量蠕动泵从记录 chamber 中抽出液体，以保持灌流体积恒定。为达到所需流速，将盛有灌流液的管路（50 mL 塑料管）置于显微镜载物台上方25 cm处。
    注意：这种重力驱动的流动可避免由蠕动泵引起的组织移动，从而在后续实现更精确的图像分析。
  7. 在任何刺激之前，持续灌注记录液5-10分钟，以获得传感器荧光信号的稳定基线。可根据需要调整灌注时间以达到该基线。
  8. 用刺激溶液替换灌流溶液，持续5分钟，以刺激VNC/FBs（刺激溶液中含有所述实验指定浓度的葡萄糖、丙酮酸或乳酸，溶解于生理盐水中；详见各图）。
    注意：刺激持续时间可根据实验需求进行调整（例如，葡萄糖脉冲可延长至10分钟，以在神经元中达到平台期，如先前报道所示）16).
  9. 为了维持刺激溶液的渗透压，校正蔗糖浓度（一种无法被代谢的碳水化合物） 果蝇 脑）根据所添加的单羧酸盐或葡萄糖的浓度。
  10. 使用简单的阀门系统更换溶液。注意不要移动显微镜载物台。
  11. 用80 µM 毒扁豆碱（PTX，持续灌流）刺激VNC，以增强神经元活性。该操作可提高Ca²⁺2+ 振荡，从而能够观察代谢相关分子（如细胞内ATP）的变化。
  12. 实验结束后，须用生理盐水彻底清洗整个流路系统，包括管道和记录室，至少清洗10分钟，随后再用蒸馏水清洗至少10分钟，以彻底清除所用溶液的残留痕迹。

5. 图像处理与数据分析

  1. 为处理所获得的图像，请按照图3所示步骤进行操作。
  2. 将图像（Laconic）导入ImageJ软件。该图像包含样品的两个视图：左侧为mTFP信号，右侧为Venus信号。选择包含待分析细胞的区域，并将这两个图像（mTFP和Venus）分别置于新窗口中。确保这些图像包含完全相同的区域。
  3. 打开配准插件，使用刚体（rigid body）功能校正实验中通常观察到的组织微小漂移。对两个图像（mTFP和Venus）均执行此操作。
  4. 在mTFP信号（488 nm）中对应10个细胞的胞质内至少选择10个感兴趣区域（ROIs），并将这些选区转移至Venus（540 nm）图像中。
  5. 选择2至3个靠近待分析细胞但无明显信号的区域（始终位于VNC或所分析组织内，见图3），作为背景感兴趣区域（背景ROIs）。
  6. 在两个图像中完成感兴趣区域的选择后，使用“测量”功能获取每个信号的平均灰度值。将数据导入数据表，并从每个信号中减去相应的平均背景值。
  7. 计算mTFP荧光信号相对于Venus的比值（适用于Laconic和Pyronic）。该数值的计算方式与本文所述其他FRET传感器不同（通常为YFP/CFP比值），因为当Laconic和Pyronic与其相应底物结合时，两者的FRET效率均会降低。
  8. 通过将每个记录值除以基线值来对数据进行归一化处理。在另一数据表中，计算基线值：取刺激前2分钟内mTFP/Venus比值的平均值。
  9. 对于使用基于FRET的传感器进行的葡萄糖和ATP测量，计算YFP/CFP比值，并按照步骤5.8所述方法对数据进行归一化处理。

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结果

该方法可在长达1小时的时间内，方便地检测单羧酸盐和葡萄糖传感器荧光信号的细胞内变化。如图4所示，胶质细胞和运动神经元中的Laconic传感器在1 mM乳酸脉冲开始时的响应速率相似，但在5分钟脉冲期间，运动神经元的信号增幅高于基线水平，这与先前的研究结果一致17。选择该乳酸浓度是因为其水平与三龄幼虫血淋巴中检测到的浓度相当。类似地，当腹神经索中表达的葡萄糖传感器暴露于5 mM葡萄糖（该数值与我们及其他研究者在血淋巴中测得的浓度相近19）时，传感器在胶质细胞和神经元中的信号上升速率相似。然而，在葡萄糖脉冲期间，神经元中的信号增幅大于胶质细胞。这一结果与先前对表达类似FRET传感器样本的观察一致16。

该制备物可用于对尚未描述的单羧酸盐和葡萄糖转运蛋白进行实验研究，这些转运蛋白表达于 果蝇 胶质细胞或神经元20在此，我们以...

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讨论

利用 Drosophila 模型研究脑代谢相对较新26，研究表明其代谢特征与哺乳动物的相似性远超预期；而哺乳动物的代谢研究主要依赖体外（in vitro）的原代神经元培养或脑切片实验。Drosophila 在活体（in vivo）实验中具有显著优势，得益于一系列可用的遗传工具和基因编码的传感器，研究人员能够实时观察由诱导活动甚至感觉刺激所引发的代谢变化。

本文所述方案展示了如何测量单羧酸盐和葡萄糖的转运 果蝇 腹神经索胶质细胞和神经元在其中 离体 利用基于FRET显微技术的基因编码荧光代谢传感器，制备可拍摄静息与活跃神经元代谢变化延时视频的方案。该方案可便捷地在任何配备相应设备的实验室中实施 果蝇 使用配备发射光分光系统的落射荧光显微镜，可在不依赖复杂设备的情况下建立该模型。该方法也可扩展至更先进的设备，如转盘式共聚焦显微镜、激光共聚焦显微镜或双光子显微镜（但需配备分光装置以分离发射光），从而对位于脑组织更深层...

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披露

作者声明不存在竞争性或经济利益。

致谢

感谢Sierralta实验室的所有成员。本工作由FONDECYT-启动项目11200477（资助AGG）和FONDECYT常规项目1210586（资助JS）提供支持。UAS-FLII12Pglu700µδ6（葡萄糖传感器）由巴黎国家科学研究中心（CNRS）的Pierre-Yves Plaçais和Thomas Preat慷慨捐赠。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖SigmaA9539
CaCl2SigmaC3881
CCD相机ORCA-R2Hamamatsu-
Cell-R软件Olympus-
CG-GAL4Bloomington果蝇品系中心7011脂肪体驱动子
Dumont #5镊子Fine Science Tools11252-30
DV2发射分光系统Photometrics-
玻璃盖玻片（25 mm直径）Marienfeld111650德国
葡萄糖SigmaG8270
GraphPad PrismGraphPad Software版本 8.0.2
HEPESSigmaH3375
ImageJ软件美国国立卫生研究院版本 1.53t
KClSigmaP9541
LUMPlanFl 40x/0.8水浸物镜Olympus-
对羟基苯甲酸甲酯SigmaH5501
MgCl2SigmaM1028
NaClSigmaS7653
OK6-GAL4Bloomington果蝇品系中心运动神经元驱动子
苦味毒SigmaP1675S警告——吞食可致死
聚-L-赖氨酸SigmaP4707
丙酸SigmaP1386
Repo-GAL4Bloomington果蝇品系中心7415胶质细胞驱动子（全部）
乳酸钠Sigma71718
丙酮酸钠SigmaP2256
旋转盘荧光显微镜BX61WIOlympus-
蔗糖SigmaS0389
海藻糖US BiologicalT8270
UAS-AT1.03NL 京都果蝇品系中心117012ATP传感器
UAS-Chk RNAi GD1829维也纳果蝇资源中心v37139Chk RNAi品系
UAS-FLII12Pglu700md6 Bloomington果蝇品系中心93452葡萄糖传感器
UAS-GCaMP6f Bloomington果蝇品系中心42747钙离子传感器
UAS-LaconicSierralta实验室-乳酸传感器
UAS-PyronicPierre Yves Placais/Thomas Preat-CNRS-巴黎
UMPlanFl 20x/0.5水浸物镜Olympus-

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