石蜡包埋肺癌组织的多重免疫组化染色

酪胺信号扩增（TSA）已有20多年的历史，是一类利用辣根过氧化物酶（HRP）对靶抗原进行高密度原位标记的检测技术，广泛应用于酶联免疫吸附测定（ELISA）、原位杂交（ISH）、免疫组化（IHC）等生物抗原检测技术。 大幅提高检测信号的灵敏度¹.基于 TSA 技术的蛋白石多色染色最近被开发出来并广泛用于多项研究 2,3,4,5。传统的免疫荧光 （IF） 染色为研究人员提供了一种简单的工具，用于检测和比较各种模式生物细胞和组织中蛋白质的分布。它基于抗体/抗原特异性结合，包括直接和间接方法⁶。直接免疫染色涉及使用荧光团偶联的一抗来对抗目标抗原，从而可以使用荧光显微镜进行直接荧光检测。间接免疫染色方法涉及应用荧光团偶联的二抗来对抗非偶联的一抗^6,7。

传统的单标记免疫荧光染色方法只能对组织中的一种、两种或在某些情况下三种抗原进行染色，这是挖掘组织切片中包含的丰富信息的主要限制。定量结果的解释通常取决于目视观察和成像软件（如 ImageJ）的准确定量。存在技术限制，例如抗体种类限制、荧光标记信号弱和荧光染料颜色重叠（表 1）。Opal 多重 IHC （mIHC） 技术基于 TSA 衍生，允许在同一组织切片上对 7-9 种以上抗原进行多重染色和差异标记，对一抗的来源没有限制，但需要针对抗原的相应抗体具有高度特异性。染色程序与普通免疫荧光染色相似，但有两个区别:每轮染色仅使用一种抗体，并添加抗体洗脱步骤。通过非共价键与抗原结合的抗体可以通过微波洗脱去除，但通过共价键结合到抗原表面的 TSA 荧光信号被保留。

用染料标记的活化酪胺 （T） 分子在靶抗原处高度富集，从而可以有效扩增荧光信号。这允许在没有抗体干扰的情况下直接标记抗原，然后在多个染色循环后可以实现多色标记^8,9,10（图1）。尽管该技术可为疾病研究提供可靠和准确的图像，但由于需要广泛的优化和设计，创建有用的多重荧光免疫组化 （mfIHC） 染色策略可能既耗时又严格。因此，该多重panel方案已在自动IHC染色机中进行了优化，其染色时间比手动方案更短。任何研究人员都可以直接应用和调整这种方法，用于人福尔马林固定和石蜡包埋 （FFPE） 组织样本的免疫肿瘤学研究¹¹。此外，载玻片制备、抗体优化和多重设计方法将有助于获得代表准确细胞原位相互作用的可靠图像，并缩短手动分析的优化周期¹²。

mfIHC主要包括图像采集和数据分析。在图像采集方面，需要用专业的光谱成像设备检测多色标记的复合染色样品，以识别各种混合色信号，获得不受组织自发荧光干扰的高信噪比图像。目前的光谱成像设备主要包括光谱共聚焦显微镜和多光谱组织成像系统。多光谱组织成像系统是专为组织切片定量分析而设计的专业成像系统，其最重要的特点是获取图像光谱信息，提供生物组织样品的形态结构和光学映射信息^13,14。光谱图像中的任何像素都包含完整的光谱曲线，每种染料（包括自发荧光）都有其相应的特征光谱，从而能够完整记录和准确识别混合和重叠的多标记信号。

在数据分析方面，由于组织样本的形态结构和组成细胞，多色标记样品极其复杂。普通软件无法自动识别不同的组织类型。因此，智能定量组织分析软件用于特定区域抗原表达的定量分析15,16,17,18。

最重要的是，融合多光谱成像和定量病理分析技术的多标记免疫荧光染色具有检测靶点多、染色有效、分析准确等优点，因此可以显著提高组织形态学分析的准确性，以细胞水平分辨率揭示蛋白质之间的空间关系，有助于从组织切片样本中挖掘更丰富、更可靠的信息¹⁹ （表1）。

该协议已获得中国四川大学华西医院伦理委员会的指导意见。在华西医院肺癌中心手术时采集肺癌组织样本，并征得每位患者的知情同意书。

1.组织切片准备

1. FFPE制备
   1. 将临床组织浸入中性福尔马林溶液中超过72小时。
   2. 使用二甲苯和分级酒精溶液²⁰完成组织脱水的过程。
   3. 以 4 μm 切片厚度进行手动石蜡包埋和组织切片。使用粘附显微镜载玻片确保组织切片不会脱落。
   4. 将载玻片在65°C的烤箱中烘烤2小时，以确保组织和载玻片干燥。在室温下储存在载玻片盒中。
2. 组织切片预处理
   1. 将组织载玻片在65°C的烘箱中预处理5分钟，然后依次浸入二甲苯溶液中2×15分钟，无水乙醇溶液2×15分钟，90%乙醇溶液10分钟，85%乙醇溶液10分钟，80%乙醇溶液10分钟，75%乙醇溶液10分钟， 然后用消毒水清洗载玻片 3 x 1 分钟。
      注意:该实验技术仅适用于FFPE组织，不适用于冷冻或新鲜组织，因为多次高温抗原修复过程会导致组织从载玻片上脱落。

2. 一抗优化

注:常规IHC实验用于确定单个抗体的孵育条件，主要包括抗体浓度和抗原修复条件。请参阅抗体使用说明书中的条件。

1. 使用略高于推荐浓度范围和中间值的抗体浓度。
2. 根据蛋白表达的位置优化抗原修复缓冲液程序 PH6 和 PH9。对细胞核中表达的蛋白质使用 PH9，对其他蛋白质使用常规（PH6 或 PH9）。

3. mIHC染色法

注意:蛋白石 mIHC 染色是可用的 mIHC 方法之一。在这个实验性的 5 色方案中，由于每个组织样品需要用四种抗体染色，因此需要四种一抗孵育、二抗孵育和 TSA 信号放大显色孵育以及五种抗原修复体。最后，进行4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色和抗荧光爆破剂密封。

1. 主要试剂制备
   注意:根据组织载玻片的大小确定要添加的试剂量。使用足够的体积完全覆盖组织切片（通常每张载玻片 50-150 μL）。实验所需的工作溶液制备如下:
   1. 洗涤缓冲液工作溶液:用双蒸水以1:20稀释20倍洗涤缓冲液，并在室温下储存。
   2. PH6缓冲液工作溶液:用双蒸水以1:100稀释100x PH6缓冲液。使用前准备并在室温下储存。
   3. PH9缓冲液工作溶液:用双蒸水以1:50稀释50x PH9缓冲液。使用前准备并在室温下储存。
   4. 聚合物 HRP:仅针对兔和小鼠来源的一抗制备这种即用型溶液。
   5. 荧光团工作溶液:在 75 μL DMSO 中复制每个荧光团粉末（荧光团 780 除外）。在每次操作之前，将荧光团以1:100的1倍扩增稀释剂稀释。丢弃荧光团工作溶液的任何未使用部分。
   6. 荧光团 780 工作溶液:在 75 μL DMSO 中复溶 TSA-DIG，在 300 μL 双蒸水中复溶荧光团粉末 780。在操作之前，在1x扩增稀释剂中以1:100稀释TSA-DIG稀释，并用Ab稀释剂以1:25稀释荧光团780稀释。
   7. DAPI工作溶液:用双蒸水或PBS以1:50稀释DAPI溶液。使用前准备并在4°C下储存不超过48小时。
      注意。在整个多标记荧光染色实验中，仅用双蒸水和新制备的洗涤缓冲液工作溶液洗涤载玻片。组织切片不得与自来水接触;自来水中的污染物会粘附在组织切片上并引起自发荧光。在整个实验过程中，使样品远离光线。
2. 抗原修复
   1. 将载玻片放入染色和修复盒中，并用PH 6或PH 9缓冲液填充，盖上盖子，并在微波炉中以100%功率加热2×8分钟。
      注意: 在加热过程中向维修箱中加入双蒸水，以防止过度蒸发导致切片变干。
   2. 在继续之前，让载玻片在室温下冷却（30-60分钟）。
   3. 用双蒸水洗涤载玻片3×2分钟。使用疏水阻隔笔包围载玻片上的组织部分。
3. 阻塞
   1. 将组织切片浸入洗涤缓冲液中，用封闭溶液覆盖，并在室温下将载玻片在加湿室中孵育10分钟。
4. 一抗孵育
   1. 从载玻片中取出封闭溶液，并用一抗工作溶液覆盖组织切片。将载玻片在培养箱中37°C的加湿室中孵育1小时，或在冰箱中4°C孵育过夜。
      注意: 不要让载玻片变干。
5. 聚合物HRP介绍
   1. 将载玻片在洗涤缓冲液工作溶液中洗涤3×2分钟，将聚合物HRP直接滴加到组织切片中，并在室温下孵育15分钟。
      注意:对于储存在冰箱中的载玻片，在洗涤前将其在室温下保存约 30 分钟以去除一抗。
6. 酪胺信号放大 （TSA） 生成
   1. 用洗涤缓冲液工作溶液洗涤载玻片3×2分钟，将荧光团工作溶液直接滴加到组织切片中，并在室温下孵育10分钟。用洗涤缓冲液工作溶液洗涤载玻片3×2分钟。
7. 荧光基团 780 的特殊程序
   注意:荧光团 780 很弱，通常在整个实验的颜色匹配方案中排在最后。荧光团780通常不用于该实验方案，但由于其特异性，列出了其实验步骤。
   1. TSA-DIG简介
      1. 用洗涤缓冲液工作溶液洗涤载玻片3×2分钟，将TSA-Drg工作溶液滴加到组织切片中，并在室温下孵育10分钟。
   2. 微波处理
      1. 用洗涤缓冲液工作溶液洗涤载玻片3×2分钟。
      2. 将载玻片放入染色和修复盒中，填充修复溶液，盖上盖子，然后在微波炉中以 2% 功率加热 8 x 100 分钟。在继续之前，让载玻片在室温下冷却（30-60分钟）。
      3. 用双蒸水清洗载玻片3×2分钟。
   3. 荧光基团 780 信号生成
      1. 将切片浸入洗涤缓冲液中，用荧光团780工作溶液覆盖，并将载玻片在室温下在加湿室中孵育1小时。
      2. 用洗涤缓冲液工作溶液洗涤载玻片3×2分钟。
         注意:在此步骤之后不要进行微波处理。
   4. 使用荧光基团 780 作为整个工作流程的最后一步，然后直接用 DAPI 工作溶液对细胞核进行染色。
      注意:如果不使用荧光基团 780，请跳过步骤 3.7。
8. 微波处理
   注意:该微波步骤剥离一级-二级 HRP 复合物并重新暴露抗原，从而允许引入下一个一抗。
   1. 将载玻片放入染色和修复盒中，用PH 6或PH9缓冲液填充，盖上盖子，然后在微波炉中以100%功率加热2×8分钟。
   2. 在继续之前，让载玻片在室温下冷却（30-60分钟）。用双蒸水清洗载玻片3×1分钟。
   3. 将载玻片浸入洗涤缓冲液工作溶液中2分钟。进行下一次抗体孵育。
9. 下一个抗体孵育
   1. 重复步骤 3.2-3.8（步骤 3.7 除外）。
10. 细胞核染色和组织密封
    1. 用DAPI工作溶液覆盖组织切片，并将载玻片在室温下在加湿室中孵育5分钟。用双蒸水清洗载玻片3×2分钟。
    2. 从载玻片中除去水滴，向每张载玻片中加入10-20μL抗荧光淬灭剂，并用显微镜盖玻片密封载玻片。
    3. 将完成的载玻片储存在4°C，避光保存1个月以上。
       注意: 注意避免气泡。

4.设置阴性对照

1. 像含组织载玻片一样处理阴性对照载玻片，但不添加一抗、二抗、TSA 试剂和 DAPI 等试剂，这些试剂用于在扫描胶片时去除组织自发荧光。

5. 组织载玻片全自动扫描

注:用于光谱成像的设备是全自动多光谱组织定量分析仪，可以使用参考系统对 5 色载玻片进行成像和分析可视化（参见 材料表）。该系统使用多光谱成像对多个荧光团和组织自发荧光进行定量解混。

1. 手动设置每个荧光通道的曝光时间和扫描程序，并确认仪器已完成组织载玻片的全自动曝光和扫描。
   注意: 载玻片表面必须清洁且无水膜。注意密封剂的用量:密封剂过多会导致盖玻片滑落，仪器报告错误。

6.荧光分析

1. 双击软件（见 材料表），将原始扫描得到的多色荧光图像文件拖拽到软件中，将图像类型设置为荧光。
2. 单击 "亮度和对比度 "按钮，然后检查面板上的通道。单击外部，然后在 通道 上选择感兴趣的荧光通道。拖动 Min 显示 和 Max 显示 以调整每个通道的亮度和对比度。
3. 分析后，确定要保存的视图，单击 "显示幻灯片概览 "和 "显示光标位置 "以删除这两个内容，保留比例尺，然后单击 "文件"|"导出快照 |用于导出 png 文件的当前查看器内容 。
   注意:必须导出每个荧光通道和合并的图形以备将来分析。
4. 如需进一步分析靶细胞阳性，请使用细胞鉴定和分割软件²¹ （参见 材料表）。

优化CD8一抗与荧光基团的配配方案。两组荧光结果对应于实验组中完全相同的抗体孵育条件，只是抗体匹配的荧光团发生了变化。如图2所示，CD8+ T细胞与荧光基团480和荧光基团690的通道匹配存在显著差异。荧光基团690的通道显示出极强的荧光背景——黄色圆圈内的大面积红色不规则荧光显示颜色，这对CD8+ T细胞的定位分析造成很大的干扰（图2C，D）。然而，具有荧光基团 480 的通道显示出非常特异性的 CD8 细胞膜阳性，并且没有荧光背景。因此，黄色圆圈显示了非常清晰的阳性细胞膜（图2A），这充分说明了抗体和荧光通道匹配在该方案中的重要性。

检测巨噬细胞和细胞毒性T细胞在非小细胞肺鳞癌组织中的分布，验证特征蛋白HMGCS1在肿瘤细胞和免疫细胞中的表达。如 图 3 所示，这些图像源自 QuPath 0.3.2。mIHC组为荧光基团480、520、620、690和DAPI，对应的抗体标志物为肺鳞状癌细胞标志物CK5/6;CD8，T细胞的标志物;CD68，巨噬细胞的标志物;和 HMGCS1，对血浆阳性肿瘤细胞具有特异性。巨噬细胞和CD8+ T细胞呈重浸润性，分布在鳞状癌病灶周围和内部，而HMGCS1在鳞状癌细胞血浆中广泛表达，显示出较强的肿瘤细胞阳性性。

图 1:FFPE 组织的多重免疫组织化学染色工作流程。 缩写:FFPE = 福尔马林固定和石蜡嵌入。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:CD8 和荧光基团匹配方案的优化。 CD8+ T细胞与荧光基团480和荧光基团690的通道匹配存在显著差异。比例尺 = 50 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:肺鳞状癌的多重免疫组织化学染色。 巨噬细胞和细胞毒性T细胞在非小细胞肺鳞状癌组织中的分布以及特征蛋白HMGCS1在肿瘤细胞和免疫细胞中的表达。CK5/6 是肺鳞状癌细胞的标志物;CD8 是 T 细胞的标志物;CD68是巨噬细胞的标志物;HMGCS1 对肿瘤细胞浆阳性细胞具有特异性。比例尺 = 50 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

表1:蛋白石多标记免疫荧光技术与传统免疫荧光技术的比较。

所有作者声明不存在利益冲突。