本实验方案描述并优化了一种多重免疫组织化学（IHC）染色方法，主要通过优化单通道抗体孵育条件，并调整抗体与通道的设置，以解决来源于临床肺癌组织中的自发荧光和通道串扰问题。
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本文内容
摘要
摘要
肺癌是全球恶性肿瘤相关发病率和死亡率的首要原因，复杂的肿瘤微环境被认为是导致肺癌患者死亡的主要因素。肿瘤微环境的复杂性要求采用有效的方法来解析肿瘤组织中细胞间的相互关系。多重免疫组织化学（mIHC）技术已成为推断肿瘤组织中信号通路上下游蛋白表达关系以及制定临床诊断和治疗方案的关键工具。mIHC是一种基于酪胺信号放大（Tyramine Signal Amplification, TSA）技术的多标记免疫荧光染色方法，可在同一组织切片样本上同时检测多个靶分子，实现不同蛋白的共表达与共定位分析。在本实验方案中，对来源于临床的肺鳞状细胞癌石蜡包埋组织切片进行了多重免疫组织化学染色。通过优化实验流程，实现了对目标细胞和蛋白的多重免疫组织化学染色，解决了肺组织中自发荧光和通道串扰的问题。此外，多重免疫组织化学染色广泛应用于肿瘤相关高通量测序结果的实验验证，包括单细胞测序、蛋白质组学和组织空间测序，为病理学研究提供了直观且可视化的验证结果。
引言
酪胺信号放大（TSA）技术已有20多年的历史，是一类利用辣根过氧化物酶（HRP）实现高密度信号放大的检测方法 原位 靶抗原的标记，在酶联免疫吸附试验（ELISAs）中广泛应用， 原位 原位杂交（ISH）、免疫组织化学（IHC）及其他生物抗原检测技术，显著提高了检测信号的灵敏度1基于TSA技术的Opal多色染色方法 recently developed and widely used in several studies2,3,4,5传统的免疫荧光（IF）染色为研究人员提供了一种简便的工具，用于检测和比较各种模式生物细胞和组织中蛋白质的分布情况。该技术基于抗体与抗原的特异性结合，包括直接法和间接法两种方法。6直接免疫染色采用针对目标抗原的荧光素标记的一抗，可在荧光显微镜下实现直接的荧光检测。间接免疫染色则需使用针对未标记一抗的荧光素标记二抗。6,7.
传统的单标记免疫荧光染色方法....
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方案
本方案已获中国四川大学华西医院伦理委员会指南批准。肺癌组织样本于华西医院肺癌中心手术期间获取，并已获得每位患者的知情同意。
1. 组织切片制备
- 石蜡包埋组织（FFPE）制备
- 将临床组织浸入中性福尔马林溶液中超过72小时。
- 使用二甲苯和梯度乙醇溶液完成组织脱水过程20。
- 手工进行石蜡包埋，并以4 µm厚度切片。使用防脱载玻片以确保组织切片不会脱落。
- 将载玻片置于65 °C烘箱中烘烤2小时，以确保组织与载玻片完全干燥。室温下存放于载玻片盒中。
- 组织切片预处理
- 将组织切片在65 °C烘箱中预处理5分钟，随后依次浸入二甲苯溶液中2次，每次15分钟；无水乙醇溶液中2次，每次15分钟；90%乙醇溶液中10分钟；85%乙醇溶液中10分钟；80%乙醇溶液中10分钟；75%乙醇溶液中10分钟；最后用无菌水洗涤3次，每次1分钟。
注意：该实验技术仅适用于石蜡包埋组织（FFPE），不适用于冷冻或新鲜组织，因为多次高温抗原修复过程会导致组织从载玻片上脱落。
- 将组织切片在65 °C烘箱中预处理5分钟，随后依次浸入二甲苯溶液中2次，每次15分钟；无水乙醇溶液中2次，每次15分钟；90%乙醇溶液中10分钟；85%乙醇溶液中10分钟；80%乙醇溶液中10分钟；75%乙醇溶液中10分钟；最后用无菌水洗涤3次，每次1分钟。
2. 一抗的优化
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结果
我们优化了CD8一抗与荧光染料的匹配方案。两组荧光结果在实验组中对应的抗体孵育条件完全相同，仅改变与抗体匹配的荧光染料。如图2所示，CD8+ T细胞使用荧光染料480与荧光染料690在通道匹配上存在显著差异。使用荧光染料690的通道显示出极强的荧光背景——黄色圆圈内大范围的红色不规则荧光信号造成了对CD8+ T细胞定位分析的严重干扰（图2C、D）。然而，使用荧光染料480的通道则显示出非常特异的CD8细胞膜阳性信号，且无荧光背景。因此，黄色圆圈内可见清晰的阳性细胞膜信号（图2A），充分说明了本实验方案中抗体与荧光通道匹配的重要性。
在非小细胞肺鳞状癌组织中检测了巨噬细胞和细胞毒性T细胞的分布情况，并验证了肿瘤细胞和免疫细胞中特征性蛋白HMGCS1的表达。如图3所示，图像来源于QuPath 0.3.2。多重免疫组化.......
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讨论
多重免疫组化（mIHC）是一种在单张组织切片中对单细胞水平下多种蛋白质标志物进行定量和空间分析的不可或缺的实验技术，通过聚焦原始组织环境中的精细组织结构和细胞间相互作用，为疾病病理学研究提供直观且准确的数据。为了推动mIHC技术的广泛应用，需要优化且高效的实验方案。针对实验中可能出现的问题，我们提出以下注意事项及解决方案。
首先，根据多色实验中抗原与荧光素标记抗体的匹配原则，低表达抗原应匹配强荧光素标记的抗体，而高表达抗原则应匹配弱荧光素标记的抗体。结合单抗体标记抗原的免疫组化（IHC）实验结果，确定目标蛋白的表达强度，并据此调整抗体与荧光素的匹配方式，最终确定多色标记实验所需的抗体与荧光素匹配方案。通过为相邻荧光通道选择具有不同蛋白表达水平的抗体，可解决相邻荧光通道间的串色问题。其次，使用 Akoya Biosciences 成像系统对染色切片进行成像时，需通过多光谱扫描软件 Phenochart 1.0 设置荧光信号检测的软件参数，该软件可用于检查荧光信号的平衡性22。建议单个荧光通道的曝光时间不超过 100 ms，多个荧光通道的.......
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披露
所有作者声明不存在利益冲突。
致谢
作者谨向中国华西医院临床病理研究所的成员致以谢意，他们为高质量的多重免疫荧光和免疫组化处理提供了技术指导。本方案得到了国家自然科学基金（82200078）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| Anti-CD8 | Abcam | ab237709 | 一抗，1/100，PH9 |
| Anti-CD68 | Abcam | ab955 | 一抗，1/300，PH9 |
| Anti-CK5/6 | Millipore | MAB1620 | 一抗，1/150，PH9 |
| Anti-HMGCS1 | GeneTex | GTX112346 | 一抗，1/300，PH6 |
| 动物非免疫血清 | MXB Biotechnologies | SP KIT-B3 | 抗原封闭 |
| Fluormount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | 抗荧光淬灭封片剂 |
| Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit | Akoya | NEL861001KT | Opal 多重免疫组化染色试剂盒 |
| 洗涤缓冲液 | Dako | K8000/K8002/K8007/K8023 | 组织切片洗涤 |
| 软件 | |||
| HALO | 智能定量组织分析软件，商业软件 | ||
| inForm | 智能定量组织分析软件，商业软件 | ||
| PerkinElmer Vectra | 多光谱组织成像系统，可全自动扫描组织切片 | ||
| QuPath 0.3.2 | 智能定量组织分析软件，开源软件，本实验中使用 |
参考文献
- Zaidi, A. U., Enomoto, H., Milbrandt, J., Roth, K. A. Dual fluorescent in situ hybridization and immunohistochemical detection with tyramide signal amplification. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (10), 1369-1375 (2000).
- Lovisa, S., et al.
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