多重免疫组织化学染色法用于石蜡包埋的肺癌组织

摘要

本实验方案描述并优化了一种多重免疫组织化学（IHC）染色方法，主要通过优化单通道抗体孵育条件，并调整抗体与通道的设置，以解决来源于临床肺癌组织中的自发荧光和通道串扰问题。

摘要

肺癌是全球恶性肿瘤相关发病率和死亡率的首要原因，复杂的肿瘤微环境被认为是导致肺癌患者死亡的主要因素。肿瘤微环境的复杂性要求采用有效的方法来解析肿瘤组织中细胞间的相互关系。多重免疫组织化学（mIHC）技术已成为推断肿瘤组织中信号通路上下游蛋白表达关系以及制定临床诊断和治疗方案的关键工具。mIHC是一种基于酪胺信号放大（Tyramine Signal Amplification, TSA）技术的多标记免疫荧光染色方法，可在同一组织切片样本上同时检测多个靶分子，实现不同蛋白的共表达与共定位分析。在本实验方案中，对来源于临床的肺鳞状细胞癌石蜡包埋组织切片进行了多重免疫组织化学染色。通过优化实验流程，实现了对目标细胞和蛋白的多重免疫组织化学染色，解决了肺组织中自发荧光和通道串扰的问题。此外，多重免疫组织化学染色广泛应用于肿瘤相关高通量测序结果的实验验证，包括单细胞测序、蛋白质组学和组织空间测序，为病理学研究提供了直观且可视化的验证结果。

引言

酪胺信号放大（TSA）技术已有20多年的历史，是一类利用辣根过氧化物酶（HRP）实现高密度信号放大的检测方法 原位 靶抗原的标记，在酶联免疫吸附试验（ELISAs）中广泛应用， 原位 原位杂交（ISH）、免疫组织化学（IHC）及其他生物抗原检测技术，显著提高了检测信号的灵敏度¹基于TSA技术的Opal多色染色方法 recently developed and widely used in several studies^2,3,4,5传统的免疫荧光（IF）染色为研究人员提供了一种简便的工具，用于检测和比较各种模式生物细胞和组织中蛋白质的分布情况。该技术基于抗体与抗原的特异性结合，包括直接法和间接法两种方法。⁶直接免疫染色采用针对目标抗原的荧光素标记的一抗，可在荧光显微镜下实现直接的荧光检测。间接免疫染色则需使用针对未标记一抗的荧光素标记二抗。^6,7.

传统的单标记免疫荧光染色方法只能在组织中染色一种、两种，或在某些情况下最多三种抗原，这在挖掘组织切片中所包含的丰富信息方面存在重大局限性。定量结果的解读通常依赖于肉眼观察以及ImageJ等成像软件的精确定量分析。该方法存在一些技术局限性，例如抗体种属限制、荧光标记信号较弱以及荧光染料颜色重叠（表1）。Opal多重免疫组化（mIHC）技术基于TSA衍生方法，可在同一组织切片上实现7至9种以上抗原的多重染色和差异化标记，且对一抗来源无种属限制，但要求相应抗体对目标抗原具有高度特异性。其染色流程与常规免疫荧光染色相似，仅存在两点差异：每轮染色仅使用一种抗体，并额外增加抗体洗脱步骤。通过非共价键结合于抗原的抗体可通过微波洗脱去除，而通过共价键结合在抗原表面的TSA荧光信号则得以保留。

经染料标记的活化酪胺（T）分子在靶抗原处高度富集，从而实现荧光信号的有效放大。该方法可在无抗体干扰的情况下直接标记抗原，通过多次染色循环可实现多色标记。^8,9,10 (图1）。尽管该技术能够为疾病研究提供可靠且准确的图像，但由于需要进行大量优化和设计，构建一个有效的多重荧光免疫组织化学（mfIHC）染色策略可能耗时且要求严格。因此，本多重检测 panel 方案已在自动化 IHC 染色仪上完成优化，染色时间较手动方案更短。该方法可直接应用于任何研究人员开展的人源福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本的免疫肿瘤学研究，并可根据需要进行调整。¹¹此外，载玻片制备、抗体优化以及多重检测设计的方法将有助于获得能够准确反映细胞间相互作用的稳定图像。 原位 并缩短手动分析的优化周期¹².

多重免疫组化（mfIHC）主要包括图像采集和数据分析。在图像采集方面，需要使用专业的光谱成像设备检测多色标记的复杂染色样本，以识别各种混合的颜色信号，并获得高信噪比、不受组织自发荧光干扰的图像。目前用于光谱成像的设备主要包括光谱共聚焦显微镜和多光谱组织成像系统。多光谱组织成像系统是一种专为组织切片定量分析设计的专业成像系统，其最重要的特点是能够获取图像的光谱信息，从而同时提供生物组织样本的形态结构和光学图谱信息^13,14。光谱图像中的任意像素都包含一条完整的光谱曲线，每种染料（包括自发荧光）都有其对应的特征光谱，这使得混合和重叠的多标记信号能够被完整记录并准确识别。

在数据分析方面，由于组织样本的形态结构及其组成细胞的复杂性，多色标记样本极为复杂。普通软件无法自动识别不同的组织类型，因此需使用智能定量组织分析软件对特定区域的抗原表达进行定量分析^15,16,17,18。

最重要的是，多标记免疫荧光染色结合多光谱成像与定量病理分析技术具有检测靶点数量多、染色效果好和分析准确等优势，因此可显著提高组织形态学分析的准确性，以细胞级分辨率揭示蛋白质之间的空间关系，并有助于从组织切片样本中挖掘更丰富且更可靠的信息¹⁹（表1）。

方案

本方案已获中国四川大学华西医院伦理委员会指南批准。肺癌组织样本于华西医院肺癌中心手术期间获取，并已获得每位患者的知情同意。

1. 组织切片制备

1. 石蜡包埋组织（FFPE）制备
   1. 将临床组织浸入中性福尔马林溶液中超过72小时。
   2. 使用二甲苯和梯度乙醇溶液完成组织脱水过程²⁰。
   3. 手工进行石蜡包埋，并以4 µm厚度切片。使用防脱载玻片以确保组织切片不会脱落。
   4. 将载玻片置于65 °C烘箱中烘烤2小时，以确保组织与载玻片完全干燥。室温下存放于载玻片盒中。
2. 组织切片预处理
   1. 将组织切片在65 °C烘箱中预处理5分钟，随后依次浸入二甲苯溶液中2次，每次15分钟；无水乙醇溶液中2次，每次15分钟；90%乙醇溶液中10分钟；85%乙醇溶液中10分钟；80%乙醇溶液中10分钟；75%乙醇溶液中10分钟；最后用无菌水洗涤3次，每次1分钟。
      ​注意：该实验技术仅适用于石蜡包埋组织（FFPE），不适用于冷冻或新鲜组织，因为多次高温抗原修复过程会导致组织从载玻片上脱落。

2. 一抗的优化

注意：采用常规免疫组化（IHC）实验确定各抗体的孵育条件，主要包括抗体浓度和抗原修复条件。请参考抗体说明书中的相关条件。

1. 使用略高于推荐浓度范围且为中间值的抗体浓度。
2. 根据蛋白表达位置优化抗原修复缓冲液程序 PH6 和 PH9。对于在细胞核中表达的蛋白，使用 PH9；对于其他蛋白，可任选一种程序（PH6 或 PH9）。

3. 多重免疫组化染色方法

注意：Opal多重免疫组化染色是现有多重免疫组化方法之一。在本实验的五色染色方案中，由于每个组织样本需要使用四种抗体进行染色，因此需要进行四次一抗孵育、二抗孵育和TSA信号放大显色孵育，以及五次抗原修复。最后，进行4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色及抗荧光淬灭封片剂封片。

1. 主要试剂的配制
   注意：根据组织切片的大小确定所需添加的试剂量。使用足够的体积完全覆盖组织切片区（通常每张切片50–150 µL）。实验所需的工作液配制方法如下：
   1. 洗涤缓冲液工作液：将20倍浓缩洗涤缓冲液用双蒸水按1:20稀释，室温保存。
   2. PH6缓冲液工作液：将100倍浓缩PH6缓冲液用双蒸水按1:100稀释。使用前新鲜配制，室温保存。
   3. PH9缓冲液工作液：将50倍浓缩PH9缓冲液用双蒸水按1:50稀释。使用前新鲜配制，室温保存。
   4. 聚合物HRP：仅针对兔源和鼠源的一抗配制此即用型溶液。
   5. 荧光染料工作液：将每种荧光染料粉末（除荧光染料780外）用75 µL DMSO溶解。每次操作前，将荧光染料用1倍扩增稀释液按1:100稀释。未用完的荧光染料工作液应丢弃。
   6. 荧光染料780工作液：将TSA-DIG用75 µL DMSO溶解，将荧光染料粉末780用300 µL双蒸水溶解。操作前，将TSA-DIG用1倍扩增稀释液按1:100稀释，将荧光染料780用抗体稀释液按1:25稀释。
   7. DAPI工作液：将DAPI溶液用双蒸水或PBS按1:50稀释。使用前新鲜配制，4 °C避光保存不超过48小时。
      注意：在整个多标记荧光染色实验过程中，仅使用双蒸水和新鲜配制的洗涤缓冲液工作液清洗切片。组织切片不得接触自来水；自来水中杂质可能附着于组织切片并引起自发荧光。实验全程需将样本避光保存。
2. 抗原修复
   1. 将切片放入染色修复盒中，加入PH6或PH9缓冲液工作液，盖上盖子，在微波炉中以100%功率加热2次，每次8分钟。
      ​注意：加热过程中向修复盒内添加双蒸水，防止过度蒸发导致切片干燥。
   2. 让切片在室温下冷却（30–60分钟）后再进行后续操作。
   3. 用双蒸水清洗切片3次，每次2分钟。使用疏水屏障笔在切片上围绕组织区域画圈。
3. 封闭
   1. 将组织切片浸入洗涤缓冲液中，覆盖封闭液，在湿盒中室温孵育10分钟。
4. 一抗孵育
   1. 从切片上去除封闭液，覆盖一抗工作液，在湿盒中于37 °C孵育1小时（在孵育箱中）或4 °C过夜（在冰箱中）。
      注意：切勿让切片干燥。
5. 引入聚合物HRP
   1. 用洗涤缓冲液工作液清洗切片3次，每次2分钟。直接将聚合物HRP逐滴加至组织切片上，室温孵育15分钟。
      注意：对于存放在冰箱中的切片，在清洗前需在室温放置约30分钟，以去除一抗。
6. 酪胺信号放大（TSA）反应
   1. 用洗涤缓冲液工作液清洗切片3次，每次2分钟，直接将荧光染料工作液逐滴加至组织切片上，室温孵育10分钟。再用洗涤缓冲液工作液清洗切片3次，每次2分钟。
7. 荧光染料780的特殊操作步骤
   注意：荧光染料780信号较弱，通常在整个实验的配色方案中安排在最后使用。本实验方案中一般不使用荧光染料780，但因其具有特异性，故列出其操作步骤。
   1. 引入TSA-DIG
      1. 用洗涤缓冲液工作液清洗切片3次，每次2分钟，将TSA-DIG工作液逐滴加至组织切片上，室温孵育10分钟。
   2. 微波处理
      1. 用洗涤缓冲液工作液清洗切片3次，每次2分钟。
      2. 将切片放入染色修复盒中，加入修复液，盖上盖子，在微波炉中以100%功率加热2次，每次8分钟。让切片在室温下冷却（30–60分钟）后再进行后续操作。
      3. 用双蒸水清洗切片3次，每次2分钟。
   3. 荧光染料780信号生成
      1. 将切片浸入洗涤缓冲液中，覆盖荧光染料780工作液，在湿盒中室温孵育1小时。
      2. 用洗涤缓冲液工作液清洗切片3次，每次2分钟。
         注意：此步骤后切勿进行微波处理。
   4. 将荧光染料780作为整个流程的最后一步，随后直接用DAPI工作液对细胞核进行染色。
      注意：若不使用荧光染料780，则跳过步骤3.7。
8. 微波处理
   注意：此微波步骤可去除一抗-二抗-HRP复合物并重新暴露抗原，以便引入下一个一抗。
   1. 将切片放入染色修复盒中，加入PH6或PH9缓冲液工作液，盖上盖子，在微波炉中以100%功率加热2次，每次8分钟。
   2. 让切片在室温下冷却（30–60分钟）。用双蒸水清洗切片3次，每次1分钟。
   3. 将切片浸入洗涤缓冲液工作液中2分钟。进行下一轮抗体孵育。
9. 下一轮抗体孵育
   1. 重复步骤3.2–3.8（除步骤3.7外）。
10. 细胞核染色与组织封片
    1. 覆盖DAPI工作液于组织切片上，在湿盒中室温孵育5分钟。用双蒸水清洗切片3次，每次2分钟。
    2. 去除切片上的水滴，每张切片加入10–20 µL抗荧光淬灭剂，用显微镜盖玻片封片。
    3. 将完成的切片置于4 °C避光保存，可保存超过1个月。
       ​注意：注意避免产生气泡。

4. 设置阴性对照

1. 处理阴性对照切片时，除不添加用于去除组织自发荧光的试剂（如一抗、二抗、TSA试剂和DAPI）外，其余步骤与含组织切片相同。

5. 组织切片的全自动扫描

注意：用于光谱成像的设备为全自动多光谱组织定量分析仪，可使用参考系统对五色切片进行成像与分析可视化（见材料表）。该系统采用多光谱成像技术，实现多种荧光染料及组织自发荧光的定量解混。

1. 手动为每个荧光通道设置曝光时间和扫描程序，并确认仪器已完成组织切片的全自动曝光与扫描。
   ​注意：切片表面必须清洁且无水膜。封片剂用量需谨慎：过多会导致盖玻片滑动，仪器报错。

6. 荧光分析

1. 双击软件（参见 材料表），将原始扫描获得的多色荧光图像文件拖入软件中，并将图像类型设置为荧光。
2. 点击 亮度 & 对比 按钮，然后检查面板上的通道。点击外部，再点击 通道 选择感兴趣的荧光通道。拖动 最小显示 和 最大显示 调节每个通道的亮度和对比度。
3. 分析后，确定要保存的视图，然后单击 展示幻灯片概览 和 显示光标位置 移除这两部分内容，保留比例尺，然后单击 文件 | 导出快照 | 当前查看器内容 导出 PNG 文件。
   注意：每个荧光通道及合并图像均须导出，以供后续分析。
4. 为进一步分析靶细胞阳性率，使用细胞识别与分割软件²¹ （参见 材料表).

结果

我们优化了CD8一抗与荧光染料的匹配方案。两组荧光结果在实验组中对应的抗体孵育条件完全相同，唯一区别在于匹配的荧光染料不同。如图2所示，CD8+ T细胞使用荧光染料480与荧光染料690在通道匹配上存在显著差异。使用荧光染料690的通道显示出极强的荧光背景——黄色圆圈内大范围的红色不规则荧光信号造成了对CD8+ T细胞定位分析的严重干扰（图2C、D）。然而，使用荧光染料480的通道则显示出非常特异的CD8细胞膜阳性信号，且无荧光背景。因此，黄色圆圈内可见非常清晰的阳性细胞膜信号（图2A），充分说明了本实验方案中抗体与荧光通道匹配的重要性。

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讨论

多重免疫组化（mIHC）是一种在单张组织切片中对单细胞水平下多种蛋白质标志物进行定量和空间分析的不可或缺的实验技术，通过聚焦原始组织环境中的精细组织结构和细胞间相互作用，为疾病病理学研究提供直观且准确的数据。为了推动mIHC技术的广泛应用，需要优化且高效的实验方案。针对实验中可能出现的问题，我们提出以下注意事项及解决方案。

首先，根据多色实验中抗原与荧光素标记抗体的匹配原则，低表达抗原应匹配强荧光素标记的抗体，而高表达抗原则应匹配弱荧光素标记的抗体。结合单抗体标记抗原的免疫组化（IHC）实验结果，确定目标蛋白的表达强度，并据此调整抗体与荧光素的匹配方式，最终确定多色标记实验所需的抗体与荧光素匹配方案。通过为相邻荧光通道选择具有不同蛋白表达水平的抗体，可解决相邻荧光通道间的串色问题。其次，使用 Akoya Biosciences 成像系统对染色切片进行成像时，需通过多光谱扫描软件 Phenochart 1.0 设置荧光信号检测的软件参数，该软件可用于检查荧光信号的平衡性²²。建议单个荧光通道的曝光时间不超过 100 ms，多个荧光通道的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
Anti-CD8	Abcam	ab237709	一抗，1/100，PH9
Anti-CD68	Abcam	ab955	一抗，1/300，PH9
Anti-CK5/6	Millipore	MAB1620	一抗，1/150，PH9
Anti-HMGCS1	GeneTex	GTX112346	一抗，1/300，PH6
动物非免疫血清	MXB Biotechnologies	SP KIT-B3	抗原封闭
Fluormount-G	SouthernBiotech	0100-01	抗荧光淬灭封片剂
Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit	Akoya	NEL861001KT	Opal 多重免疫组化染色试剂盒
洗涤缓冲液	Dako	K8000/K8002/K8007/K8023	组织切片洗涤
软件
HALO			智能定量组织分析软件，商业软件
inForm			智能定量组织分析软件，商业软件
PerkinElmer Vectra			多光谱组织成像系统，可全自动扫描组织切片
QuPath 0.3.2			智能定量组织分析软件，开源软件，本实验中使用