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方法文章

通过酶解法分离小鼠六种后肢肌肉获取完整短、中、长骨骼肌纤维：超越趾短屈肌的研究

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DOI：

10.3791/65851

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2023年12月1日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine, University of Antioquia

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了一种从成年小鼠六种肌肉中获取经酶法解离的不同长度和类型的肌纤维的方案：其中三种肌肉已有报道（趾短屈肌、趾长伸肌、比目鱼肌），另外三种则是首次成功实现解离（拇长伸肌、腓骨长肌、第四趾腓骨肌）。

摘要

通过酶解法分离小鼠肌肉获得的骨骼肌纤维是生理学实验的有用模型。然而，大多数研究集中于趾短屈肌（flexor digitorum brevis, FDB）的短纤维，这限制了有关肌纤维类型研究结果的适用范围，减少了可用的生物材料量，并阻碍了细胞生理现象与在其他肌肉中已获得的生化及动力学知识之间的清晰关联。

本文介绍了如何从六种具有不同纤维类型组成和长度的肌肉中获取完整的肌纤维。利用C57BL/6成年小鼠，我们展示了肌肉解剖和纤维分离的操作流程，并证明了所获得的肌纤维适用于Ca2+瞬变研究及其形态计量学表征。文中还提供了各肌肉的纤维类型组成。经分离后，所有肌肉均能获得完整且存活的肌纤维，这些纤维在超过24小时的时间内仍能快速收缩。趾短伸肌（FDB）产生短纤维（<1 mm），第四趾腓骨肌（PDQA）和腓骨长肌（PL）产生中等长度纤维（1–3 mm），而趾长伸肌（EDL）、拇长伸肌（EHL）和比目鱼肌则释放出长纤维（3–6 mm）。

使用快速染料 Mag-Fluo-4 记录时，PDQA、PL 和 EHL 肌纤维的 Ca2+ 瞬变表现出快速、窄幅的动力学特征，类似于已知对应于 IIX 型和 IIB 型纤维的形态学 II 型（MT-II）。这与这些肌肉中 II 型纤维比例超过 90% 的事实一致，相比之下，FDB 肌约为 80%，比目鱼肌约为 65%。在超越 FDB 肌的基础上，我们首次展示了多种肌肉的分离方法，所获得的肌纤维长度范围为 1 至 6 mm。这些肌纤维具有活性，并能产生快速的 Ca2+ 瞬变，表明 MT-II 特征可推广至来源于不同肌肉的 IIX 和 IIB 快肌纤维。这些结果提高了可用于成熟骨骼肌研究的模型系统的可获得性。

引言

哺乳动物成熟的骨骼肌是一种多功能组织。它在很大程度上调控机体代谢，是产热的主要来源，其动力学特性使其在呼吸、身体节段运动或整体位移中发挥关键作用1,2,3。骨骼肌在多种疾病的病理生理过程中也具有重要意义，包括遗传性和慢性疾病，如肌病、肌营养不良和肌肉减少症，以及许多非肌肉系统的慢性疾病，例如心脑血管代谢性疾病3,4,5,6,7,8。

在健康与疾病背景下，对成熟骨骼肌结构和功能特性进行离体（ex vivo）研究主要依赖于两种实验模型：完整肌肉和分离的肌纤维。20世纪，研究人员利用多种小型物种的完整趾长伸肌（EDL）、比目鱼肌、胫骨前肌和腓肠肌作为关键模型，深入研究了运动单位、肌纤维类型以及收缩与舒张过程中的力学和动力学特性9,10,11,12,13,14,15,16。然而，随着细胞生物学研究技术的不断精细化，研究重点逐渐转向单根肌纤维。早期的开创性工作通过酶解法成功分离出大鼠完整的趾短屈肌（FDB）肌纤维，为后续的表征分析奠定了基础17,18,19。尽管FDB肌纤维也可通过手工解剖获得20，但小鼠肌肉酶解法具有操作简便、通量高的优势，加之其适用于多种实验方法，使得该模型在过去二十年中被广泛应用。

短腓骨长肌纤维适用于电生理学及其他生物物理研究、生化、代谢和药理学分析、电子显微镜和荧光显微镜实验、细胞生物学研究中的转染操作，或作为肌发生研究中干细胞的来源5,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32。然而，在肌肉实验中仅使用腓骨长肌纤维会限制涉及肌纤维类型的研究范围，并减少可用于某些方法学技术或从单个动物获取更多信息的生物材料量。这些局限性阻碍了将细胞生理现象与先前在不同完整肌肉（如趾长伸肌、比目鱼肌、腓骨肌）中开展的生化和动力学研究结果进行明确关联。

克服这些局限性，一些研究团队已成功分离出较长的趾长伸肌（EDL）和比目鱼肌24,33,34,35,36,37,38,39,40，为将该方法进一步拓展至其他相关肌肉打开了大门。然而，目前使用EDL和比目鱼肌纤维的研究仍较为少见，可能原因是缺乏获取完整纤维的详细方法学描述。本文中，我们详细描述了如何从六种肌肉中分离出不同长度和类型的肌纤维：其中三种肌肉已有报道（FDB、EDL和比目鱼肌），另外三种则是首次成功分离（拇长伸肌[EHL]、腓骨长肌[PL]和第四趾腓骨肌[PDQA]）。本研究结果证实，酶解分离肌纤维模型适用于多种研究，并可与已发表的数据进行未来关联分析，从而进一步丰富了成熟骨骼肌研究可用的模型体系。

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方案

所有实验程序均经安蒂奥基亚大学（UdeA）动物实验伦理委员会批准（2018年6月21日第104号会议纪要）st，2016年，以及4月15日的005th，2021），依据哥伦比亚政府颁布的1989年第84号法律和1993年第8430号决议，并按照相关要求进行和报告 动物研究：体内实验报告 （ARRIVE）指南41所有结果均来自健康的7-13周龄、体重20-26 g的C57BL/6雄性小鼠。 图1 展示了本研究的总体设计及实验步骤顺序。所有试剂、材料和设备的详细信息均列于下文 材料表.

1. 动物

  1. 在丙烯酸透明矩形笼具中饲养小鼠，每笼最多六只，使用木源性垫料，在温度可控（21 ± 2 °C）和光照周期恒定（12:12 小时明暗循环）的条件下饲养。
  2. 在无特定病原体动物设施中饲养动物，提供自由采食和自由饮用自来水，不提供环境丰富化措施。

2. 解剖

  1. 溶液、材料与试剂
    1. 制备并过滤（0.22 µm) 工作溶液的组成为（所有浓度单位为 mM）：
      1. Tyrode：5.4 KCl，1 MgCl2，140 NaCl，0.33 NaH2PO4，2 CaCl210 葡萄糖，10 HEPES，pH 7.3
      2. 解离液：2.7 KCl，1.2 KH2PO4，0.5 MgCl2，138 NaCl，0.1 Na2HPO4，1 CaCl2，pH 7.4
      3. 磷酸盐缓冲液（PBS）：137 NaCl，8.6 Na2HPO4，2.8 KH2PO4，pH 7.34
    2. 准备两个解剖腔室、体视显微镜、手术剪、精细剪、精细镊子，以及带盖的洁净透明非锥形玻璃小瓶，小瓶宽度为1-1.5 cm，总体积为3-4 mL。在解剖腔室内设置用于电刺激肌肉的系统。
    3. 制备尖端宽度不同的火焰抛光巴斯德玻璃移液管：5、4、3、2 和 1 mm。
    4. 将水浴锅温度设定为 37 °C称取3 mg的II型胶原酶等分试样。
  2. 步骤
    1. 采用当地伦理委员会批准的方法处死小鼠。推荐使用颈椎脱位法，因其操作快速、应激性小，且可避免药物暴露对肌肉组织产生影响（如 CO2 或某些麻醉剂）。立即开始解剖以获得更好的结果。
    2. 将小鼠置于泡沫表面，固定前肢。使用手术剪在膝关节处剪下双侧后肢，分别转移至独立的解剖皿中，并加入冷的（10-20 °C用 Tyrode 液覆盖组织。
      注意：每条后肢可分离出六种不同的肌肉，顺序如下：FDB、soleus、EDL、EHL、PL 和 PDQA。有关从肌腱到肌腱完整分离这六种肌肉的详细解剖学参考见于 图2 及其他地方42.
    3. 将第一只后肢固定在解剖室中，使腿部后侧朝上可见。在放大镜下剥离皮肤，随后暴露并取出趾长伸肌（FDB）图2). 将其保存在一个标记好的玻璃小瓶中，加入1 mL Tyrode溶液。
      注意：需要适当的放大倍数和前期培训，以避免对肌肉组织造成不必要的切割。
    4. 暴露、分离并取出比目鱼肌，置于含有1 mL Tyrode液的独立样品管中保存。使用精细剪刀先分离腓肠肌，然后切除比目鱼肌，操作如图所示 图2.
    5. 暴露小腿前侧，去除皮肤，辨认踝部胫骨前肌和趾长伸肌（EDL）的远端肌腱。去除并弃去胫骨前肌；随后切断EDL的远端肌腱图2继续解剖直至分离出趾长伸肌（EDL），并将其置于含有1 mL Tyrode液的单独玻璃小瓶中。
    6. 去除位于EDL后内侧的EHL肌。解剖时首先识别并沿肌腱向远端追踪至第1趾st 数字，如相应面板所示 图2将肌肉组织置于单独的玻璃小瓶中，加入1 mL Tyrode液。
    7. 识别并沿腓骨肌中最外侧的肌腱切开，切除腓骨长肌（PL肌）图2将肌肉组织放入含有1 mL Tyrode液的单独玻璃小瓶中。
    8. 识别并沿肌腱追踪至第4th 指；剪断并移除PDQA肌（图2）。将其放入一个单独的玻璃小瓶中，加入1 mL Tyrode液。
    9. 用第二只后肢重复上述步骤。
    10. 将同类型的两块肌肉收集到一个贴好标签的玻璃小瓶或盛有台氏液的小型培养皿中。
      注意：若计划在一次操作中解剖两对以上的肌肉，应安排两名研究人员共同进行解剖操作。

3. 肌纤维分离方案

  1. 更换解剖室中的台氏液以去除碎片和小鼠毛发。将趾长伸肌（FDB）放入一个解剖室中，检查其完整性，然后转移至一个新的玻璃小瓶中，加入1 mL解离液。对趾短伸肌（EHL）、腓骨长肌（PL）和足底肌（PDQA）重复此操作。
    注意：如果肌肉出现过度收缩、损伤或对电刺激无反应，请勿继续进行下一步实验操作。应通过检查溶液质量（pH值、污染情况、渗透压）并提高解剖技术来优化解剖方案图1C 和 补充视频 S1).
  2. 沿腓肠肌和趾长伸肌纤维走向进行纵向或斜向切割（图2）。对于比目鱼肌，沿其中央肌腱切开，长度约为其80%。对于趾长伸肌，沿一至两条肌腱切开，长度与比目鱼肌大致相同。将每对肌肉放入玻璃小瓶中，每瓶加入1 mL解离液。
    注意：该步骤会使趾长伸肌（EDL）和比目鱼肌变小，从而有利于胶原酶更好地进入组织。操作时必须使用足够的放大倍数（40–50倍）以及精细的剪刀和镊子。在继续解离方案的下一步之前，务必通过肉眼观察和电刺激检查样品的完整性。
  3. 向每支含有1 mL解离溶液和一对肌肉的西林瓶中加入3 mg胶原酶2型（活性为250–300 U/mg）。根据所用酶批号的实际活性，精确调整胶原酶的添加量。
  4. 将肌肉对置于水浴中，在36.8–37.2 °C下孵育65–90分钟。37 °C，轻轻振荡。
    注意：严格控制温度。标准化操作流程，确保肌肉在胶原酶中孵育时间不超过100分钟，以避免组织损伤。
  5. 每隔5分钟在体视显微镜下检查一次小瓶，自65分钟后开始th 孵育的最短时间。当肌肉看起来略呈波纹状、粗糙且松散时，轻轻摇动小瓶，检查是否有肌纤维开始容易脱落。若如此，用室温的台罗德液（Tyrode）清洗肌肉，以灭活并去除胶原酶。
    注意：清洗过程必须小心进行，切勿用移液器触碰肌肉组织。首先加入 0.8 mL 台氏液，然后移除 0.8 mL 溶液。重复此操作 4–5 次，并确认溶液完全变澄清。
  6. 使用火焰抛光的巴斯德移液管，在Tyrode溶液中通过极其轻柔的吹打，从肌肉组织主体中分离出更多肌纤维。首先用最粗的移液管（5 mm尖端）搅动肌肉周围的溶液，然后轻柔地将肌肉组织吸入并推出移液管3–4次。当肌肉开始释放出纤维并变细时，换用下一支移液管（4 mm尖端）重复上述操作。
    注意：通过本方案制备的肌纤维在超过24小时的时间内仍保持兴奋性，并能迅速收缩，此特性已在跖肌（PL）、趾长伸肌（EDL）、拇长伸肌（EHL）和比目鱼肌（soleus）肌纤维中得到验证。 补充视频 S2，补充视频 S3，补充视频 S4 和 补充视频 S5.

4. 实验步骤

注意：分离的肌纤维用于估算肌浆钙离子（Ca2+）浓度、形态计量学测量以及肌球蛋白重链（MHC）表达研究。

  1. 肌浆钙的测量2+ 收缩期间的浓度
    1. 将一块干净的玻璃载玻片安装到实验浴槽室中。用2-3 µL 层粘连蛋白，并在倒入约400 µL 将纤维悬液滴加到载玻片上，室温孵育10-15分钟，使纤维黏附于层粘连蛋白。
    2. 将实验腔室安装到配备落射荧光装置的倒置显微镜载物台上图3A).
    3. 通过置于实验腔室两侧的两个铂电极施加矩形电流脉冲（0.8–1.2 ms），诱发单次抽搐以验证纤维的活性。即使附着于层粘连蛋白上，纤维的收缩仍主要在末端可见。
    4. 用3.5-加载纤维4.5 µM 快速Ca2+ Mag-Fluo-4 AM 染料在Tyrode溶液中孵育4-5分钟。孵育结束后，用Tyrode溶液轻轻洗涤，以去除细胞外染料。在避光条件下静置约15-20分钟，使细胞内染料完成去酯化。始终将温度保持在以下 22 °C 以避免染料的区室化。
      注意：仅用二甲基亚砜（DMSO）配制Mag-Fluo-4, AM储备液，以确保染色用Tyrode溶液中的DMSO终浓度低于0.5%。
    5. 使用白光发光二极管（LED）和滤光片组照射光纤，激发/二向色/发射波长分别为：450-490/510/515 nm（图3A).
      注意：激发光源的替代选择包括汞灯和氙荧光灯。应使用尽可能低的激发光强度和最小的激发光斑尺寸，以避免染料发生光漂白以及对细胞造成损伤。
    6. 诱发纤维的 Ca2+ 反应（肌浆钙）2+ 通过放置在实验腔室两侧的两个铂电极施加矩形电流脉冲（0.8–1.2 ms），在20–22 °C.
    7. 使用适用于荧光成像的40倍油浸长距离物镜和连接至数字转换器的光电倍增管（PMT）收集并保存光信号图3A 和 补充视频 S6）。确保采集软件中的量程为0-200任意单位（AU），并设定静息荧光（F休息) 通过调节激发光斑的大小和PMT的增益，将该实验的检测范围调整为该尺度下的10 AU。一旦操作流程标准化，应在不同实验间保持增益不变，仅通过微调光斑大小来设定检测尺度。
      注意：如果出现运动伪影，使用 20-30 µM N-苄基-p甲苯磺酰胺（BTS）加入台罗德液中。
    8. 按如下步骤分析和校准信号：
      1. 将整个轨迹信号用1 kHz低通滤波器进行滤波。
      2. 计算 F休息 在1秒的轨迹中，调节 F休息 至0，并测量肌浆钙峰值2+ 瞬变幅度（F峰值）。将振幅表示为方程（1):
        静态平衡公式，ΔF/F = Fpeak/Frest，用于平衡分析的数学表达式。   (1)
      3. 计算峰值 Ca2+ 浓度（[Ca2+], µM）使用公式（2)26 以及以下参数： 原位 解离常数 (Kd) = 1.65 × 105 µM2，最大荧光强度（F最大值) 150.9 AU，最小荧光强度F分钟) 0.14 AU，Mag-Fluo-4 浓度 [D]T 的 229.1 µM26. F峰值 已在步骤 4.1.8.2 中获得。
        钙离子浓度方程，符号，与生物化学和光谱分析相关。   (2)
      4. 测量信号从10%到90%幅度的上升时间（RT，ms）、半峰全宽（HW，ms）以及从90%到10%幅度的衰减时间（DT，ms）。然后，根据双指数函数拟合估算衰减动力学（方程 3):
        双指数衰减公式 Y=A₁exp(x-x₀/τ₁)+A₂exp(x-x₀/τ₂)+C，数学方程   (3)
      5. 保存衰减时间常数 τ 的值1 和 τ2 （毫秒）和振幅 A1 和 A226.
  2. 形态测量
    1. 将一块干净的玻璃载玻片安装到实验浴槽室中。用2-3 µL 层粘连蛋白，并在倒入约400 µL 将纤维悬液滴加到载玻片上，室温孵育10–15分钟，使纤维黏附于层粘连蛋白。
    2. 通过置于实验腔室两侧的两根铂电极施加矩形电流脉冲（0.8–1.2 ms），诱发单次抽搐以验证纤维的活性。即使附着于层粘连蛋白上，纤维的收缩仍主要在末端可见。
    3. 使用倒置荧光显微镜，配备10倍和20倍物镜以及至少500万像素的相机，采集活纤维的图像。将图像以.TIFF格式存储，用于离线分析。
      注意：可能需要一组约 2-6 张图像才能完整捕获一根长纤维。
    4. 在相同放大倍数下拍摄显微镜微米标尺的图像。将图像以 .TIFF 格式存储，用于离线分析。
    5. 使用图像分析免费软件中的校准工具测量纤维的长度和直径，步骤如下：
      1. 在像素与已知距离之间建立对应关系（µm借助显微镜微米校准尺，在图像中测量 分析/设置比例尺工具 如图所示 补充图 S1.
      2. 从纤维的一端到另一端测量一次长度，并沿纤维在2-6个不同位置测量直径（每张图像1-2次测量，具体取决于其长度），如 补充图 S1.
      3. 报告长度值（µm 或毫米）以及所有直径的平均值（µm每根纤维的测量值。
  3. 肌球蛋白重链表达研究
    注意：有关通过免疫荧光法检测MHC的详细信息43 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）33,44,45,46 在整块肌肉中，请参见 补充文件 1通过免疫荧光法检测分离自FDB肌纤维悬液中的MHC以进行肌纤维分型的实验步骤如下：
    1. 将五张洁净的玻璃载玻片分别涂覆2-3 µL 层粘连蛋白，并在倒入约300 µL 将纤维悬浮液加到每张载玻片上。室温下孵育4小时，使纤维黏附于层粘连蛋白。
    2. 使用冷冻冷却的丙酮在室温下固定样本30分钟。
    3. 用 PBS 轻柔洗涤 3 次。
    4. 用含0.7% Triton X-100的PBS在室温下处理细胞15分钟，以通透细胞膜。
    5. 用含0.2%牛血清白蛋白（BSA）和0.04% Triton X-100的PBS轻柔洗涤3次，随后在室温下用含2% BSA、2% goat serum和0.4% Triton X-100的PBS封闭30分钟。
    6. 用含 0.2% BSA 和 0.04% Triton X-100 的 PBS 轻柔洗涤 3 次，随后按如下步骤加入一抗孵育：
      1. 将每种抗MHC一抗分别加入含有1% BSA和0.04% Triton X-100的PBS中稀释：抗-I（1:1,500）、抗-II（1:600）、抗-IIA（使用杂交瘤的全部条件培养基）、抗-IIB（1:500）。
      2. 将每张载玻片分别与一种抗体孵育，剩余的载玻片用PBS作为对照，在4℃孵育12-16 h 4 °C.
        注意：在本实验方案中，所有样本的IIX型纤维均未被标记。
    7. 用 PBS 轻柔洗涤 3 次，所有切片在室温下与偶联荧光绿色分子的二抗（1:800）孵育 1–2 小时。
    8. 用染料对细胞核进行染色 1 µg/mL Hoechst 染色 15 分钟。
    9. 用 PBS 轻柔洗涤 3 次，小心加入 20-40 µL 加入封片剂，盖上盖玻片。
      注意：轻柔的溶液更换和洗涤可确保数十根纤维仍附着在载玻片上，从而使实验具有统计学意义。
    10. 使用适合荧光观察的10倍物镜及激发/二向色/发射波长分别为450-490/510/515 nm的滤光片组，逐张观察每个切片，并计数所有阳性与阴性纤维。或者，在相同的光学条件下，使用倒置荧光显微镜配备至少500万像素的相机采集荧光图像，并以.TIFF格式存储，用于离线分析。
    11. 在数据库中记录每张切片的阳性与阴性纤维，并根据每张切片中纤维的总数，计算I型、IIA型、IIB型以及II型纤维中阳性的百分比。通过从总II型纤维百分比中减去IIA型与IIB型纤维百分比之和，计算IIX型纤维的百分比。通过从100%中减去I型与II型纤维百分比之和，估算杂交型I/IIA纤维的百分比。最后，从I型与II型纤维总百分比中减去杂交型纤维的百分比，得到纯I型和II型纤维的百分比。
      注意：在MHC组成研究中，纤维类型用大写字母表示，而同工型用小写字母表示46.
  4. 苏木精和伊红染色
    1. 用干净的玻璃载玻片包被2-3 µL 层粘连蛋白，并在倒入约300 µL 将纤维悬浮液滴加到载玻片上，室温下孵育4小时，使纤维黏附于层粘连蛋白。
    2. 用卡诺伊固定液（60% 无水乙醇、30% 氯仿、10% 乙酸）在室温下固定 5 分钟。
    3. 用苏木精孵育 90 秒。
    4. 用自来水轻柔冲洗3次。
    5. 用70%乙醇配制的1%伊红Y染色30秒。
    6. 用自来水轻柔冲洗3次。
    7. 浸入无水乙醇中3次。
    8. 在二甲苯中孵育 60 秒。
    9. 加入20-40 µL 使用封片剂封片，并用普通显微镜观察。使用至少500万像素的彩色相机，以所需放大倍数采集图像。

5. 统计分析与作图

注意：实验单位为肌纤维。

  1. 以均值 ± 标准差表示结果，并对部分分析计算 95% 置信区间（CI95%）。
  2. 为比较各组之间的长度、直径及 Ca2+ 瞬变动力学，采用方差分析（ANOVA）及事后检验，并进行 Bonferroni 校正。
  3. 分别使用 Shapiro-Wilk 检验和 Levene 检验评估正态性与方差齐性。
  4. 当 p < 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。

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结果

单次收缩期间肌浆中的 Ca2+ 浓度
为了验证在分离的肌纤维样本中进行生理学实验的可行性，并扩展我们此前关于兴奋-收缩耦联（ECC）和肌纤维类型的研究结果，我们采集了来自所有肌肉的肌纤维中 Ca2+ 瞬变信号。首先，FDB（n = 5）和 EDL（n = 7）显示出被称为形态类型 II（MT-II）的 Ca2+ 动力学特征。这类信号快速且呈尖峰状，其上升时间（RT）约为 1 ms；其衰减相可用双指数函数拟合，其中第一组分（A1）占总振幅的 30% 以上，峰值 [Ca2+] 介于 15 至 30 µM 之间33,47 (图 3B)。这些结果被合并（n = 12）并列于表 1的第一列中，而比目鱼肌 Ca2+...

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讨论

为补充现有的成熟骨骼肌生物学研究模型，本文展示了对多种具有短、中、长肌纤维的小鼠肌肉进行成功酶解分离的方法。这些肌纤维可用于验证Ca²⁺诱导的MT-II动力学在不同纤维类型中的普适性2+ 骨骼肌中的瞬时变化。此外，对完整整块肌肉中的肌纤维类型进行了分类。鉴于FDB肌是生理学实验中最常用的肌肉，因此评估了分离后细胞悬液中所含肌纤维的类型。

用于肌肉生物学研究的一系列短、中、长完整肌纤维
解剖技术、酶解处理时间、所用酶的类型以及吹打程序是获得完整酶解分离纤维的关键步骤。解剖操作应尽可能迅速，以减少组织在缺氧状态下的暴露时间，同时避免不必要的牵拉。后一点对于比目鱼肌尤为重要，不得通过上提腓肠肌-比目鱼肌复合体的方式将其取出。此外，长时间的酶解处理（约3 h）20,48 研磨操作不当（例如操作粗暴或研究人员经验不足）会损伤细胞，这一点已在多个实验室中得到实证。推荐使用胶原酶2型，而非其他类型的胶原酶。研磨过...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者感谢乌dea的Robinson Ramírez教授在动物实验和部分照片方面提供的帮助，以及Carolina Palacios提供的技术支持。Kaika公司的Johan Pineda协助我们设置了彩色和荧光相机。昆士兰大学的Shyuan Ngo kindly对稿件进行了校对。本研究由CODI-UdeA资助（2020-34909，2020年2月22日）nd，2021年，以及2021-40170号文件，发布于3月31日st，2022年，SIU）以及哥伦比亚麦德林市安蒂奥基亚大学规划办公室（E01708-K 和 ES03180101）向 JCC 提供资助。资助方未参与数据收集与分析、稿件撰写或提交过程。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
无水乙醇Sigma Aldrich32221
丙酮Merck179124
丙烯酰胺Gibco BRL15512-015
过硫酸铵Panreac141138.1610
抗肌球蛋白I抗体Sigma AldrichM4276一抗
抗肌球蛋白II抗体Sigma AldrichM8421一抗
抗肌球蛋白IIA抗体American Type Culture CollectionSC-71一抗。源自HB-277杂交瘤
抗肌球蛋白IIB抗体Developmental Studies Hybridoma BankBF-F3-c 一抗
双丙烯酰胺AMRESCO0172
牛血清白蛋白Thermo ScientificB14
Bradford试剂Merck1.10306.0500
溴酚蓝Carlo Erba428658
碳酸钙Merck102066
氯化钙（CaCl2）Merck2389
氯仿Sigma Aldrich319988
II型胶原酶WorthingtonCLS-2/LS004176
Consul-MountThermo Scientific9990440
考马斯亮蓝R 250 Merck112553
二甲基亚砜（DMSO）Sigma AldrichD2650
二硫苏糖醇（DTT）AMRESCO0281
乙二胺四乙酸（EDTA）AMRESCO0322
伊红YSigma AldrichE4009
甘油Panreac 1423291211
甘氨酸Panreac151340.1067
山羊血清Sigma AldrichG9023
苏木精Thermo Scientific6765015
HEPESAMRESCO0511
Hoechst 33258Sigma Aldrich861405
咪唑AMRESCOM136
异戊烷Sigma AldrichM32631
层粘连蛋白Sigma AldrichL2020
Mag-Fluo-4, AMInvitrogenM14206仅用DMSO配制。为避免纤维退化，无需且不应使用Pluronic酸。
巯基乙醇ApplichemA11080100
甲醇ProtokimicaMP10043
小鼠多个品系多个品系本研究仅使用C57BL/6小鼠。然而，一些初步结果表明，该方案对同龄同体重的Swiss Webster小鼠同样有效。
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）PromegaV3161
N-苄基-对甲苯磺酰胺（BTS）Tocris1870
最佳切割温度化合物（OCT）Thermo Scientific6769006
二抗Thermo ScientificA-11001山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488标记
十二烷基硫酸钠Panreac 1323631209
TRIS 0.5 M，pH 6.8 AMRESCOJ832
三（羟甲基）氨基甲烷AMRESCOM151
吐温X-100AMRESCOM143
材料
解剖皿定制
带电载玻片Erie Scientific5951PLUS
实验浴槽Warner InstrumentsRC-27NE2带电场刺激功能的窄型浴槽，安装于PH-6加热平台
精细镊子World Precision Instruments500338, 500230
精细剪刀World Precision InstrumentsVannas剪刀 501778
玻璃巴斯德移液管多个火焰抛光尖端
带盖玻璃小瓶多个容积2–3 mL
手术剪刀World Precision Instruments501223-G
设备
离心机Thermo ScientificSL 8R
共聚焦显微镜OlympusFV1000
冷冻切片机LeicaCM1850
数码相机ZeissErc 5s 和 Axio 305Axio 305与Stemi 508体视显微镜联用，用于解剖过程中拍照；Erc 5s或Axio 208与Axio Observer A1显微镜联用，用于拍摄分离纤维及免疫荧光检测图像
数据采集器Molecular Devices1550A Digidata
电泳槽Bio RadMini-Protean IV
倒置荧光显微镜ZeissAxio Observer A1配备合适的光源、滤光片和物镜用于荧光成像
光电倍增管HoribaR928管，Hamamatsu，安装于Horiba D104光度计连接至荧光显微镜的侧端口
体视显微镜ZeissStemi 508
刺激器 Grass Instruments S6
水浴锅 MemmertWNE-22
二甲苯Sigma Aldrich808691
软件
用于电泳分析的免费软件肯塔基大学GelBandFitter v1.7http://www.gelbandfitter.org
用于图像分析和形态测量的免费软件美国国立卫生研究院ImageJ v1.54https://imagej.nih.gov/ij/index.html
用于Ca2+信号采集与分析的授权软件Molecular DevicespCLAMP v10.05https://www.moleculardevices.com
用于统计分析和绘图的授权软件OriginLabOriginPro 2019https://www.originlab.com/

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