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方法文章

通过酶解法分离小鼠六种后肢肌肉获取完整短、中、长骨骼肌纤维：超越趾短屈肌的研究

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DOI：

10.3791/65851

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2023年12月1日

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1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine, University of Antioquia

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了一种从成年小鼠六种肌肉中获取经酶法解离的不同长度和类型的肌纤维的方案：其中三种肌肉已有报道（趾短屈肌、趾长伸肌、比目鱼肌），另外三种则是首次成功实现解离（拇长伸肌、腓骨长肌、第四趾腓骨肌）。

摘要

通过酶解法分离小鼠肌肉获得的骨骼肌纤维是生理学实验的有用模型。然而，大多数研究集中于趾短屈肌（flexor digitorum brevis, FDB）的短纤维，这限制了有关肌纤维类型研究结果的适用范围，减少了可用的生物材料量，并阻碍了细胞生理现象与在其他肌肉中已获得的生化及动力学知识之间的清晰关联。

本文介绍了如何从六种具有不同纤维类型组成和长度的肌肉中获取完整的肌纤维。利用C57BL/6成年小鼠，我们展示了肌肉解剖和纤维分离的操作流程，并证明了所获得的肌纤维适用于Ca2+瞬变研究及其形态计量学表征。文中还提供了各肌肉的纤维类型组成。经分离后，所有肌肉均能获得完整且存活的肌纤维，这些纤维在超过24小时的时间内仍能快速收缩。趾短伸肌（FDB）产生短纤维（<1 mm），第四趾腓骨肌（PDQA）和腓骨长肌（PL）产生中等长度纤维（1–3 mm），而趾长伸肌（EDL）、拇长伸肌（EHL）和比目鱼肌则释放出长纤维（3–6 mm）。

使用快速染料 Mag-Fluo-4 记录时，PDQA、PL 和 EHL 肌纤维的 Ca2+ 瞬变表现出快速、窄幅的动力学特征，类似于已知对应于 IIX 型和 IIB 型纤维的形态学 II 型（MT-II）。这与这些肌肉中 II 型纤维比例超过 90% 的事实一致，相比之下，FDB 肌约为 80%，比目鱼肌约为 65%。在超越 FDB 肌的基础上，我们首次展示了多种肌肉的分离方法，所获得的肌纤维长度范围为 1 至 6 mm。这些肌纤维具有活性，并能产生快速的 Ca2+ 瞬变，表明 MT-II 特征可推广至来源于不同肌肉的 IIX 和 IIB 快肌纤维。这些结果提高了可用于成熟骨骼肌研究的模型系统的可获得性。

引言

哺乳动物成熟的骨骼肌是一种多功能组织。它在很大程度上调控机体代谢，是产热的主要来源，其动力学特性使其在呼吸、身体节段运动或整体位移中发挥关键作用1,2,3。骨骼肌在多种疾病的病理生理过程中也具有重要意义，包括遗传性和慢性疾病，如肌病、肌营养不良和肌肉减少症，以及许多非肌肉系统的慢性疾病，例如心脑血管代谢性疾病3,4,5,6,7,8。

在健康与疾病背景下，对成熟骨骼肌结构和功能特性进行离体（ex vivo）研究主要依赖于两种实验模型：完整肌肉和分离的肌纤维。20世纪，研究人员利用多种小型物种的完整趾长伸肌（EDL）、比目鱼肌、胫骨前肌和腓肠肌作为关键模型，深入研究了运动单位、肌纤维类型以及收缩与舒张过程中的力学和动力学特性9

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方案

所有实验程序均经安蒂奥基亚大学（UdeA）动物实验伦理委员会批准（2018年6月21日第104号会议纪要）st，2016年，以及4月15日的005th，2021），依据哥伦比亚政府颁布的1989年第84号法律和1993年第8430号决议，并按照相关要求进行和报告 动物研究：体内实验报告 （ARRIVE）指南41所有结果均来自健康的7-13周龄、体重20-26 g的C57BL/6雄性小鼠。 图1 展示了本研究的总体设计及实验步骤顺序。所有试剂、材料和设备的详细信息均列于下文 材料表.

1. 动物

  1. 在丙烯酸透明矩形笼具中饲养小鼠，每笼最多六只，使用木源性垫料，在温度可控（21 ± 2 °C）和光照周期恒定（12:12 小时明暗循环）的条件下饲养。
  2. 在无特定病原体动物设施中饲养动物，提供自由采食和自由饮用自来水，不提供环境丰富化措施。

2. 解剖

  1. 溶液、材料与试剂
    1. 制备并过滤（0.22 µm) 工作溶液的组成为（所有浓度单位为 mM）：
        ....

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结果

单次收缩期间肌浆中的 Ca2+ 浓度
为了验证在分离的肌纤维样本中进行生理学实验的可行性，并扩展我们此前关于兴奋-收缩耦联（ECC）和肌纤维类型的研究结果，我们采集了来自所有肌肉的肌纤维中 Ca2+ 瞬变信号。首先，FDB（n = 5）和 EDL（n = 7）显示出被称为形态类型 II（MT-II）的 Ca2+ 动力学特征。这类信号快速且呈尖峰状，其上升时间（RT）约为 1 ms；其衰减相可用双指数函数拟合，其中第一组分（A1）占总振幅的 30% 以上，峰值 [Ca2+] 介于 15 至 30 µM 之间33,47 (图 3B)。这些结果被合并（n = 12）并列于表 1的第一列中，而比目鱼肌 Ca2+.......

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讨论

为补充现有的成熟骨骼肌生物学研究模型，本文展示了对多种具有短、中、长肌纤维的小鼠肌肉进行成功酶解分离的方法。这些肌纤维可用于验证Ca²⁺诱导的MT-II动力学在不同纤维类型中的普适性2+ 骨骼肌中的瞬时变化。此外，对完整整块肌肉中的肌纤维类型进行了分类。鉴于FDB肌是生理学实验中最常用的肌肉，因此评估了分离后细胞悬液中所含肌纤维的类型。

用于肌肉生物学研究的一系列短、中、长完整肌纤维
解剖技术、酶解处理时间、所用酶的类型以及吹打程序是获得完整酶解分离纤维的关键步骤。解剖操作应尽可能迅速，以减少组织在缺氧状态下的暴露时间，同时避免不必要的牵拉。后一点对于比目鱼肌尤为重要，不得通过上提腓肠肌-比目鱼肌复合体的方式将其取出。此外，长时间的酶解处理（约3 h）20,48 研磨操作不当（例如操作粗暴或研究人员经验不足）会损伤细胞，这一点已在多个实验室中得到实证。推荐使用胶原酶2型，而非其他类型的胶原酶。研磨过.......

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者感谢乌dea的Robinson Ramírez教授在动物实验和部分照片方面提供的帮助，以及Carolina Palacios提供的技术支持。Kaika公司的Johan Pineda协助我们设置了彩色和荧光相机。昆士兰大学的Shyuan Ngo kindly对稿件进行了校对。本研究由CODI-UdeA资助（2020-34909，2020年2月22日）nd，2021年，以及2021-40170号文件，发布于3月31日st，2022年，SIU）以及哥伦比亚麦德林市安蒂奥基亚大学规划办公室（E01708-K 和 ES03180101）向 JCC 提供资助。资助方未参与数据收集与分析、稿件撰写或提交过程。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
无水乙醇Sigma Aldrich32221
丙酮Merck179124
丙烯酰胺Gibco BRL15512-015
过硫酸铵Panreac141138.1610
抗肌球蛋白I抗体Sigma AldrichM4276一抗
抗肌球蛋白II抗体Sigma AldrichM8421一抗
抗肌球蛋白IIA抗体American Type Culture CollectionSC-71一抗。源自HB-277杂交瘤
抗肌球蛋白IIB抗体Developmental Studies Hybridoma BankBF-F3-c 一抗
双丙烯酰胺AMRESCO0172
牛血清白蛋白Thermo ScientificB14
Bradford试剂Merck1.10306.0500
溴酚蓝Carlo Erba428658
碳酸钙Merck102066
氯化钙（CaCl2）Merck2389
氯仿Sigma Aldrich319988
II型胶原酶WorthingtonCLS-2/LS004176
Consul-MountThermo Scientific9990440
考马斯亮蓝R 250 Merck112553
二甲基亚砜（DMSO）Sigma AldrichD2650
二硫苏糖醇（DTT）AMRESCO0281
乙二胺四乙酸（EDTA）AMRESCO0322
伊红YSigma AldrichE4009
甘油Panreac 1423291211
甘氨酸Panreac151340.1067
山羊血清Sigma AldrichG9023
苏木精Thermo Scientific6765015
HEPESAMRESCO0511
Hoechst 33258Sigma Aldrich861405
咪唑AMRESCOM136
异戊烷Sigma AldrichM32631
层粘连蛋白Sigma AldrichL2020
Mag-Fluo-4, AMInvitrogenM14206仅用DMSO配制。为避免纤维退化，无需且不应使用Pluronic酸。
巯基乙醇ApplichemA11080100
甲醇ProtokimicaMP10043
小鼠多个品系多个品系本研究仅使用C57BL/6小鼠。然而，一些初步结果表明，该方案对同龄同体重的Swiss Webster小鼠同样有效。
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）PromegaV3161
N-苄基-对甲苯磺酰胺（BTS）Tocris1870
最佳切割温度化合物（OCT）Thermo Scientific6769006
二抗Thermo ScientificA-11001山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488标记
十二烷基硫酸钠Panreac 1323631209
TRIS 0.5 M，pH 6.8 AMRESCOJ832
三（羟甲基）氨基甲烷AMRESCOM151
吐温X-100AMRESCOM143
材料
解剖皿定制
带电载玻片Erie Scientific5951PLUS
实验浴槽Warner InstrumentsRC-27NE2带电场刺激功能的窄型浴槽，安装于PH-6加热平台
精细镊子World Precision Instruments500338, 500230
精细剪刀World Precision InstrumentsVannas剪刀 501778
玻璃巴斯德移液管多个火焰抛光尖端
带盖玻璃小瓶多个容积2–3 mL
手术剪刀World Precision Instruments501223-G
设备
离心机Thermo ScientificSL 8R
共聚焦显微镜OlympusFV1000
冷冻切片机LeicaCM1850
数码相机ZeissErc 5s 和 Axio 305Axio 305与Stemi 508体视显微镜联用，用于解剖过程中拍照；Erc 5s或Axio 208与Axio Observer A1显微镜联用，用于拍摄分离纤维及免疫荧光检测图像
数据采集器Molecular Devices1550A Digidata
电泳槽Bio RadMini-Protean IV
倒置荧光显微镜ZeissAxio Observer A1配备合适的光源、滤光片和物镜用于荧光成像
光电倍增管HoribaR928管，Hamamatsu，安装于Horiba D104光度计连接至荧光显微镜的侧端口
体视显微镜ZeissStemi 508
刺激器 Grass Instruments S6
水浴锅 MemmertWNE-22
二甲苯Sigma Aldrich808691
软件
用于电泳分析的免费软件肯塔基大学GelBandFitter v1.7http://www.gelbandfitter.org
用于图像分析和形态测量的免费软件美国国立卫生研究院ImageJ v1.54https://imagej.nih.gov/ij/index.html
用于Ca2+信号采集与分析的授权软件Molecular DevicespCLAMP v10.05https://www.moleculardevices.com
用于统计分析和绘图的授权软件OriginLabOriginPro 2019https://www.originlab.com/

参考文献

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcif Tissue Int. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Barclay, C., Launikonis, B. Components of activation heat in skeletal muscle. J Muscle Res Cell Motil. 42 (1), 1-16 (2021).
  3. G....

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