本文介绍了一种优化的肌腱原位杂交实验方案。in situ 方法涵盖了组织制备、切片通透化、探针设计以及信号放大等步骤。
本文内容
摘要
摘要
近年来，许多高分辨率转录组学实验方案已在医学和生物学的多个领域中建立。然而，由于富含基质的组织（特别是肌腱）细胞数量少、每个细胞的RNA含量低且基质成分高，导致其分析难度较大，因而进展滞后。近期最重要的单细胞技术之一，是实现肌腱中基因表达水平的空间分析。这类RNA空间分析技术在肌腱研究中具有特别重要的意义，可用于定位新发现或未知的细胞亚群、验证单细胞RNA测序结果，并为单细胞RNA测序数据提供组织学背景信息。这些新方法将能够在单细胞水平上以极高的灵敏度分析细胞内的RNA，并检测单分子RNA靶标，从而有助于在分子层面深入表征肌腱，推动肌腱相关研究的发展。
在本方法学论文中，我们将重点介绍利用新型技术在组织学切片上分析空间基因表达水平的现有方法 原位 用于在单细胞水平上检测完整细胞内靶标RNA的杂交分析方法。首先，我们将重点介绍如何针对不同可用的检测方法制备肌腱组织，以及如何在无背景噪声干扰的情况下，实现高灵敏度和高特异性的靶标信号扩增。随后，本文将描述特定的通透化方法、不同的探针设计以及当前可用的信号放大策略。这些独特的单细胞分辨率下分析不同基因转录水平的方法，将有助于鉴定和表征多种动物模型及人类肌腱组织中年轻与衰老群体的肌腱细胞。该方法还可用于分析其他富含基质的组织（如骨骼、软骨和韧带）中的基因表达水平。
引言
肌腱是连接肌肉与骨骼并实现力传递的结缔组织1。在发育过程中，轴向肌腱细胞来源于体节生骨节内的间充质细胞2；四肢肌腱来源于侧板中胚层；颅部肌腱则起源于颅神经嵴细胞系3,4。肌腱的特征可通过表达转录因子 scleraxis 来识别5，尽管还有多个标志物在肌腱发育中发挥关键作用，包括tenomodulin、mohawk以及early growth response 1/26,7,8,9。
尽管目前已知的肌腱标志物较少，但总体而言，对肌腱进行更深入的表征仍然具有挑战性，因为肌腱包含的细胞跨越一系列生物力学特性的梯度。从肌腱-肌肉连接处、肌腱中段到更为钙化的附着点，肌腱细胞所处的细胞外基质在抗张性能上各不相同。由于肌腱必须承受软组织与硬组织之间力学强度差异所施加的张应力，因此肌腱内细胞的空间组织对其功能尤为重要。然而，目前对这些肌腱亚群细胞的了解仍然有限。
许多高分辨率的空间转录组学工具可用于解析细胞亚群，包括但不限于单细胞RNA测序（single-cell RNA Seq）或原位杂交（in situ hybridization）。然而，尽管这些空间分析技术有助于在显微切割或切片后揭示组织中的RNA表达分布，但在肌腱组织上实施这些方法时仍面临挑战。肌腱是富含基质的组织，按干重计其成分中近86%为胶原蛋白10，这使得从中提取细胞进行测序十分困难。由于从基质中分离细胞存在技术难题、肌腱本身细胞含量低11，以及RNA总量相对较少，肌腱成为一种难以分析的组织。
本文介绍了一种优化新型 原位 通过提供组织制备、通透化处理及探针设计方法，将杂交检测技术应用于肌腱研究。结合现有的测序技术，该方法可提高检测的灵敏度与特异性，有助于研究人员在发育中、成体或损伤的肌腱中实现肌腱亚群的空间表征。
方案
所有动物实验均按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及AAALAC指南进行。实验在马萨诸塞州总医院经批准的协议号#2013N000062下开展。本研究中使用了C57BL/6J小鼠（5周龄和P0阶段）。有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。
1. 样品制备与固定
- 将小鼠置于 CO2 麻醉室中实施安乐死，随后以颈椎脱位作为辅助安乐死方法。然后使用剪刀沿髋关节处剪下小鼠后肢12。将小鼠后肢放入闪烁计数瓶中，加入足量 4% 多聚甲醛（PFA）溶液完全浸没样本，在 4 °C 下固定 24 小时。
注意：除 4% PFA 外，也可使用 10% 福尔马林进行固定。固定完成后，样本可保存于磷酸盐缓冲液（PBS）中，待后续处理。通过整体固定后肢，可维持肌腱张力，从而便于对附着点（enthesis）、肌腱中段或肌腱-肌肉连接处（myotendinous junction）进行观察分析。 - 从闪烁计数瓶中移除 PFA 后，加入足量 1× PBS 浸洗样本，每次 10 分钟，共洗 3 次。随后将后肢样本浸入 0.5 M EDTA 溶液中，于 4 °C 条件下震荡孵育 1–2 周，每隔 2–3 天更换新鲜 EDTA 溶液。
- 移除 EDTA 后，用 1× PBS 浸洗样本，每次 10 分钟，共洗 3 次；随后将样本在 70% 乙醇（EtOH）中脱水，并按所需方向包埋于石蜡中。采用常规石蜡包埋组织切片（FFPE）技术，将组织切成 3 µm 厚度，并将切片转移至经处理的带电荷载玻片上（参见材料表）13。
注意：切片可在 4 °C 条件下储存，待后续步骤使用。 - 脱蜡
- 将载玻片置于 60 °C 电热板上烘烤 1 小时，随后使其自然冷却至室温（RT）。为去除载玻片上的石蜡，将载玻片置于染色架上，浸入盛有二甲苯的染色缸中，每次 5 分钟，共重复 3 次，每次使用新鲜二甲苯。
警告：二甲苯具有危害性，请谨慎操作。 - 为使切片复水，将载玻片依次浸入以下溶液中，每步洗涤 5 分钟，均在室温（RT）下进行：100% 乙醇（EtOH）洗 2 次，75% 乙醇（以 dH2O 稀释）洗 1 次，50% 乙醇（以 PBS 稀释）洗 1 次，25% 乙醇（以 PBS 稀释）洗 1 次，PBS 洗 2 次。
注意：所有复水步骤均将载玻片置于染色架上，并将不同浓度乙醇溶液置于染色缸中进行。
- 将载玻片置于 60 °C 电热板上烘烤 1 小时，随后使其自然冷却至室温（RT）。为去除载玻片上的石蜡，将载玻片置于染色架上，浸入盛有二甲苯的染色缸中，每次 5 分钟，共重复 3 次，每次使用新鲜二甲苯。
2. RNAscope（商业化原位杂交）方案14 的改进
- 配制溶液和探针
- 通过混合 pH 8 的 25 mM Tris-HCl、10 mM EDTA 和 50 mM 葡萄糖，制备用于切片样本预处理的 TEG 溶液。配制足够所有待处理样本使用的体积或过量制备；过滤除菌后室温保存；使用前充分混匀。
- 为所有洗涤步骤准备足量的 1× 洗涤缓冲液（见材料表），并于室温保存。
- 在 40 °C 水浴或培养箱中将目标探针预热 10 分钟，然后根据原位杂交（ISH）方案14准备探针。
- 样本预处理
- 不使用推荐的预处理溶液，而是将载玻片浸入含有 TEG 缓冲液的染色缸中，在 60 °C 下孵育 4 小时。
注意：如果组织特别致密，或目标 RNA 结合基序的抗原修复较困难，TEG 缓冲液孵育时间可延长至最多 6 小时。在此处可设置一个暂停点，将载玻片干燥后于 4 °C 冰箱中过夜保存。 - 从缓冲液中取出样本并使其干燥。然后用疏水屏障笔在样本周围画圈，将其浸入另一含有蛋白酶 IV 的染色缸中，并在 40 °C 烤箱中孵育 45 分钟。
注意：我们推荐对成年小鼠使用蛋白酶 IV。若使用较年幼的小鼠（如 P0），建议使用较温和的酶（如蛋白酶 III）孵育 30 分钟。针对不同年龄样本进行问题排查时，应观察肌腱的完整性并检查是否发生降解。若组织出现解离或降解现象，应缩短孵育时间或更换所用蛋白酶。 - 再次用 TEG 缓冲液清洗样本 30 分钟，然后根据原位杂交（ISH）方案14进行探针杂交。
- 在样本上加入 50–100 µL 封片试剂，盖上盖玻片以用于显微镜观察。成像时使用高倍镜（40 倍物镜或更高）观察信号。
- 不使用推荐的预处理溶液，而是将载玻片浸入含有 TEG 缓冲液的染色缸中，在 60 °C 下孵育 4 小时。
3. HCR ISH 方案15 适配
- 后固定
- 配制4% PFA（溶于PBS）、PBT溶液（含0.1% Tween-20的PBS）以及溶于PBS的蛋白酶K（储存浓度为10 mg/mL，工作浓度为5 µg/mL）。
- 首先进行第一次固定后步骤，将载玻片浸入盛有4% PFA的染色缸中5分钟；然后移除4% PFA溶液并保存，以备后续步骤使用。用PBT溶液冲洗载玻片2次，每次5分钟，随后移除PBT溶液。将载玻片放入盛有蛋白酶K溶液（5 µg/mL）的染色缸中孵育5分钟，再用PBT溶液冲洗2次，每次5分钟。
- 开始第二步固定后处理，将切片浸入4% PFA中5分钟。
注意：此为步骤 3.1.2 中保存的相同 4% PFA。 - 将载玻片在PBT溶液中清洗3次，每次5分钟。
注意：所有后固定步骤均需将载玻片置于载玻片架上，并在盛有相应溶液的染色缸中进行。
- 乙酰化
- 配制乙酰化溶液，包含 625 µL 乙酸酐、3.3 mL 1 M 三乙醇胺（TEA）缓冲液和 246 mL 去离子水2O. 确保充分混匀，并在配制后立即使用。
- 将载玻片置于乙酰化溶液中10分钟，然后用PBT溶液冲洗3次，每次5分钟。用ddH₂O冲洗载玻片。2O，并让其风干30分钟。然后，使用疏水屏障笔在样品周围画圈。
注意：所有乙酰化步骤均需将载玻片置于载玻片架上，并在含有相应溶液的染色缸中进行
- 杂交
- 将杂交缓冲液预热至 37 °C，并将湿盒预热至 37 °C。
注意：缓冲液中含有甲酰胺，属于危险物质。如果载玻片不够干燥，需用实验室擦拭纸轻轻吸去边缘多余的 dH₂O2O. - 将每种探针混合物各0.4 pmol加入100 µL杂交缓冲液中，配制探针溶液。
注意：若使用 dHCR 成像，需采用较高浓度的探针以提高探针杂交效率。 - 通过将3 M NaCl（701.1 g NaCl定容至4 L）与0.3 M Na3CH6H5O7•2H2O（352.8 g），然后通过加入 HCl 或 10 N NaOH 将最终 pH 值调节至 7。加入足够的 H2O 加至 4 L。通过将 20x SSC 稀释至 5x，并加入足够量的 10% Tween 20，使其终浓度为总体积的 0.1%，制备 5x SSCT。
- 加入200 µL杂交缓冲液至样品中，将载玻片置于湿盒内，孵育10分钟。移除杂交液，用实验室擦拭纸轻拭载玻片边缘以吸除多余的缓冲液。
- 在样本上加入100 µL已制备的探针溶液，并盖上盖玻片。将样本置于含有5x SSC和50%甲酰胺溶液湿润的孵育盒中，37 °C条件下孵育过夜或约12–16小时。
注意：由于孵育过夜，加盖盖玻片是为了尽量减少蒸发。 - 将一份5x SSCT溶液置于37 °C水浴中，另一份置于室温下。根据样本数量及下一步洗涤次数，预估所需这两份溶液的体积。
- 将杂交缓冲液预热至 37 °C，并将湿盒预热至 37 °C。
- 洗涤
- 使用预先预热的5x SSCT溶液，配制75%洗涤缓冲液/25% 5x SSCT、50%洗涤缓冲液/50% 5x SSCT和25%洗涤缓冲液/75% 5x SSCT溶液。
- 为去除多余的探针，将载玻片依次浸入以下溶液中，在37 °C下每次洗涤15分钟：75%洗涤缓冲液/25% 5x SSCT、50%洗涤缓冲液/50% 5x SSCT和25%洗涤缓冲液/75% 5x SSCT。让盖玻片自然从样品上脱落。
- 将载玻片在100% 5x SSCT中孵育，每次15分钟，重复两次，然后在5x SSCT中室温浸泡5分钟。
注意：洗涤步骤可在载玻片置于染色缸中的载玻片架上进行，并使用含有相应溶液的染色缸，也可将溶液以滴加方式完成。
- 扩增
- 通过快速冷却法准备6 pmol的发夹结构h1和6 pmol的发夹结构h2：取2 µL浓度为3 µM的储备液，95 °C加热90 s后冷却至室温。此过程中需避光保护发夹结构。
注意：HCR 发夹探针 h1 和 h2 提供于发夹储存缓冲液中，可直接进行瞬时冷却。请将 h1 和 h2 发夹探针分别置于不同的离心管中进行瞬时冷却。 - 用实验室擦拭纸轻轻吸干载玻片边缘以干燥。随后，在样本上加入200 µL扩增缓冲液，置于湿化 chamber 中，室温孵育30分钟。在室温下，将预冷的h1发夹和预冷的h2发夹加入100 µL扩增缓冲液中，配制发夹混合液。
- 移除扩增缓冲液，用实验室擦拭纸轻拭载玻片边缘以吸去多余液体。加入100 µL预先配制的发夹结构混合液，并在样本上覆盖一层Parafilm。将载玻片置于避光、湿润的容器中，室温孵育至少4小时或过夜。
- 为去除多余的发夹结构，将载玻片浸入盛有5x SSCT的染色缸中，在室温下孵育30分钟。更换新鲜的5x SSCT重复洗涤30分钟，再进行第三次洗涤5分钟。
- 用实验室擦拭纸轻轻吸干载玻片边缘的液体，然后在样本上滴加50–100 µL封片试剂。将盖玻片覆盖在样本上，用于显微镜观察。成像时，使用高倍镜（40倍物镜或更高）观察信号。
- 通过快速冷却法准备6 pmol的发夹结构h1和6 pmol的发夹结构h2：取2 µL浓度为3 µM的储备液，95 °C加热90 s后冷却至室温。此过程中需避光保护发夹结构。
结果
图1：使用RNAScope检测成年小鼠跟腱中的Poly A RNA表达。 使用商业化原位杂交（ISH）试剂盒成功标记小鼠跟腱中Poly A RNA的代表性图像（左图）。与DAPI共定位证实了探针的特异性（中图和右图），可用于排除背景噪声干扰。图像使用Leica SPE共聚焦显微镜在63倍放大下采集。比例尺 = 20 μm。缩写：ISH = 原位杂交；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击此处查看该图的高清版本。
图 2：使用 RNAScope 检测 P0 小鼠跟腱中的 Poly A RNA 表达。 使用商业化原位杂交（ISH）检测方法，在 P0 小鼠跟骨中成功进行 Poly A 标记的代表性图像（左图）。与 DAPI 共定位且背景噪声极低，证实了探针的特异性（中图和右图）。肌腱区域以虚线标出。图像使用 ZEISS Axio Imager 显微镜拍摄。比例尺 = 20 μm。缩写：ISH = in situ hybridization；DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole。 请点击此处查看该图的放大版本。
本方案将帮助研究人员利用 commercially available 的 原位 杂交工具，并将其优化用于成年肌腱组织。这最终使我们能够在具有空间信息的单细胞分辨率下分析不同基因的转录水平。一次成功的 ISH 检测应针对目标分子具有高特异性，并且背景噪声极低。该方案可用于成年和新生小鼠跟腱组织（图 1、图 2、图 3 和 图 4）。Poly A 可作为对照，通过定性确认样本中存在预期水平的 RNA，从而帮助验证检测是否成功。
然而，ISH 实验方案可能存在一些需要排查的问题。例如， 图5 显示肌腱中Poly A探针杂交不足，导致肌腱多个区域无Poly A信号，尽管DAPI复染表明细胞确实存在。此外，若在HCR的后固定步骤中因蛋白酶K孵育时间过长而导致组织过度消化（图6）或在RNAScope预处理步骤中通过延长蛋白酶IV孵育时间，则可能导致组织形态被破坏。最后， 图7 未添加RNA杂交探针但使用了核复染时，阴性对照的示例结果。
图 3：利用 HCR 检测成年小鼠跟腱中 scleraxis RNA 的表达。 使用杂交链式反应（HCR）在成年小鼠跟腱中成功标记 scleraxis RNA 的代表性图像（左图）。DAPI 用作细胞核复染剂（中图）。与 DAPI 的共定位证实了探针的特异性（右图）。图像使用 Leica SPE 共聚焦显微镜在 63 倍放大下采集。标尺 = 20 μm。缩写：HCR = hybridization chain reaction；DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：利用 HCR 检测出生后第 0 天小鼠跟腱中的 Poly A RNA 表达。 使用杂交链式反应（HCR）对出生后第 0 天（P0）小鼠跟腱中 Poly A RNA 进行标记的代表性图像。DAPI 和 Poly A 探针均在跟骨处标记骨组织和跟腱（分别为左图和右图）。两种探针在两种组织中均显示出共定位，且背景噪声极低，表明 HCR 实验成功（右图）。图像使用 ZEISS Axio Imager 显微镜拍摄。比例尺 = 20 μm。缩写：HCR = hybridization chain reaction；DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：在 P0 小鼠跟腱中使用 Poly A RNA 探针进行 HCR 实验失败。 使用 HCR 方法在 P0 小鼠跟腱中进行 Poly A RNA 标记失败的代表性图像。DAPI 对跟骨的骨骼和跟腱中的细胞核进行了标记（左图），但 Poly A HCR 探针未能完全渗透至整个跟腱组织中（中图和右图，见白色箭头）。然而，Poly A 成功标记了大部分骨骼组织。图像使用 ZEISS Axio Imager 显微镜拍摄。比例尺 = 20 μm。缩写：HCR = hybridization chain reaction；DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：过度消化的成年小鼠跟腱中HCR Poly-A标记的示例。 使用杂交链式反应（HCR）对过度消化的成年小鼠跟腱进行Poly A RNA标记的代表性图像。在此样本中，Poly A与DAPI信号正确定位共定位（右侧面板），但跟腱典型的单轴向形态结构遭到破坏（白色箭头）。图像使用ZEISS Axio Imager显微镜拍摄。比例尺 = 20 μm。缩写：HCR = hybridization chain reaction；DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：成年小鼠跟腱中Poly A RNAscope的阴性对照。 该图为Poly A RNA标记的阴性对照代表性图像，其中未添加Poly A探针，但加入了扩增探针。如预期所示，DAPI成功标记了细胞核（左图），但Poly A未检测到信号（中图）。图像使用ZEISS Axio Imager显微镜拍摄。比例尺 = 20 μm。缩写：DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
在本文中，我们介绍了对现有原位杂交（ISH）工具进行的改进，使其能够在肌腱组织中以高特异性和高灵敏度进行应用。由于肌腱是一种基质高度密集的组织，通常需要对实验方案进行调整，以实现探针充分渗透并达到理想的特异性。这些针对肌腱组织的特定通透化方法和信号放大策略，对于提升本文所述ISH方案的有效性至关重要。若缺少这些步骤，探针将难以与肌腱中的RNA发生强效且特异的结合。
在RNAscope14中，必须对所使用的预处理缓冲液进行调整，以使该方案在肌腱组织中更有效地发挥作用。具体而言，使用TEG缓冲液作为预处理步骤可改善探针对靶RNA的可及性。除了TEG缓冲液外，蛋白酶IV处理时间也需超过标准时长，延长至45分钟至1小时。在HCR15中，洗涤步骤的时间已延长，并在RNA-FISH检测开始前增加了后固定步骤。后固定步骤包括在4%多聚甲醛（PFA）、PBT、蛋白酶K和乙酰化溶液中依次进行孵育。总体而言，这些改进有助于提高探针对肌腱RNA的可及性，并降低背景噪声16,17。然而，尽管这些方案改进通过调整预处理溶液和增加后固定步骤来提高探针在原位杂交（ISH）中的特异性和灵敏度，但探针设计本身仍存在一定的局限性。
为了改善探针在RNA可及性方面面临的挑战，可对原位杂交（ISH）实验进行额外优化。如果将采用dHCR成像技术——一种用于mRNA数字绝对定量的方法15 - ，建议提高探针浓度以增强探针杂交效率。此外，在扩增步骤中采用较短的孵育时间可确保单分子信号点保持在衍射极限范围内。较长的孵育时间可能导致成像时肌肉组织产生更高的自发荧光。如果所选肌腱比成年小鼠跟腱更致密和/或体积更大，建议延长4% PFA固定步骤的持续时间。
上述对商业化原位杂交（ISH）方案的修改对于成年小鼠组织或需要更长预处理或固定步骤的致密组织最为有益。尽管对现有方案的这些修改有助于提高探针对RNA的可及性，但某些探针在老年小鼠中可能需要更高的浓度或更长的孵育时间，相较于年轻小鼠或新生小鼠，这取决于目标RNA序列在不同年龄组中对探针的可及性。关于RNAscope预处理步骤中蛋白酶的使用，我们建议成年小鼠肌腱使用蛋白酶IV处理45分钟，而新生小鼠肌腱则使用蛋白酶III处理30分钟。为评估实验的有效性、验证对方案的任何调整，或总体比较不同样本间的表达情况，可采用多种对照。例如，可将Poly A探针与用于评估实验特异性的核复染剂进行比较，以评估样本中RNA的分布或降解情况，并确认RNA对探针的可及性。类似地，看家基因的探针也可作为对照以评估RNA的可及性。具有已知表达模式的阳性对照有助于确认实验特异性，而阴性对照则有助于评估潜在的非特异性结合。
总体而言，随着多种技术的不断发展以更好地理解组织的空间基因表达谱，人们需要更多方法来验证这些结果。特别是单细胞RNA测序等检测技术正逐渐成为评估基因表达的常用工具，但其结果需要在更高分辨率下进行空间层面的分析。为此，原位杂交（ISH）检测可用于更深入地理解并验证由定量性更强的检测方法所产生的转录组数据的空间背景。在肌腱研究中，结合使用此类检测方法将有助于通过空间定位特异性标记物，进一步表征位于骨-肌腱连接处、肌腱中段以及肌腱-肌肉连接处的不同细胞群体。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢Jenna Galloway以及Galloway实验室成员在这些实验方案的开发与问题排查过程中所提供的支持与鼓励。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 M 三乙醇胺缓冲液 | |||
| 10% 甲醛溶液 | |||
| 10% Tween-20 | |||
| 20x 柠檬酸钠盐水缓冲液 | |||
| 4% PFA | |||
| ACD RNAscope 荧光多重荧光试剂盒 V2 | ACD | 323100 | |
| 乙酸酐 | |||
| Axio Imager 显微镜 | ZEISS | ||
| C57BL/J6 小鼠 | JAX 编号：000664 | ||
| 盖玻片 | Fisher | 12-541-042 | |
| ddH2O | |||
| ETDA | Thermofisher | AM9262 | |
| EtOH | |||
| 葡萄糖 | VWR Chemicals BDH | BDH9230-500G | |
| HCR RNA-FISH 试剂套装 | Molecular Instruments Inc. | ||
| HybEZ II 杂交系统 | ACD | ||
| Immedge 阻隔笔 | Vector Laboratories | H4000 | |
| Leica SPE 共聚焦显微镜 | Leica | ||
| Parafilm 封口膜 | Fisher | ||
| 磷酸盐缓冲液 (PBS, 1x) | Invitrogen | AM9625 | 将 10x PBS 用 milli-Q 水稀释得到 1x 溶液 |
| 蛋白酶 IV | |||
| 蛋白酶 K | Roche | 3115836001 | |
| RNAscope H2O2 和蛋白酶试剂 | ACD | PN 322381 | 包含在 ACD RNAscope 荧光多重荧光试剂盒 V3 中 |
| RNAscope 多重荧光检测试剂盒 | ACD | PN 323110 | 包含在 ACD RNAscope 荧光多重荧光试剂盒 V2 中 |
| RNAscope 靶标修复试剂 | ACD | 322000 | 包含在 ACD RNAscope 荧光多重荧光试剂盒 V4 中 |
| RNAscope 洗涤缓冲液 | ACD | PN 310091 | 包含在 ACD RNAscope 荧光多重荧光试剂盒 V5 中 |
| RNAscope 探针稀释液 | ACD | 300041 | |
| 载玻片架 | StatLab | 4465A | |
| 带盖染色缸 | StatLab | LWS20WH | |
| Superfrost Plus 显微载玻片 | Fisher | 1255015 | 经处理的带电载玻片 |
| Tris-HCl | |||
| 二甲苯 | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
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