双光子显微镜在肌腱研究中的应用

摘要

本文概述了使用双光子显微镜对肌腱进行制备、设置和成像的过程。此外，还介绍了利用二次谐波生成（SHG）技术分析胶原原纤维排列以及构建肌腱三维结构的方法。该方法在表征肌腱细胞及其在损伤和发育过程中的细胞外基质（ECM）方面具有重要价值。

摘要

双光子显微镜已成为评估深层组织细胞以及表征多种生物系统中细胞外基质（ECM）排列结构的有力工具。该技术依赖于非线性光-物质相互作用，以检测两种不同的信号：二次谐波生成（SHG）散射信号，可用于可视化胶原纤维及其取向；以及近红外激发信号，用于成像紫外激发的自发荧光。

由于纤维状I型胶原具有非中心对称的晶体结构，二次谐波成像（SHG）在可视化胶原纤维方面表现出显著优势。鉴于肌腱是细胞数量较少但富含基质的组织，其高含量的胶原使其成为利用双光子显微镜进行分析的理想样本。因此，双光子显微镜为分析和表征肌腱中的胶原异常提供了有力手段。该技术可广泛应用于研究肌腱的发育、损伤、修复及老化过程，能够在不同条件下利用双光子显微镜工具对肌腱细胞及其与细胞外基质（ECM）的相互作用进行全面表征。本实验方案概述了双光子显微镜在肌腱生物学中的应用，并介绍了一种经过优化的方法，以实现对发育过程中及损伤后肌腱细胞的有效成像与表征。该方法允许利用薄的显微切片，构建出肌腱内细胞外基质及其相互作用细胞的完整图像。尤为突出的是，本文展示了一种在动物模型中利用双光子显微镜生成三维图像的技术。

引言

为了正常发挥功能并将肌肉产生的力传递至骨骼¹，肌腱依赖于胶原纤维之间的分子间和分子内化学键。胶原纤维复杂的自组装、交联及有序排列，形成了高度有序的基质结构，赋予肌腱组织生物力学强度和柔韧性^2,3,4。尽管其他细胞外基质（ECM）蛋白也参与维持肌腱中纤维网络的稳定性⁵，但肌腱干重的约86%为胶原蛋白⁶，其中I型胶原（collagen I）占总胶原含量的96%^7,8。因此，胶原结构成为反映肌腱正常健康与功能的关键指标。

用于肌腱的一些临床成像方式包括磁共振成像（MRI）和/或超声。虽然超声技术能够提供肌腱束状结构的图像，并揭示组织中部分纤维结构⁹，但其分辨率并不理想，难以进行定量分析。MRI的空间分辨率优于超声成像，但仍存在局限性。然而，这些方法在组织穿透深度方面也存在成像潜力的限制。在更微观的尺度上，小角和广角光散射以及共聚焦显微镜可用于评估胶原原纤维的结构及任何潜在的异常情况。

相比之下，二次谐波产生（SHG）显微技术与其他成像方法不同，能够捕捉胶原原纤维的外层结构。肌腱中的Ⅰ型胶原原纤维在细胞外基质（ECM）中呈单轴平行排列，且具有非中心对称的特性^4,10。这些特性可用于多光子显微镜成像，其成像深度可达共聚焦成像的2至3倍，从而获得更清晰的图像¹¹。这也使我们能够获得更高质量的肌腱光学切片。当光照射到目标样本时，会产生SHG信号，该光散射信号可被检测捕获。在肌腱中，这一过程可生成胶原结构及其排列方向的图像，从而允许我们评估肌腱病、损伤等可能引起的形态学和病理学变化。

由于胶原蛋白构成了肌腱干重的大部分，并对肌腱功能具有重要贡献^6,12，胶原蛋白结构的破坏可能影响肌腱的生物力学特性。因此，分析其结构有助于我们更深入理解损伤的影响程度与严重性，并为评估修复效果提供量化指标。本文综述了一种利用多光子和二次谐波产生（SHG）显微技术的方法，用于分析发育过程和损伤如何影响I型胶原原纤维的结构与排列，并在动物模型中生成肌腱细胞外基质（ECM）的三维图像。因此，我们用于成像肌腱的方法可帮助研究人员在发育过程或损伤后对肌腱细胞及其细胞外基质进行表征。

方案

所有动物实验均按照麻省总医院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）（方案编号 #2013N0000062）以及AAALAC指南进行。本研究使用了Scx-GFP背景下的BHLHE40基因敲除或杂合雌性小鼠，年龄为30天。实验动物购自商业来源（见材料表）。

1. 组织制备与固定

1. 准备组织时，将小鼠置于 CO₂ 麻醉室中实施安乐死（遵循机构批准的方案），随后进行颈椎脱位。
2. 为减少可能粘附于组织样本上的毛发，用 70% 乙醇喷洒小鼠直至毛发完全浸湿。剥离后肢皮肤，然后使用剪刀在髋关节处剪切，取下两只后肢。
3. 将两只后肢放入一个 20 mL 闪烁瓶中，并加入 4% 多聚甲醛（PFA）浸没组织，确保液体充满瓶内。将闪烁瓶置于 4 °C 条件下，振荡过夜。
4. 在室温（RT）下，用 1× PBS 振荡洗涤后肢 10 分钟，重复洗涤共 3 次。随后将后肢浸入 0.5 M EDTA（pH 8.0）中，在 4 °C 条件下振荡处理最多 2 周，每 2–3 天更换新鲜 EDTA 溶液。
5. 再次于室温下用 1× PBS 振荡洗涤后肢 10 分钟，重复洗涤共 3 次。
6. 将后肢浸入新鲜的 1× PBS 中，于 4 °C 保存，直至用于成像实验。

2. 肌腱的解剖及成像组织制备

1. 用镊子夹住足部，将弹簧剪刀片的一端（见材料表）滑至跟腱下方，并确保尽可能靠近肌腱连接处进行切割。
2. 用镊子夹住已切断的肌腱连接端，使用弹簧剪刀尽可能贴近骨骼将跟腱完全切除。
   注意：如有需要，在第一次切割时可用镊子辅助将跟腱与其他后肢组织分开。操作过程中应避免压碎或损伤组织，以免影响成像时的胶原纤维排列。
3. 为实现组织通透并进行细胞核复染，将分离出的跟腱浸入含0.1% Draq5的PBT溶液（1% Triton-X 的PBS溶液）中（Draq5储存液浓度为5 mM，见材料表）。将跟腱置于2 mL微量离心管中，在1 mL PBT中加入1 µL Draq5，于室温摇床上孵育过夜。由于Draq5对光敏感，需用铝箔包裹微量离心管，并避免样品暴露于光照下。
4. 成像前，移除Draq5溶液并替换为dPBS。操作过程中仍需避免光照。
   警告：Draq5属于第三类毒性物质，根据OSHA危险信息通报标准被视为有害物质。应避免直接接触，并将其弃置于贴有标签的废液容器中。
5. 使用内径为6 mm的活检打孔器，从凝胶海绵（见材料表）上切下一小块，放入60 × 15 mm的小型培养皿中。向培养皿中加入ddH₂O，使凝胶海绵充分膨胀。
6. 将分离的跟腱放置于膨胀后的凝胶海绵上。使用粘附在垫圈上的盖玻片，小心地将垫圈压在跟腱上方，使盖玻片与组织接触。为避免成像时产生问题，应确保样品与盖玻片之间无气泡。如有需要，可向培养皿中加入更多ddH₂O，使液体覆盖样品及带盖玻片的垫圈。

3. 使用多光子显微镜进行成像

1. 使用FVMPE-RS多光子激光显微镜、可浸入水中的25倍物镜、HPDS-O红外脉冲激光器和红外脉冲激光器（参见材料表），通过EPI光路定位待成像的样本及感兴趣区域。找到样本后，将相机对准跟腱的肌腱结合部或附着点末端。
2. 将光路切换至LSH，将激光器2的红外激光设置调整为840 nm，并进行主动对准。调节高压（HV）强度以清晰观察组织和二次谐波生成（SHG）信号，但不得超过20%。不要调节增益，偏移量保持为0。
3. 随后，设置z轴堆栈参数以采集样本图像。采用1024 × 1024的扫描尺寸，步长设为0.4微米。z轴堆栈平均约包含150层切片，从外部鞘膜开始向肌腱中心推进，直至SHG信号不再清晰，从而生成矢状面光学切片¹³。
4. 将激光功率调整为Bright Z模式，以实现信号检测的标准化。在确定z轴堆栈的起始和终止参数后，将激光强度在成像开始时设为4，成像结束时设为6。这有助于在显微镜深入组织成像时维持SHG信号的一致性。
5. 生成z轴堆栈后，在ImageJ/FIJI软件中进一步处理，创建横向取向的光学切片动态图像。具体操作为：打开ImageJ/FIJI软件¹⁴，点击图像 > 堆栈 > 重新切片。该操作可呈现跟腱的横截面视图，揭示肌腱细胞的星状形态及其在胶原基质中的排列方向。

结果

该方案适用于在损伤后、发育过程中或突变条件下对肌腱细胞及其细胞外基质（ECM）进行表征。通过精细的解剖和样本制备，可沿组织的矢状面生成z轴堆栈视频（视频 1 和 视频 2）。利用ImageJ/FIJI对图像进行处理和重新切片，可获得跟腱的横截面视图（视频 3 和 视频 4）。该方法揭示了腱细胞的星状形态，并使我们能够观察其在致密胶原基质中的独特结构。

利用多光子显微镜，并基于纤维状I型胶原的非中心对称晶体特性，获得了同时包含肌腱细胞及其基质的高分辨率光学切片图像。这些光学切片分别来自BHLHE40 +/-; Scx-GFP和BHLHE40 -/-; Scx-GFP小鼠的z轴堆栈图像（图1A、B）。切片取自通过双光子成像生成的原始矢状面z轴堆栈，以及使用ImageJ/FIJI重新切片生成的z轴堆栈。此外，我们还可利用该成像方法分析两种小鼠之间在胶原排列、细胞形态等方面的潜在差异。

图1：BHLHE40 +/-; Scx-GFP 和 BHLHE40 -/-; Scx-GFP 小鼠肌腱的光学切片。 使用多光子显微镜采集Z轴层扫图像。(A) 来自Z轴层扫的光学切片显示 BHLHE40 +/-; Scx-GFP（P30，雌性，14.68 g）中的SHG信号以及GFP+/Draq5+细胞；(B) BHLHE40 -/-; Scx-GFP（P30，雌性，12.16 g）。矢状切面包含SHG信号，而横切面则无。样品经Draq5复染。SHG信号可捕捉组织中的胶原基质。比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

视频 1：BHLHE40 +/-; Scx-GFP 小鼠肌腱矢状面的 Z 轴层扫视频。 使用双光子显微镜采集 Z 轴层扫图像。该视频显示了跟腱的矢状面结构。样品用 Draq5 进行复染。SHG 信号捕捉组织中的胶原基质。请点击此处下载该视频。

视频 2：BHLHE40 -/-; Scx-GFP 小鼠跟腱矢状面的 Z 轴层扫视频。 使用双光子显微镜采集 Z 轴层扫图像。该视频显示了 BHLHE40 基因敲除小鼠跟腱的矢状面结构。样品用 Draq5 进行复染。SHG 信号显示组织中的胶原基质。请点击此处下载该视频。

视频 3：BHLHE40 +/-; Scx-GFP 小鼠肌腱横断面的 Z 轴层扫视频。 使用双光子显微镜采集 Z 轴层扫图像。该视频显示了跟腱的横断面视图。样品用 Draq5 进行复染。SHG 信号捕捉组织中的胶原基质。请点击此处下载该视频。

视频 4：BHLHE40 -/-; Scx-GFP 小鼠跟腱横断面的 Z 轴层扫视频。 使用双光子显微镜采集 Z 轴层扫图像。该视频显示了 BHLHE40 基因敲除小鼠跟腱的横断面结构。样品用 Draq5 进行复染。SHG 信号显示组织中的胶原基质。请点击此处下载该视频。

讨论

本文介绍了一种利用肌腱细胞外基质（ECM）的非中心对称晶体特性来制备、解剖和成像小鼠跟腱的方法。组织制备的关键步骤包括使用复染剂进行通透处理，以及在成像过程中确保组织在培养皿中的正确放置。可使用Hoechst 33258（1:100,000稀释）替代Draq5¹³，但Draq5因其高通透性、光稳定性和较低的光漂白程度而更受青睐。正确放置组织至关重要，以避免盖玻片与跟腱之间产生气泡，因为组织方向不当会影响最终成像结果。

与其他显微技术相比，二次谐波生成（SHG）显微技术能够清晰捕捉基质中的胶原原纤维和肌腱细胞¹⁰。结合复染技术，该数据可用于分析发育过程、损伤或突变对肌腱结构的影响。生成肌腱细胞外基质（ECM）的三维图像，可实现光学切片在穿过肌腱时的逐层观察。尽管多光子技术具有更优的组织穿透能力，但在对整个跟腱进行成像时仍存在局限性，因此需要切片等辅助技术。然而，该方法能够以高清晰度生成约150个厚度为0.4微米的光学切片，避免了因物理切片对组织造成的扰动。

总之，通过多光子显微镜对肌腱细胞和细胞外基质进行成像，该方法为研究肌腱的发育、损伤、修复及老化过程提供了有价值的见解。利用多光子成像技术获取组织内完整的光学切片和z轴堆叠视频，有助于更深入地理解实验条件下肌腱形态的变化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9262
2 mL 微量离心管	USA Scientific	1620-2700
20 mL 闪烁瓶	Sigma-Aldrich	Z190527-1PAK
4% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	50-980-487	使用PFA安瓿配制4% PFA溶液
6 mm 活检打孔工具	Ted Pella Inc.	15111-60
60 × 15 mm 培养皿
Scx-GFP 背景下的 BHLHE40 基因敲除或杂合小鼠	The Jackson Laboratory	JAX ID #029732	MGI ID #3717419
盖玻片	Fisher	12-544-F	可使用任何能够覆盖M20垫圈面积的盖玻片
dPBS	Gibco	14190144
Draq5	ABCAM	ab108410
精细剪刀，21 mm 刃口	Fine Science Tools	14060-10
FVMPE-RS 多光子激光扫描显微镜	Olympus
明胶海绵（无菌），规格 50	Pfizer	00009-0323-01
INSIGHT X3-OL 红外脉冲激光器	Olympus
MaiTai HPDS-O 红外脉冲激光器	Olympus
磷酸盐缓冲液（1x）	Invitrogen	AM9625	将10x PBS用milli-Q水稀释获得1x溶液
不锈钢M20平垫圈	McMaster-Carr
Triton X-100	MP Biomedicals	807426	将Triton X-100用dPBS稀释配制成1%溶液
Vannas弹簧剪刀，4 mm 刃口	Fine Science Tools	15018-10
XLPlan N 25X WMP 物镜