方法文章

利用人iPSC来源的神经元-星形胶质细胞共培养体系进行三维生物打印以用于筛选应用

DOI：

10.3791/65856

⸱

2023年9月29日

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1MSD Research Laboratories, London, UK, 2Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA

本文内容

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摘要

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本文介绍了一种利用诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元和星形胶质细胞进行三维生物打印共培养的实验方案。该共培养模型在96孔或384孔板中的水凝胶支架内构建，打印后细胞存活率高，7天内可见明显的神经突生长，并表达两种细胞类型的成熟标志物。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

要使细胞模型适用于药物筛选，该系统必须满足通量和均一性要求，同时具备高效的开发周期。然而，许多已发表的三维（3D）模型 并未满足这些标准，因此限制了其在早期药物发现应用中的实用性。三维（3D）生物打印是一种新兴技术，可用于开发3D模型，以加快开发速度、提高标准化程度并提升通量。本文介绍了一种用于构建人诱导多能干细胞（iPSC）来源的谷氨酸能神经元与星形胶质细胞三维生物打印共培养模型的实验方案。该共培养体系被包埋于含有生物活性肽、全长细胞外基质（ECM）蛋白且生理刚度为1.1 kPa的水凝胶基质中。该模型可快速建立于96孔板和384孔板格式中，打印后平均细胞存活率达72%。该模型中星形胶质细胞与神经元的比例为1:1.5，处于人脑生理范围之内。这些三维生物打印的细胞群体在培养7天内即表现出成熟神经细胞类型标志物的表达，并可见神经突和星形胶质细胞突起的生长。因此，该模型适用于细胞染料、免疫染色技术以及神经突延伸实验的分析。能够大规模制备此类具有生理代表性的模型，使其成为神经科学靶点中、高通量筛选实验的理想选择。

引言

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药物发现行业中对中枢神经系统（CNS）疾病的研究正在不断扩展1然而，许多常见的中枢神经系统疾病，如癫痫、精神分裂症和阿尔茨海默病，目前仍无治愈性治疗方法。2,3,4中枢神经系统疾病缺乏有效的治疗方法，至少在一定程度上可归因于缺乏准确的 体外 脑的模型5。这导致了当前基础研究与临床应用之间存在转化鸿沟 体外 模型和 体内 数据以及后续研究工作的瓶颈。

由于存在这种转化鸿沟，近年来新型三维细胞模型的开发显著增加，包括神经类器官、神经球以及基于支架的模型6。这些模型的三维结构有助于模拟神经微环境，包括生物力学应力、细胞间接触以及脑内细胞外基质（ECM）7。脑ECM是神经生理学中的一个动态组分，存在于多种神经细胞类型之间，包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞以及神经血管单元7。已有研究表明，脑ECM的模拟可影响神经元的形态及放电活动，许多复杂的脑三维模型已证实由神经细胞类型沉积ECM蛋白8,9,10,11。基于支架的模型由成熟的神经共培养物悬浮于多孔的合成或生物来源水凝胶基质中构成，该基质用以模拟脑ECM12。与类器官和球状体系统不同，基于支架的三维模型允许定制所含的ECM蛋白，并具备调节水凝胶刚度的优势，从而模拟生物力学应力13,14。

尽管绝大多数三维神经模型在模拟脑微环境方面表现出显著提升，但并非所有模型都适用于药物发现应用的实施15要将三维模型应用于工业流程，该系统必须满足筛选应用的通量要求，并具有相对较短的开发周期163D生物打印是一种新兴技术，有望快速构建基于三维支架的神经模型，具有开发周期短、通量高、精确控制水平更优等优势，同时可消除由人为误差引起的变异性。17本方案介绍了一种基于水凝胶支架的人诱导多能干细胞（iPSC）来源的谷氨酸能神经元与星形胶质细胞三维共培养模型。该水凝胶支架包含生理相关的生物活性肽段（RGD、IKVAV、YIGSR）以及细胞外基质（ECM）蛋白，并具有模拟体内环境的生物力学刚度。这些全长ECM蛋白包括在人类大脑皮层中 abundant 的全长层粘连蛋白-211（laminin-211）和透明质酸（hyaluronic acid），其刚度为1.1 kPa，与 体内 测量18该模型专为药物发现的实用性而设计，采用3D生物打印机在96孔或384孔板中构建，适用于结合细胞染料、抗体以及神经突生长检测，通过成像技术进行筛选分析。细胞在培养7天内即表现出神经细胞类型标志物的表达，并长出神经突和星形胶质细胞突起。因此，本方案将介绍建立一种可用于药物发现研究的高通量3D神经共培养模型的方法。

按需喷滴式生物打印、三维中枢神经系统支架、神经元、星形胶质细胞、生物活性肽、96孔板格式。
图1：用于三维生物打印共培养体系的方法示意图。 将人诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元和星形胶质细胞与激活剂及含有生物活性肽的生物墨水溶液混合，利用按需喷滴式生物打印技术，将其打印至水凝胶支架中，形成96孔或384孔板格式的三维共培养结构。 请点击此处查看该图的放大版本。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 3D 模型的生物打印

  1. 生成孔板图谱和打印文件
    1. 在模型生成之前，使用孔板图谱软件生成孔板图谱、实验方案和打印文件。打开孔板图谱软件，选择 在3D中培养细胞 选项。
    2. 从下拉菜单中的可用选项中选择要进行生物打印的模型类型；该模型已在 成像模型 和 HTP 模型格式中得到验证。对于96孔板选择 成像模型，对于384孔板选择 HTP 。
    3. 在 基质选择 窗口中，选择 Hydrogel Px02.53，其含有层粘连蛋白-211（Laminin-211）和透明质酸蛋白，并包含IKVAV、RGD和YIGSR肽段。
    4. 在弹出窗口中，输入细胞类型为 谷氨酸能神经元和星形胶质细胞，细胞密度为2000万个细胞/mL。
    5. 使用软件通过高亮显示屏幕上的孔位来设计所需的孔板图谱。在设计中至少包含一行 塑料表面的2D对照。塑料表面的2D对照 孔是指将细胞直接接种到孔中而不使用任何水凝胶支架；这些孔应按照步骤1.2进行包被。
    6. 确保窗口顶部列出的孔板模型已更改为计划使用的孔板型号（参见 材料表）。
    7. 使用下载按钮下载该孔板图谱的实验方案和打印文件，并将其保存至与生物打印机连接的计算机中。
  2. 塑料表面2D对照孔的包被
    1. 在打印前至少24小时，对2D对照模型的孔进行包被 ，以促进细胞黏附和生长。3D模型孔无需预先包被。除非另有说明，所有操作均应在生物安全柜中进行。孔板可在打印前最多7天完成包被和准备。
    2. 通过将2.5 mL的20x硼酸盐储备液与47.5 mL无菌dH2O混合，配制50 mL的1x硼酸盐缓冲液。
    3. 向50 mL的1x硼酸盐缓冲液中加入100 µL的50%（w/v）聚乙烯亚胺（PEI），制成0.1%（w/v）PEI溶液，并通过0.22 µm滤器进行无菌过滤。
    4. 根据步骤1.1生成的孔板图谱指示，向每个2D对照孔中加入0.1%（w/v）PEI溶液。若使用96孔板，则每孔加100 µL；若使用384孔板，则每孔加25 µL。
    5. 将孔板在37 °C孵育2小时，随后吸除0.1%（w/v）PEI溶液，并用PBS清洗孔内5次。让孔在生物安全柜中完全干燥。
    6. 将100 µL的1 mg/mL层粘连蛋白溶液稀释于5 mL神经基础培养基中。若使用96孔板，则向每个2D对照孔中加入100 µL；若使用384孔板，则每孔加25 µL。在37 °C孵育4小时。
    7. 若需储存孔板，孵育后保留层粘连蛋白溶液并置于4 °C保存。 使用前在37 °C预热1小时。
  3. 共培养模型的3D生物打印
    1. 使用生物打印机时始终维持无菌操作，在将手套、打印 cartridge 和培养孔板放入打印机前，用70%乙醇擦拭。除非另有说明，所有在生物打印机外的操作均应在生物安全柜中进行。
    2. 开启生物打印机的压缩机，并在生物打印机软件中点击 初始化 按钮以启动打印机。当打印机内气流启动后，用70%乙醇湿巾擦拭打印机内部表面。
    3. 在打印当天，执行引导式 每日启动绿灯检测 流程，以确保喷嘴状态符合本次打印要求（最低喷嘴状态为2A2B）。
    4. 从无菌包装中取出一个生物打印机 cartridge，在A仓加入20 mL无菌dH2O，在B1–4仓各加入6 mL经无菌过滤的70%乙醇。将 cartridge 插入生物打印机左侧的 cartridge 持架中，并将孔板盖放入专用的盖子持架中。
    5. 在软件主界面点击 绿灯检测 按钮，并在软件中确认 cartridge 已正确安装且盖子已被移除。启动绿灯检测流程。
    6. 当软件提示时，确认左右针头均无持续滴液现象。随后，当软件再次提示时，确认B7和B8仓中存在液体。
    7. 生物打印机完成自动引导的绿灯检测步骤后，插入一个未包被的无菌96孔平底孔板（与用于共培养生物打印的包被孔板分开），并在软件提示时将此新孔板插入生物打印机右侧的孔板持架区域。确保孔板持架设置为 高型孔板，并在开始下一步前移除盖子并将其放入专用盖子持架中。
    8. 生物打印机将在96孔板的每个孔中沉积水滴。完成后，将孔板从打印机中取出，并确认每个孔中均有水滴存在。
    9. 丢弃用于绿灯检测的96孔板，并让生物打印机完成绿灯检测流程。完成后，软件将显示生物打印机的喷嘴状态，并确认打印机已准备就绪可进行模型打印。将盖子盖回打印 cartridge 上，将其取出并移至生物安全柜中进行后续步骤。
    10. 使用生物打印机软件，通过 打印运行 软件按钮加载在步骤1.1中生成的打印文件，并打开打印协议PDF文件。
    11. 根据打印协议PDF中的指示，从-20 °C取出生物墨水和激活液，并在室温（RT）下解冻40分钟。对于水凝胶基质Px02.53，包括：1支F32、1支F3、1支F261和1支F299。切勿用手或水浴加热解冻生物墨水和激活液。
    12. 在生物墨水和激活液解冻的同时，将50 mL含多西环素和ROCK抑制剂的完全培养基（完全培养基 +DOX/ROCKi）（见步骤2.2）恢复至室温。
    13. 生物墨水和激活液解冻后，按照生成的打印协议PDF最后两页的说明准备打印 cartridge。绿灯检测所用的打印 cartridge 将在模型打印阶段重复使用。
      1. 确保A1仓中有40 mL dH2O，B1和B2仓中各有8 mL 70%乙醇。向C1加入1.2 mL激活液F32，向C2加入1.2 mL F3，向C4加入200 µL F261。
      2. 从培养箱中取出经PEI和层粘连蛋白包被的孔板，并将其放入打印机右侧的孔板持架区域。此时不要移除孔中的层粘连蛋白-培养基溶液。确保孔板持架区域设置为 低型孔板，且盖子已移除并放入盖子持架中。
    14. 将打印 cartridge 放入生物打印机，确保盖子已移除并放入持架中，然后在软件中点击 打印惰性基底 按钮，启动打印运行。
    15. 在惰性基底打印过程中，从液氮中取出谷氨酸能神经元和星形胶质细胞冻存管，按第2节说明进行解冻和重悬。
    16. 细胞解冻后，分别向每种细胞中加入8 mL完全培养基 +DOX/ROCKi（按第2节说明），在室温下以300 x g 离心5分钟。
    17. 吸除上清液，并分别用1 mL完全培养基 +DOX/ROCKi 重悬两种细胞。
    18. 取20 µL细胞悬液与20 µL台盼蓝混合，混匀后进行细胞计数，以确定每种细胞的活细胞浓度（个/mL）。
    19. 将总计300万个谷氨酸能神经元与100万个星形胶质细胞混合于一个15 mL离心管中。加入培养基使总体积达到8 mL。
    20. 在室温下以300 x g 离心5分钟。
    21. 尽可能吸除上清液而不扰动细胞沉淀，并用200 µL激活液F299重悬细胞沉淀。
    22. 注意激活液较为黏稠；需反复吹打以充分重悬细胞沉淀。由于细胞较为脆弱，应使用宽口移液吸头并采用反向移液技术，尽量减少剪切力和气泡产生。吹打次数不超过3次，以防细胞损失。
    23. 惰性基底打印完成后，将 cartridge 和培养孔板盖上盖子，从生物打印机中取出并移至生物安全柜中。
    24. 将200 µL含F299的细胞悬液加入打印 cartridge 的C3孔中，重新插入 cartridge 至生物打印机，移除盖子并放入盖子持架中。此时暂不重新插入培养孔板。
    25. 启动打印运行中的 打印模型 阶段。在生物打印机进行液体预灌注的同时，从孔板的2D对照孔中移除层粘连蛋白-培养基溶液，并替换为完全培养基 +DOX/ROCKi：若使用96孔板，则每孔加150 µL；若使用384孔板，则每孔加50 µL。
    26. 液体预灌注完成后，将生物打印定位孔板插入生物打印机，移除盖子并放入盖子持架中。
    27. 开始生物打印机的定位过程。
      1. 当生物打印软件提示时，将定位孔板从生物打印机中取出。
      2. 根据引导选择孔板上可观察到液滴的位置。将定位孔板重新插入生物打印机，并重复液滴打印和选择过程。
      3. 当再次提示时，取出定位孔板，替换为细胞培养孔板（其中2D对照孔已按步骤1.3.25加入培养基）。确保培养孔板盖已移除并放入持架中。生物打印机将完成模型打印。
    28. 模型打印完成后，按照第2节（步骤2.8）中的细胞培养方法向各孔中添加培养基。
    29. 启动生物打印机的清洗程序，完成后根据实验室规程处理 cartridge 和剩余液体。

2. 细胞培养

  1. 使用1个小瓶的谷氨酸能神经元（>每瓶500万个细胞）和1个小瓶的星形胶质细胞（>每瓶100万个细胞）生成模型。
  2. 将水浴预热至37 °C。
  3. 将两个细胞小瓶置于干冰上运输至实验室，从干冰中取出后立即浸入水浴中，同时解冻两个小瓶。
  4. 当小瓶中仅剩少量冰晶时将其从水浴中取出，此过程在浸入水浴后约需3分钟。切勿在水浴中摇晃或混合细胞。
  5. 用70%乙醇喷洒小瓶，并将其转移至生物安全柜中。
  6. 在将每种细胞悬液转移至独立的15 mL离心管之前，先向每个小瓶中逐滴加入500 µL完全培养基+DOX/ROCKi。
  7. 将每根离心管中的培养基补至8 mL，并按照步骤1.3进行后续生物打印操作。
  8. 完成生物打印模型（步骤1.3）后，立即向所有3D共培养孔中加入完全培养基+DOX/ROCKi，并将模型置于37 oC 和5% CO2的培养箱中。若使用96孔板，每孔加入150 µL培养基；若使用384孔板，则每孔加入50 µL培养基。
  9. 培养最初48小时内无需更换培养基。
  10. 对2D对照组和模型进行换液时，应小心操作以避免产生机械应力，防止2D培养物脱落或水凝胶发生形变。使用移液器沿孔壁缓慢进行培养基的吸除和添加。
  11. 48小时后，对所有孔进行90%的培养基更换，并从培养基配方中去除ROCKi（见步骤2.14）。
  12. 96小时后，对所有孔再次进行90%的培养基更换，以从培养基配方中去除DOX（见步骤2.14）。
  13. 在48小时和96小时完成两次90%换液后，此后每48小时进行一次50%的培养基更换，即吸除50%的培养基并补充等量新鲜的完全培养基。
  14. 培养基配方：
    1. 完全培养基：Neurobasal培养基，含1x GlutaMAX、1x B27、12.5 nM 2-巯基乙醇、10 ng/mL NT3、5 ng/µL BDNF。
    2. 含多西环素（DOX）的完全培养基：Neurobasal培养基，含1x GlutaMAX、1x B27、12.5 nM 2-巯基乙醇、10 ng/mL神经营养因子-3（NT3）、5 ng/µL脑源性神经营养因子（BDNF）和1 µg/mL多西环素。
    3. 含DOX/ROCK抑制剂（ROCKi）的完全培养基：Neurobasal培养基，含1x GlutaMAX、1x B27、12.5 nM 2-巯基乙醇、10 ng/mL NT3、5 ng/µL BDNF、1 µg/mL多西环素和10 µM ROCK抑制剂。

3. 神经突生长分析

  1. 生物打印后添加培养基，立即将细胞放入活细胞显微镜中进行明场成像。
  2. 使用显微镜软件设置成像程序，对包括二维对照在内的每个孔中的细胞以4倍放大倍数每12小时成像一次，持续至少7天。
  3. 每48小时更换一次培养基，具体操作见第2节，并在每次换液后将细胞重新放回显微镜中。
  4. 7天数据采集结束后，将软件中的图像以.jpg格式导出。
  5. 将所有.jpg图像导入ImageJ软件，并将文件转换为8位格式。加载NeuronJ插件，使用追踪工具在图像中标注神经突生长情况，包括分支点。
  6. 利用NeuronJ生成的神经突追踪数据，绘制随时间变化的神经突外延生长曲线。

4. 细胞活力分析

  1. 在培养过程中的每个24小时时间点，使用活/死细胞活力检测试剂盒对3个或更多孔进行染色，以分析细胞活力。在研究期间的24小时或48小时时间点重复此步骤。
  2. 在成像前30分钟，将活细胞试剂（1× Calcein-AM）、死细胞试剂（1× 乙啶同源二聚体-1）和1×活细胞核染色剂（Hoechst 33342）溶于10 mL无酚红的低血清培养基（Opti-MEM）中，配制活/死细胞试剂培养基。使该试剂培养基恢复至室温。由于荧光易发生漂白，需将试剂培养基避光保存。
  3. 从含有细胞模型/二维对照的3个孔中移除培养基，注意避免扰动凝胶。用室温的无菌PBS轻柔洗涤细胞模型一次。向每个孔中加入100 µL活/死细胞试剂培养基（96孔板）或25 µL（384孔板）。
  4. 将模型在37 °C 和5% CO2条件下孵育30分钟。
  5. 孵育结束后，模型即可进行成像。使用配备红色（647 nm，死细胞）、绿色（488 nm，活细胞）和蓝色（405 nm，核染色）激发通道的标准显微镜进行成像。为获得三维模型的最佳成像效果，建议使用高内涵共聚焦显微镜，并以4×或10×放大倍数结合Z轴层扫功能进行成像。
    注意：本研究中使用INCell Analyzer 6500HS（高内涵成像系统）进行细胞模型成像，并使用Signals Image Artist（图像分析平台，参见步骤4.7）进行分析。
  6. 成像完成后，将细胞模型放回37 °C 和5% CO2的细胞培养箱中继续培养。但因活/死细胞试剂培养基可能影响长期细胞活力，已用于活力分析的细胞模型不应再用于后续实验。
  7. 在图像分析平台上进行图像分析
    1. 在软件中选择Z轴层扫图像的每一层平面，并将各层图像合并为最大强度投影图像。
    2. 通过识别488 nm活细胞通道的荧光信号，将生物打印模型设为感兴趣区域（ROI），创建新的分析任务（确保ROI内包含所有细胞）。
    3. 在感兴趣区域内，利用成像软件通过405 nm核染色通道识别ROI中的总细胞数，通过488 nm通道识别活细胞数，通过647 nm通道识别死细胞数。
    4. 对所有经活/死染色处理的细胞模型孔进行分析，并导出包含ROI面积、总细胞数、活细胞数和死细胞数的数据表。
    5. 将每天分析所得的活细胞和死细胞数量分别以占总细胞数的百分比形式进行计算。

5. 免疫染色与细胞群体分析

  1. 固定前，从细胞模型中移除培养基，并用 PBS 洗涤模型一次。
  2. 在室温下用含 4% (v/v) 多聚甲醛的 PBS 固定细胞 20 分钟。
    注意：所有涉及多聚甲醛的操作必须按照实验室规程进行。
  3. 吸除模型中的 4% (v/v) 多聚甲醛溶液，并用 PBS 洗涤模型四次，以彻底去除多聚甲醛。
  4. 在室温下用 0.2% Triton-X 对细胞模型进行透化处理 30 分钟，然后用 PBS 洗涤三次。
  5. 使用 10% (v/v) 正常驴血清（NDS）在室温下封闭细胞模型 3 小时。
  6. 移除封闭液，并将一抗（用含 1% v/v NDS 的 PBS 稀释）加入模型中。若进行细胞群体比例分析（见步骤 5.11），需确保包含共染 Β-III 微管蛋白（与红色 AF647 偶联）和 GFAP（与绿色 AF488 偶联）的细胞模型。将模型与一抗在 4 °C 下孵育 24 小时。
  7. 一抗孵育后，用 PBS 洗涤经偶联一抗染色的模型三次，并用 20 µM Hoechst 复染 30 分钟。按照步骤 5.10 所述进行成像。
  8. 用 PBS 洗涤经非偶联一抗染色的模型三次，然后加入二抗（用含 1% v/v NDS 的 PBS 稀释）。在 4 °C 下孵育 24 小时。
  9. 通过 PBS 洗涤三次去除二抗，并在成像前用 20 µM Hoechst 复染模型 30 分钟。
  10. 在标准显微镜上使用红色（647 nm）和绿色（488 nm）激发通道进行成像。然而，对于 3D 模型的最佳结果，建议使用高内涵共聚焦显微镜，并以 4× 或 10× 放大倍数通过 Z 轴层扫功能进行成像。
  11. 在图像分析平台上进行细胞群体比例分析
    1. 使用共染 GFAP（与 AF488 偶联）和 Β-III 微管蛋白（与 AF647 偶联）的模型获取细胞群体分析结果。
    2. 在软件中选择 Z 轴层扫图像的每一层平面，并将各层图像合并为最大强度投影图像。
    3. 通过识别 647 nm 处 Β-III 微管蛋白通道的荧光，选择生物打印模型作为感兴趣区域（ROI），创建新的分析（确保 ROI 覆盖所有含细胞的区域）。
    4. 在 ROI 内，使用软件识别 Hoechst 通道（405 nm）中的细胞总数、488 nm 通道中 GFAP+ 星形胶质细胞的数量，以及 647 nm 通道中 Β-III 微管蛋白+ 细胞的数量。
    5. 对所有共染细胞模型孔进行分析，并导出包含 ROI 面积、总细胞数、GFAP+ 细胞数和 Β-III 微管蛋白+ 细胞数的数据表。
    6. 将 GFAP+ 和 Β-III 微管蛋白+ 细胞数量计算为总细胞数的百分比。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神经突生长分析
在本实验方案中，采用3D生物打印机将诱导多能干细胞（iPSC）来源的谷氨酸能神经元与星形胶质细胞共培养并生物打印至水凝胶基质中。打印后前7天内，每隔12小时使用活细胞显微镜对细胞进行成像观察。生物打印后，细胞应呈现圆形形态，并均匀分散于水凝胶基质中，在培养最初几天内逐渐形成带有少量突起的小型细胞簇（参见补充视频1以了解典型的健康细胞生长情况）。至第4天，健康细胞会迁移贯穿凝胶，形成更大的细胞簇，并通过神经突延伸相互连接。到第7天时，几乎不再存在单个细胞，神经突及星形胶质细胞突起形成的相互连接束应显得更加致密，且可观察到大量较小的神经突发芽自细胞簇向外生长（图2A）。利用为期7天生长过程中连续采集的一系列活细胞明场图像，按照第3节所述方法对神经突发芽情况进行定量分析。该分析显示，在12小时至156小时期间，神经突发芽呈近似线性增长趋势（R2值 = 0.84）（图2B）。在此神经突发芽期间，细胞体簇的尺寸也逐渐增大（参见补充视频1），表明细胞在水凝胶中持续迁移。

细胞活力与细胞群体比例
在本实验方案中，用于生物打印细胞模型的细胞浓度为 2000 万个细胞/mL，其中包含 1500 万个神经元/mL 和 500 万个星形胶质细胞/mL。通过使用钙黄绿素-AM（活细胞染料）、碘化乙啶同源二聚体-1（死细胞染料）以及细胞核染料进行活细胞染色，可按照第 4 节所述方法计算 7 天内存活的细胞数量（图 3A）。代表性培养样本的细胞活力结果展示于第 4 天，此时活细胞占总细胞数的 72% ± 1%（均值 ± 标准误），并呈现钙黄绿素-AM 染色阳性，而死细胞占总细胞数的 29% ± 2%（均值 ± 标准误），显示碘化乙啶同源二聚体-1 染色阳性（图 3B）。钙黄绿素-AM 与碘化乙啶同源二聚体-1 对细胞染色的代表性图像见补充图 1。需要注意的是，3D 培养中的细胞存活率数值不能直接与 2D 培养进行比较，因为在 3D 培养中，死亡细胞会被保留在水凝胶内，不会在换液过程中被清除。

根据第5节及图4中所述的β-III微管蛋白和GFAP免疫荧光染色方法，可进行图像分析以确定神经元与星形胶质细胞之间的细胞群体比例（图3A）。在代表性培养模型的总细胞中，β-III微管蛋白阳性的神经元占49% ± 3%（均值 ± 标准误），而GFAP阳性的星形胶质细胞占30% ± 4%（均值 ± 标准误），由此得出星形胶质细胞与神经元的比例为1:1.5。其余21%的细胞在每种模型中均不表达上述任一细胞标志物。由于细胞活力分析显示，在第4天时平均有29%的细胞失去活性，因此这些未染色的细胞很可能已在水凝胶中死亡。

细胞标志物的表达
通过针对神经元细胞类型标志物（Β-III 微管蛋白）和星形胶质细胞标志物（GFAP）的免疫染色，评估了生物打印的神经元和星形胶质细胞的形态。在所示的代表性培养物中，免疫染色定位于特定的细胞类型，显示出健康的细胞形态，两种细胞均表现出细胞突起的延伸（图4A、B）。由于水凝胶和细胞结构为三维结构，每张图像仅代表 图4A、B 中结构的一个切片。 图4C 展示了贯穿整个水凝胶的图像叠加合并图，呈现了细胞在 X、Y 和 Z 平面上的定位分布。 图4D 仅显示 Β-III 微管蛋白的免疫染色，突出显示从细胞簇主体延伸出的更精细的神经突。为进一步检测谷氨酸能神经元的表型，可对谷氨酸离子受体标志物 GluR2 进行免疫染色。在 图4E 中，区域 4E.1（插图）被特别标出，以显示沿神经突束分布的高分辨率点状染色信号。因此，这证实了共培养体系中的神经元具有谷氨酸能表型。在所有免疫染色图像中，可观察到免疫荧光染色的非细胞结构围绕在细胞簇和神经突周围。这些结构很可能代表保留在水凝胶中的细胞碎片，同时伴有少量抗体与水凝胶的非特异性结合。这在生物打印的培养物中是预期现象，因为在三维支架模型中，换液过程无法清除死亡细胞和碎片。代表性阴性对照免疫染色图像见 补充图2，用以展示二抗在水凝胶上的非特异性结合情况。

神经突生长分析：神经元网络的显微镜图像；随时间变化的神经突长度图表。
图2：使用生物打印机将谷氨酸能神经元和星形胶质细胞打印至水凝胶基质中，并利用明场显微镜每12小时成像一次。（A）分析过程中拍摄的细胞培养明场图像示例。该图像代表156小时时间点，比例尺为400 µm。（B）使用ImageJ软件中的NeuronJ插件测量的培养物中神经突外延生长的平均长度（µm）。每个数据点包含n = 3个神经突，数据以均值±标准误表示。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞群体和存活率柱状图，神经元与星形胶质细胞，活细胞与死细胞比较。
图3：使用2000万细胞/mL的激活剂溶液浓度进行细胞模型的生物打印。（A）通过活/死细胞染料（分别为Calcein-AM和碘化丙啶同源二聚体-1）测定细胞存活率。结果显示，在第4天，每孔总细胞中72% ± 1%（均值 ± 标准误，n = 3）为活细胞，29% ± 2%（均值 ± 标准误，n = 3）为死细胞。所示数值代表均值 ± 标准误。（B）通过图4所示染色结果的图像分析，计算每孔中神经元和星形胶质细胞的细胞群体百分比。神经元指在第7天对β-III微管蛋白染色呈阳性的细胞比例（49% ± 3%，均值 ± 标准误，n = 3），星形胶质细胞指在第7天对GFAP染色呈阳性的细胞比例（30% ± 4%，均值 ± 标准误，n = 3）。所示数值代表均值 ± 标准误。用于图3中所有计算的成像均在共聚焦成像系统上完成，所有分析均按照方法部分所述，在图像分析平台和GraphPad Prism软件中进行。请点击此处查看该图的放大版本。

显示GFAP、DAPI染色和细胞结构分析的神经网络荧光显微图像。
图4：谷氨酸能神经元与星形胶质细胞三维生物打印共培养体系在第7天时神经细胞类型标志物的表达情况。（A,B）在倒置显微镜平台下以10倍放大倍数拍摄的神经元标志物β-III微管蛋白和星形胶质细胞标志物GFAP的免疫荧光染色图像。比例尺为100 µm。（C）神经元标志物β-III微管蛋白和星形胶质细胞标志物GFAP与Hoechst共染色，在共聚焦成像系统上以10倍放大倍数拍摄，并以XYZ平面视图显示。图像经图像分析平台生成。比例尺为100 µm。（D）神经元标志物β-III微管蛋白与Hoechst共染色，在共聚焦成像系统上以20倍放大倍数拍摄。比例尺为100 µm。（E）谷氨酸能标志物GluR2与Hoechst共染色，在倒置显微镜平台下以10倍放大倍数拍摄。方框3E.1显示GluR2染色的高亮区域。比例尺为100 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

补充视频 1：使用生物打印机将谷氨酸能神经元和星形胶质细胞打印至水凝胶基质中，并利用明场显微镜每 12 小时成像一次。本视频展示了分析过程中获取的细胞培养明场图像，时间点标注在右下角，比例尺代表 400 µm。请点击此处下载该文件。

补充图1：第4天生物打印的神经元和星形胶质细胞活/死分析示例图像。 Calcein-AM 染色显示为绿色（488 nm），乙啶同源二聚体染色显示为红色（647 nm）。图像以图像分析平台生成的XYZ平面视图展示。比例尺代表100 µm。（A）使用共聚焦成像系统在4倍放大倍数下进行成像。（B）使用共聚焦成像系统在10倍放大倍数下进行成像 请点击此处下载该文件。

补充图2：免疫荧光染色后阴性对照图像示例。 实验中省略了一抗，按照免疫染色方案使用了绿色（488 nm）和红色（647 nm）二抗。图像以XYZ平面视图显示，由图像分析平台生成。比例尺代表100 µm。成像采用共聚焦成像系统，放大倍数为10倍。请点击此处下载该文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

对中枢神经系统（CNS）精确模型的需求从未如此迫切，而传统的二维（2D）细胞培养模型存在诸多局限性，这促使近年来涌现出一代复杂的CNS模型19。然而，许多能够模拟神经细胞类型与细胞外基质（ECM）相互作用的复杂三维（3D）模型仍存在一定的局限性，限制了其在工业流程中的应用6,20,21。在本实验方案中，我们建立了一种来源于人诱导多能干细胞（iPSC）的神经元与星形胶质细胞的三维共培养模型，旨在利用3D生物打印技术构建具有生物活性的水凝胶支架，以96孔板和384孔板形式克服其中部分局限。

通过使用孔板图设计软件、自动生成的打印方案以及生物打印机的引导式打印流程，这些模型的构建方法已得到简化。然而，由于本方案中使用的诱导多能干细胞（iPSC）来源的细胞类型较为敏感，因此在解冻和培养过程中的以下关键步骤需格外注意。首先，在整个生物打印过程及早期培养阶段加入ROCK抑制剂（ROCKi）具有多种益处。细胞解冻是一个关键环节，神经元可能在此过程中产生应激反应，不恰当的解冻操作会降低细胞存活率22。通常建议尽快完成细胞解冻、添加培养基并将细胞置于培养箱温度条件下23。但在本方案所述的生物打印过程中，神经元和星形胶质细胞需重悬于激活溶液而非培养基中，且细胞在打印结束前（解冻后最长30分钟）不会升至培养箱温度。因此，在解冻后立即向培养基中添加ROCKi，并在两次离心步骤中（步骤2.1–2.7和1.3.15–1.3.20）持续保留该成分，对于抑制细胞应激通路至关重要，否则将导致细胞活力下降24。此外，已有研究表明ROCKi可促进神经突生长并改善神经元成熟度25。因此，生物打印后需继续补充ROCKi达48小时。然而，必须在48小时后停止添加ROCKi，以确保在后续换液过程中完全清除该成分，方可将细胞用于检测。

另一个需要特别注意的关键步骤是在打印后添加培养基以及更换培养基的过程中（步骤 2.8–2.13）。生物打印的水凝胶支架的生物力学刚度仅为 1.1 kPa，相当于脑灰质的硬度。如步骤 2.10 所述，在添加或吸除培养基时，必须轻柔地将移液枪头靠近孔壁进行操作，以避免对凝胶造成扰动。这一点在 384 孔板中尤为重要，因为在这些孔板中，凝胶所占孔内总体积的比例更高。该操作方法也应应用于 2D 对照孔，以防止细胞边缘翘起以及神经突起的剪切损伤。作者还强调在生物打印机内保持无菌操作技术的重要性，其操作应如同处理用于诱导多能干细胞（iPSC）衍生细胞培养的生物安全柜一样谨慎。具体措施包括：对绿色照明和打印过程中使用的 70% 乙醇和 dH2O 进行无菌过滤；在将手伸入或移出生物打印机时，始终保持打印 cartridge 和培养板的盖子处于关闭状态；并在打印前后使用 70% 乙醇湿巾对生物打印机内部表面进行去污染处理。

本模型所采用的生物打印水凝胶支架由生物墨水和激活剂溶液形成，其选自Inventia Life Science公司为RASTRUM生物打印机开发的一系列生物墨水和激活剂溶液。由于层粘连蛋白（laminin）和透明质酸（hyaluronic acid）在轴突导向、突触形成以及神经元周围网结构形成中具有重要作用，因此被确定为与iPSC来源的神经元成熟相关的关键分子26,27。此外，选择1.1 kPa的生物力学刚度，因为较低密度的水凝胶已被证明更有利于神经元的 neurite 延伸12。如果对实验方案进行修改，例如使用实验室自分化或来自其他商业供应商的神经元和星形胶质细胞，则建议进行基质筛选实验，以确定最适宜支持细胞生长的水凝胶支架15。此外，若细胞来源发生改变，也可能需要优化细胞密度，以确保最佳的细胞存活率并防止水凝胶内细胞过度拥挤。对于所有与生物打印机功能相关的修改和故障排查，作者建议联系设备制造商并参考其提供的操作规程。

中枢神经系统（CNS）包含多种神经元亚型和胶质细胞，这些细胞存在于不同的脑区微环境中，并在神经功能中发挥特定作用28。在如此广泛的细胞类型背景下，该模型仅包含了两种最丰富的细胞类型（星形胶质细胞和兴奋性谷氨酸能神经元）。一些重要的细胞类型，如小胶质细胞、少突胶质细胞以及构成血脑屏障的内皮细胞，在本系统中未被纳入。若研究重点为神经免疫相互作用，则引入小胶质细胞可能具有重要意义；而少突胶质细胞则可能在影响中枢髓鞘形成的疾病中具有研究价值。除了在病理过程中的作用外，例如构成血脑屏障的内皮细胞还能分泌药物代谢酶，这可能会影响该模型在药代动力学实验中的应用29。该模型的另一个局限性可能是星形胶质细胞与神经元的比例；不同脑区中星形胶质细胞与神经元的比例差异较大，文献报道的比值范围约为1:1至1:330,31。本模型中星形胶质细胞与神经元的比例约为1:1.5；因此，该模型可能不适用于星形胶质细胞更为丰富的脑区建模，例如白质区域30。

近年来已发表其他用于构建3D生物打印共培养模型的方案。Sullivan等人于2021年发表的一项研究介绍了一种使用iPSC来源的神经前体细胞构建的3D生物打印神经模型，该模型表现出较高的打印后细胞存活率，并且与2D培养相比，神经元功能得到增强32。然而，在该方案中使用了神经前体细胞作为细胞来源，并需要在培养中维持4周。而在本方案中，采用的是商业可得的iPSC来源的谷氨酸能神经元和星形胶质细胞。这使得共培养的3D细胞网络可在短短7天内建立；通过神经突生长分析可见，神经突外延在24小时内即开始出现，并在持续监测的156小时期间呈线性增长。此类网络的快速建立部分归因于使用了谷氨酸能神经元，这些细胞通过优化的强力霉素诱导型NGN2基因表达系统，在7天内即可表达成熟神经元亚型标志物，即使在2D培养条件下亦如此33。利用该技术缩短培养周期对于在生物制药行业中推广应用此类模型具有重要意义，因为药物检测开发需要细胞模型具备快速构建和高通量开发的能力15。

综上所述，该模型展现出构建神经元与星形胶质细胞三维模型的潜力，可快速、便捷地建立用于筛选目的的体系。此类模型未来的应用可能涵盖多种中枢神经系统疾病的药物发现研究，并可通过采用患者来源或基因编辑的疾病特异性诱导多能干细胞（iPSC）系，进一步拓展至其他疾病的研究。此外，利用多西环素诱导的NGN2表达所分化的iPSC来源的谷氨酸能神经元，可使细胞在更短时间内达到成熟状态，这一特性可用于构建模拟衰老大脑的模型，服务于神经退行性疾病的科研。该体系还可通过在共培养体系中引入小胶质细胞和少突胶质细胞等其他细胞类型而进一步扩展。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CW、NC 和 JB 是位于英国伦敦的默沙东（Merck Sharp & Dohme (UK) Limited）的员工。YH 是位于美国新泽西州拉威的默沙东有限责任公司（Merck Sharp & Dohme LLC，默沙东公司 Merck & Co., Inc. 的子公司）的员工。

图一使用 Biorender.com 创建。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢 Alex Volkerling、Martin Engel 和 Rachel Bleach 在制定实验方案以及对稿件提供反馈意见方面的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇Thermofisher31350010
384孔板PerkinElmer6057300
96孔板PerkinElmer6055300
激活液 F299Inventia Life ScienceN/A
激活液 F3Inventia Life ScienceN/A
B27 (50倍浓度) 不含维生素AThermofisher12587010
Bioink 液体 F261Inventia Life ScienceN/A
Bioink 液体 F32Inventia Life ScienceN/A
盐酸多西环素Sigma AldrichD5207
GlutaMAX (100倍浓度)Thermofisher35050061
山羊抗小鼠 IgG H&L Alexa Fluor 647Abcamab150115
山羊抗兔 IgG H&L Alexa Fluor 488Abcamab150077
HoechstAbcamab228551
人源 BDNF 重组蛋白ThermofisherPHC7074
人源 NT3 重组蛋白ThermofisherPHC7036
iCell 星形胶质细胞Fujifilm CDI1434
INCell Analyser 6500HSMolecular DevicesN/A高内涵成像系统
Incucyte S3Sartorius N/A
io谷氨酸能神经元（大瓶装）Bit.bioe001
层粘连蛋白（1 mg/mL）Sigma AldrichL2020
活/死细胞检测试剂盒（Calcein-AM，Ethidium homo-dimer-1）InvitrogenL3224
小鼠抗 BIII 微管蛋白 NL637 偶联抗体R&D systemsSC024
Neurobasal 培养基Thermofisher21103049
正常驴血清Abcamab7475
NucBlue Live（Hoechst 33342）ThermofisherR37605
Opti-MEMThermofisher11058021
多聚甲醛Sigma AldrichP6148
PEI 50% 水溶液 H2OSigma Aldrich181978
Pierce 硼酸缓冲液 20倍浓度Thermofisher28341
PrismGraphPad数据分析软件
兔抗离子型谷氨酸受体2（GluR2）Abcamab206293
RASTRUM(TM) 生物打印仪Inventia Life ScienceN/A生物打印仪
RASTRUM(TM) 生物打印仪墨盒Inventia Life ScienceN/A生物打印仪墨盒
RASTRUM(TM) 定位板Inventia Life ScienceN/A定位板
Rho 激酶（ROCK）抑制剂Abcamab120129
绵羊抗 GFAP NL493 偶联抗体R&D systemsSC024
Signals Image Artist PerkinElmer N/A图像分析平台
曲拉通 X-100ThermofisherHFH10
蔡司 Axio ObserverZeissN/A倒置显微镜平台 

参考文献

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重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

勘误

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

An erratum was issued for: Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications. The Authors section was updated from:

Chloe Ann Whitehouse1
Yufang He2
Janet Brownlees1
Nicola Corbett1
1MSD R&D Innovation Centre Ltd
2Merck & Co., Inc.

to:

Chloe Ann Whitehouse1
Yufang He2
Janet Brownlees1
Nicola Corbett1
1MSD Research Laboratories, London, UK
2Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA

标签

3D iPSC neurite outgrowth assay

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