脑卒中短暂性中动脉闭塞模型

Summary

该方案描述了通过大脑中动脉腔内闭塞在小鼠中短暂性局灶性脑缺血的模型。此外，还显示了使用磁共振成像和行为测试的结果评估示例。

Abstract

中风是全球死亡或慢性残疾的主要原因。然而，现有的最佳治疗方法仅限于缺血性卒中急性期的再灌注治疗。为了深入了解中风生理学并开发创新的治疗方法，中风 的体内 啮齿动物模型起着重要作用。转基因动物的可用性特别推动了小鼠作为实验性中风模型的使用。

在卒中患者中，大脑中动脉 （MCA） 闭塞很常见。因此，最普遍的实验模型涉及 MCA 的腔内闭塞，这是一种不需要开颅手术的微创技术。该过程包括通过颈外动脉 （ECA） 插入单丝并将其推进通过颈内动脉 （ICA），直到它到达 MCA 的分支点。动脉闭塞 45 分钟后，移除单丝以允许再灌注。在整个过程中，监测脑血流以确认闭塞期间的减少和随后的再灌注恢复。使用行为测试和磁共振成像 （MRI） 研究评估神经和组织结果。

Introduction

根据世界卫生组织的数据，中风是一种毁灭性的疾病，每年影响全球约 1500 万人。大约三分之一的患者死于这种疾病，而另外三分之一的患者则经历永久性残疾。卒中是一种复杂的病理学，涉及各种细胞类型，例如神经和外周免疫细胞、脉管系统和全身反应¹。目前无法使用 体外 模型复制由系统水平的中风引发的复杂反应网络。因此，实验动物模型对于深入研究疾病的机制以及开发和测试新疗法至关重要。目前，早期组织再灌注是唯一获批的干预措施，通过组织型纤溶酶原激活剂 （tPA） 溶栓或血管内血栓切除术¹。

脑中动脉 （MCA） 闭塞在卒中患者中很常见。因此，最初在大鼠中开发了瞬时 MCA 闭塞 （tMCAo） 的啮齿动物模型 ^2,3,4。如今，转基因小鼠是实验性中风模型中最常用的动物。在这项研究中，我们描述了小鼠腔内 tMCAo 的微创模型。该方法通过颈部水平的颈动脉进行，无需开颅手术。

闭塞期的持续时间是决定缺血性病变程度的关键因素。即使是 10 分钟的短暂闭塞也会导致选择性神经元死亡，而不会出现明显的梗死，而较长时间的闭塞（通常持续 ....

Protocol

动物工作是按照加泰罗尼亚和西班牙法律（Real Decreto 53/2013）和欧洲指令进行的，并得到了巴塞罗那大学伦理委员会（Comité Ètic d'Experimentació Animal，CEEA）和加泰罗尼亚政府当地监管机构的批准。研究报告符合ARRIVE指南。该程序旨在在成年小鼠中进行，从 8 周龄开始，没有年龄限制。这里提供了在10-12周龄的C57BL / 6小鼠中开发的外科手术的示例。应考虑取决于小鼠品系的解剖学差异。

1.动物准备

1. 在开始外科手术之前，请收集并消毒所有必需的材料和工具。用所有必要的手术材料（在 材料表中列出）设置手术台。
2. 使用异氟醚吸入氧气和一氧化二氮（30%/70%）的混合物麻醉动物。
3. 皮下注射丁丙诺啡（见 材料表），剂量为0.05mg / kg BW，以提供镇痛并减轻任何疼痛和不适。
   注意:镇痛是强制性的，但接受不同的方案。在MCAo后的第一天，疼痛和不适的体征也必须得到控制（见步骤4）。必要时应用纠正解决方案。
4. 将动物置于含有5%异氟烷的麻醉诱导箱（见 材料表）中，直至达到深度麻醉状态（爪子穿刺和眼反射反射丧失）。
5. 将鼠标放在手术台上，将异氟烷的含量降低到1.5%，通过面罩给药。涂抹兽医软膏....

Results

有不同的方法可以评估 tMCAo 程序的结果。这里使用 体内 神经成像方法 （MRI） 和行为测试。

小鼠在大脑中出现缺血性病变，主要影响MCA同侧提供给闭塞的区域，如纹状体和背外侧皮层。有几种方法可以确定病变范围，包括 2,3,5-三苯基氯化四氮唑 （TTC） 组织染色、组织学染色（苏木精/伊红素、乙酸亚硫氨酸）和 MRI 等 体内 神经影像学检查。这里之所以选择 MRI，是因为它具有非侵入性，并且能够将相同的组织用于其他研究，从而对每只小鼠的病变进行全面评估。此外，MRI允许在同一只动物中重复测量，提高了结果的可重复性，并且通常减少了研究所需的动物数量。

在 MRI 会议中使用异氟醚的相同麻醉方案（诱导 5%，维持 1.5%）。对于病变体积评估，使用快速 T2 加权序列（T2w turbo RARE 快速自旋回波）⁹ 来最大限度地减少动物被麻醉的时间，这对于在同一只小鼠中进行不同时间的 MRI 采集的纵向研究很重要。该程序允许评估同一动物的.......

Discussion

腔内 tMCAo 手术是基础研究中最常用的局灶性脑缺血再灌注模型。目前，由于转基因菌株的可用性，小鼠是首选的动物模型。然而，必须承认转基因小鼠及其遗传背景会影响脑血管形成。不同动脉区域之间侧支循环和吻合的存在可以显着影响实验程序^{的结果 11}。

在执行此程序时，必须考虑某些关键点。损伤可能发生在 MCA 区域之外，累及海马体、丘脑或下丘脑等区域，通常是由于后交通动脉闭塞所致。此外，尽管外科手术看似成功，但一小部分小鼠可能不会表现出明显的梗塞。

在此过程中需要监控几个变量。脑部病变的发展直接取决于脑血流量 （CBF） 下降的严重程度和这种减少的持续时间 ^5,12。为了在手术过程中跟踪 CBF 并评估闭塞期间和再灌注后的流量变化，强烈建议使用 LDF（激光多普勒流量计）或激光散斑流量计^13,14

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6/0 缝合线	Arago		血管结扎
6/0 缝合线，带弯曲针	Arago		皮肤缝合线
9 mg/mL 盐水	Fresenius Kabi	CN616003 EC	用于水合作用
麻醉系统	SurgiVet
钝牵开器，1 毫米宽	精细科学工具	18200-09
丁丙诺芬	Buprex		用于止痛
夹子应用镊子	Fine Science Tools	S&T CAF4
Dumont 迷你镊子	Fine Science Tools	M3S 11200-10
镊子	Fine Science Tools	91106-12
胶			将 LDF 探针粘在颅骨
上 握力计	IITC Life Science Inc.	#2200
异氟醚	B-Braun	CN571105.8
LDF Perimed	Perimed Periflux	系统 5000
LDF 探针支架	Perimed	PH 07-4
医用胶带
MRI 磁铁	Bruker BioSpin， Ettlingen， Germany		BioSpec 70/30 水平动物扫描仪
带缝合刀的持针器	Fine Science Tools	12002-14
尼龙长丝	Doccol	701912PK5Re
带加热垫
Sirgical 剪刀	Fine Science Tools	91401-12
小容器烧灼器套件	Fine Science Tools	18000-00
立体显微镜和冷光	Leica	M60
缝合打结钳	Fine Science Tools	18025-10
恒温器、直肠探头和鼠标垫	Letica Science Instruments	LE 13206
Vannas 弹簧剪刀（4 毫米刀刃）	Fine Science Tools	15019-10
血管夹	Fine Science Tools	00396-01