本方案描述了通过大脑中动脉腔内阻塞建立小鼠短暂性局灶性脑缺血模型的方法。此外，还展示了使用磁共振成像和行为学测试进行结果评估的示例。
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本文内容
摘要
摘要
脑卒中是全球范围内导致死亡或慢性残疾的主要原因。然而，目前最佳的治疗方法仅限于缺血性脑卒中急性期的再灌注治疗。为了深入了解脑卒中的病理生理机制并开发创新的治疗策略，体内啮齿类动物脑卒中模型发挥着基础性作用。基因修饰动物的广泛应用尤其推动了小鼠作为实验性脑卒中模型的使用。
在脑卒中患者中，大脑中动脉（MCA）闭塞是一种常见现象。因此，最常用的实验模型是采用经腔内闭塞MCA的方法，这是一种无需开颅的微创技术。该操作包括将单丝线从颈外动脉（ECA）插入，并经颈内动脉（ICA）推进，直至到达MCA的分叉处。在动脉闭塞45分钟后，撤出单丝线以实现再灌注。整个过程中通过监测脑血流量，以确认闭塞期间血流减少及再灌注后血流恢复的情况。神经功能和组织学结局则通过行为学测试和磁共振成像（MRI）检查进行评估。
引言
根据世界卫生组织（WHO）的数据，脑卒中是一种严重的疾病，每年在全球范围内影响约1500万人。大约三分之一的患者死于该疾病，另有三分之一的患者出现永久性残疾。脑卒中是一种复杂的病理过程，涉及多种细胞类型，如神经细胞和外周免疫细胞、血管系统以及全身性反应1。脑卒中在系统层面引发的复杂反应网络目前尚无法通过体外（in vitro）模型完全复制。因此，实验性动物模型对于深入研究该疾病的发病机制以及开发和测试新疗法至关重要。目前，早期组织再灌注是唯一获批的干预手段，可通过组织型纤溶酶原激活物（tPA）溶栓治疗或血管内取栓术实现1。
大脑中动脉（MCA）闭塞在卒中患者中较为常见。因此，短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAo）的啮齿类动物模型最初在大鼠中建立2,3,4如今，转基因小鼠是实验性脑卒中模型中最常用的动物。本研究中，我们描述了一种小鼠经腔内大脑中动脉阻塞（tMCAo）的微创模型。该方法通过以下步骤实施 通过 颈部水平的颈动脉，无需开颅。
阻塞持续时间是决定缺血性病灶范围的关键因素。即使是10分钟的短暂阻塞，也可能导....
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方案
动物实验遵循加泰罗尼亚和西班牙法律（Real Decreto 53/2013）以及欧洲指令，并经巴塞罗那大学动物实验伦理委员会（Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA）和加泰罗尼亚自治区地方监管机构批准。本研究的报告符合ARRIVE指南要求。该操作适用于8周龄及以上成年小鼠，无年龄上限。本文提供的手术操作示例使用的是10至12周龄的C57BL/6小鼠。应考虑不同小鼠品系之间的解剖学差异。
1. 动物准备
- 开始手术操作前，收集并灭菌所有所需材料和工具。将所有必要的手术材料（见材料表）放置于手术台上。
- 使用异氟烷吸入麻醉，混合氧气与一氧化二氮（30%/70%）对动物进行麻醉。
- 皮下注射布托啡诺（见材料表），剂量为0.05 mg/kg体重，以提供镇痛作用，缓解可能的疼痛与不适。
注意：镇痛为必需步骤，但可接受不同方案。术后数日内必须持续监测MCAo后的疼痛与不适症状（见步骤4）。必要时采取纠正措施。 - 将动物置于麻醉诱导箱（见材料表）中，使用5%异氟烷，直至达到深度麻醉状态（足部穿刺反射和眼睑反射消失）。
- 将小鼠置于手术台上，通过面罩将异氟烷浓度下调至1.5%。涂抹兽用眼膏，防止术中角膜干燥....
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结果
评估tMCAo手术结果有多种方法。体内神经影像学技术（MRI）和行为学检测在此被采用。
小鼠脑部会出现缺血性病灶，主要影响同侧大脑中动脉（MCA）供血区域，如纹状体和背外侧皮层。目前有多种方法可用于确定病灶范围，包括2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）组织染色、组织学染色（苏木精/伊红、醋酸硫堇）以及 体内 神经影像学技术，如 MRI。此处选择 MRI 是因其具有非侵入性，且可对同一组织进行其他研究，从而对每只小鼠的病灶进行全面评估。此外，MRI 能够在同一批动物中进行多次测量，提高结果的可重复性，并通常减少研究所需的动物数量。
在MRI扫描过程中采用相同的异氟烷麻醉方案（诱导浓度5%，维持浓度1.5%）。为评估病灶体积，使用快速T2加权序列（T2w turbo RARE快速自旋回波）9，以尽量缩短动物处于麻醉状态的时间，这一点在对同一批小鼠进行多次时间点的纵向MRI研究时尤为重要。该方法可在同一动物体内动态评估病灶随时间的变化，广泛应用于神.......
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讨论
血管内线栓法tMCAo是基础研究中最为常用的一种具有再灌注的局灶性脑缺血动物模型。目前，小鼠因其存在多种基因修饰品系而成为首选的实验动物模型。然而，必须认识到基因修饰小鼠及其遗传背景可能影响脑部血管分布。不同动脉供血区域之间侧支循环和吻合支的存在会显著影响实验操作的结果11。
在进行该操作时，必须考虑某些关键要点。损伤可能发生在大脑中动脉（MCA）供血区域以外的部位，影响海马、丘脑或下丘脑等区域，通常由后交通动脉闭塞所致。此外，尽管手术过程看似成功，仍有少数小鼠可能未表现出明显的梗死灶。
手术过程中需要监测多个变量。脑损伤的发生直接取决于脑血流量（CBF）下降的程度及其持续时间5,12。为了在手术过程中追踪CBF，并评估阻塞期间及再灌注后的血流变化，强烈建议使用如LDF（激光多普勒血流仪）或激光散斑血流成像系统13<.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
由资助号 PID2020-113202RB-I00 资助，该资助由 科学与创新部 （MCIN）西班牙国家研究局 （AEI）， 西班牙政府/10.13039/501100011033 和 "欧洲区域发展基金（ERDF）。共建欧洲之路"NCC 和 MAR 获得了由 MCIN/AEI/10.13039/501100011033 资助的博士前奖学金（编号分别为 PRE2021-099481 和 PRE2018-085737）以及由 "欧洲社会基金（ESF）投资于您的未来". 我们感谢 Francisca Ruiz-Jaén 和 Leonardo Márquez-Kisinousky 提供的技术支持。感谢巴塞罗那奥古斯特·皮·苏尼耶生物医学研究所（IDIBAPS）磁共振成像设施的支持。加泰罗尼亚政府的加泰罗尼亚研究中心（CERCA）计划为 IDIBAPS 提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6/0 缝合线 | Arago | 血管结扎 | |
| 带弯针的 6/0 缝合线 | Arago | 皮肤缝合 | |
| 9 mg/mL 生理盐水 | Fresenius Kabi | CN616003 EC | 用于水化 |
| 麻醉系统 | SurgiVet | ||
| 钝性牵开器，1 mm 宽 | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| 布托啡诺 | Buprex | 用于镇痛 | |
| 持夹钳 | Fine Science Tools | S&T CAF4 | |
| 杜蒙微型镊 | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| 镊子 | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| 胶水 | Loctite | 用于将激光多普勒血流仪探头粘附于颅骨 | |
| 握力计 | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| 异氟烷 | B-Braun | CN571105.8 | |
| 激光多普勒血流仪（Perimed） | Perimed | Periflux System 5000 | |
| 激光多普勒探头固定器 | Perimed | PH 07-4 | |
| 医用胶带 | |||
| 磁共振成像磁体 | Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany | BioSpec 70/30 水平动物扫描仪 | |
| 带剪刀的持针器 | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| 尼龙细丝 | Doccol | 701912PK5Re | |
| 带加热垫的恢复笼 | |||
| 手术剪刀 | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| 小血管电凝器套件 | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| 体视显微镜与冷光源 | Leica | M60 | |
| 打结镊 | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| 恒温器、直肠探头和小鼠垫 | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| 万纳斯弹簧剪刀（4 mm 刃口） | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| 血管夹 | Fine Science Tools | 00396-01 |
参考文献
- Siddiqi, A. Z., Wadhwa, A. Treatment of acute stroke: current practices and future horizons. Cardiovascular Revascularization Medicine. 49, 56-65 (2023).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M.
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重印与许可
