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方法文章

短暂性大脑中动脉闭塞卒中模型

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DOI：

10.3791/65857

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2023年8月11日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Institute for Biomedical Research of Barcelona (IIBB), Spanish National Research Council (CSIC)

本文内容

摘要

本方案描述了通过大脑中动脉腔内阻塞建立小鼠短暂性局灶性脑缺血模型的方法。此外，还展示了使用磁共振成像和行为学测试进行结果评估的示例。

摘要

脑卒中是全球范围内导致死亡或慢性残疾的主要原因。然而，目前最佳的治疗方法仅限于缺血性脑卒中急性期的再灌注治疗。为了深入了解脑卒中的病理生理机制并开发创新的治疗策略，体内啮齿类动物脑卒中模型发挥着基础性作用。基因修饰动物的广泛应用尤其推动了小鼠作为实验性脑卒中模型的使用。

在脑卒中患者中，大脑中动脉（MCA）闭塞是一种常见现象。因此，最常用的实验模型是采用经腔内闭塞MCA的方法，这是一种无需开颅的微创技术。该操作包括将单丝线从颈外动脉（ECA）插入，并经颈内动脉（ICA）推进，直至到达MCA的分叉处。在动脉闭塞45分钟后，撤出单丝线以实现再灌注。整个过程中通过监测脑血流量，以确认闭塞期间血流减少及再灌注后血流恢复的情况。神经功能和组织学结局则通过行为学测试和磁共振成像（MRI）检查进行评估。

引言

根据世界卫生组织（WHO）的数据，脑卒中是一种严重的疾病，每年在全球范围内影响约1500万人。大约三分之一的患者死于该疾病，另有三分之一的患者出现永久性残疾。脑卒中是一种复杂的病理过程，涉及多种细胞类型，如神经细胞和外周免疫细胞、血管系统以及全身性反应1。脑卒中在系统层面引发的复杂反应网络目前尚无法通过体外（in vitro）模型完全复制。因此，实验性动物模型对于深入研究该疾病的发病机制以及开发和测试新疗法至关重要。目前，早期组织再灌注是唯一获批的干预手段，可通过组织型纤溶酶原激活物（tPA）溶栓治疗或血管内取栓术实现1。

大脑中动脉（MCA）闭塞在卒中患者中较为常见。因此，短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAo）的啮齿类动物模型最初在大鼠中建立2,3,4如今，转基因小鼠是实验性脑卒中模型中最常用的动物。本研究中，我们描述了一种小鼠经腔内大脑中动脉阻塞（tMCAo）的微创模型。该方法通过以下步骤实施 通过 颈部水平的颈动脉，无需开颅。

阻塞持续时间是决定缺血性病灶范围的关键因素。即使是10分钟的短暂阻塞，也可能导致选择性神经元死亡，而无明显梗死；而持续时间更长的阻塞（通常为30至60分钟）则会导致不同程度的脑梗死。与供应皮层且具有侧支循环的MCA近端和远端分支不同，供应纹状体的豆纹动脉缺乏侧支循环5。因此，在tMCAo后，纹状体的血流减少程度大于皮层。因此，30分钟或更短时间的阻塞通常仅影响纹状体，而不影响皮层；而45分钟以上的较长阻塞则常在包括纹状体和背外侧皮层在内的整个MCA供血区域产生缺血性病灶。

为确保小鼠的健康，我们在操作前给予镇痛剂，并在手术过程中使用麻醉。然而，麻醉可能会对小鼠的生理状态产生人为干扰，从而影响某些结局指标6。当由经验丰富的操作人员实施时，诱导大脑中动脉闭塞（MCAo）的手术干预通常持续约15分钟。随后，总的麻醉时间取决于闭塞持续的时间。对于需要尽量减少麻醉时间的实验，可采用一种替代方案：在闭塞期间停止麻醉，仅在插入和撤出阻塞大脑中动脉的线栓相关的手术步骤中使用麻醉。该方法可缩短麻醉持续时间，最大限度地减少麻醉对实验模型可能产生的干扰效应7,8。因此，本研究介绍了一种通过血管内闭塞大脑中动脉诱导短暂性局灶性脑缺血的方法，包含两种模式：一种是在整个闭塞期间保持小鼠处于麻醉状态，另一种是在闭塞期间让小鼠清醒。无论采用哪种方式，均应与缺血小鼠的干预操作平行地实施假手术对照。此外，还提供了再灌注后不同时间点通过行为学测试和磁共振成像（MRI）评估结局的数据。最后，讨论了实施该实验操作时需要考虑的主要因素。

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方案

动物实验遵循加泰罗尼亚和西班牙法律（Real Decreto 53/2013）以及欧洲指令，并经巴塞罗那大学动物实验伦理委员会（Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA）和加泰罗尼亚自治区地方监管机构批准。本研究的报告符合ARRIVE指南要求。该操作适用于8周龄及以上成年小鼠，无年龄上限。本文提供的手术操作示例使用的是10至12周龄的C57BL/6小鼠。应考虑不同小鼠品系之间的解剖学差异。

1. 动物准备

  1. 开始手术操作前，收集并灭菌所有所需材料和工具。将所有必要的手术材料（见材料表）放置于手术台上。
  2. 使用异氟烷吸入麻醉，混合氧气与一氧化二氮（30%/70%）对动物进行麻醉。
  3. 皮下注射布托啡诺（见材料表），剂量为0.05 mg/kg体重，以提供镇痛作用，缓解可能的疼痛与不适。
    注意：镇痛为必需步骤，但可接受不同方案。术后数日内必须持续监测MCAo后的疼痛与不适症状（见步骤4）。必要时采取纠正措施。
  4. 将动物置于麻醉诱导箱（见材料表）中，使用5%异氟烷，直至达到深度麻醉状态（足部穿刺反射和眼睑反射消失）。
  5. 将小鼠置于手术台上，通过面罩将异氟烷浓度下调至1.5%。涂抹兽用眼膏，防止术中角膜干燥。
  6. 使用连接加热垫的直肠探头（见材料表）将体温维持在37 ± 0.5 °C。
  7. 使用电动剃刀剃除颈部腹侧及头部（颅骨）的毛发。仔细清除毛发残渣，并用含碘消毒剂和70%酒精以环形方式对皮肤区域进行三次消毒。
    .

2. 采用激光多普勒血流仪（LDF）评估脑血流量（CBF）

  1. 使用剪刀沿矢状缝方向，从耳部至两眼之间区域，在头部皮肤上做一切口。
  2. 牵开皮肤，并去除颅骨右侧的骨膜。
  3. 找到坐标位置（冠状缝外侧 2.5 mm），使用氰基丙烯酸酯将多普勒探头固定器（参见材料表）固定。待胶水干燥后，连接多普勒探头，并检查信号读数是否正确。

3. 短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAo）

  1. 将小鼠翻转至仰卧位，并用医用胶带将其固定在手术台上。
  2. 在颈部做一正中切口。使用拉钩将皮肤和唾液腺向两侧牵开（参见 材料表以暴露颈动脉区域。
  3. 识别颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）的血管解剖结构，以及由它们发出的各分支动脉（上颌动脉和舌动脉、甲状腺上动脉、枕动脉及蝶腭动脉）图1A).
  4. 将主要动脉从周围的结缔组织上分离，以便进行操作。
    注意：需特别小心，避免损伤神经，尤其是与颈总动脉（CCA）平行走行的迷走神经。
  5. 用6-0丝线缝合（参见 材料表在上颌/舌侧分叉处围绕ECA结扎，牢固打结以永久阻断血流。
  6. 在第一结与颈总动脉分叉之间，用第二根缝线再次环绕同一动脉，并保持该结松弛。
  7. 在颈总动脉（CCA）上放置第三根线，并打一个易于解开的滑结。
    注意：也可使用血管夹完成此操作，但缝线可提供更大的活动性和灵活性。在此阶段，激光多普勒血流仪（LDF）信号中可观察到脑血流量（CBF）的首次下降。
  8. 放置一个血管夹（参见 材料表中断颈内动脉（ICA）的血流。
  9. 在ECA上靠近结扎处的位置做一个小切口。
  10. 将单丝插入，直至其厚涂层完全进入动脉管腔。
  11. 收紧第二个结，以固定单丝线在动脉内，防止血液压力将其推出图1B).
  12. 移除颈内动脉上的血管夹。
  13. 在第一个结下方切断颈外动脉，并旋转残端使其方向与颈内动脉一致（图1C).
  14. 推进单丝纤维 通过 颈内动脉直至大脑中动脉分叉处。
    注意：阻塞成功会在激光多普勒血流仪（LDF）读数中表现为血流量突然下降。当脑血流量（CBF）较基础值下降超过70%时，视为阻塞成功。若无法进行脑血流量测量，可通过推进时遇到的阻力判断阻塞位置，在成年小鼠中，该位置通常位于颈总动脉（CCA）分叉处约11 mm处。
    1. 若在阻塞期间持续麻醉，需监测小鼠并在其恢复期间持续观察45分钟。
    2. 若小鼠在闭塞期间苏醒，用数针缝合颈部皮肤。在不拆卸激光多普勒血流仪探头的情况下，将小鼠放入温控箱中，使其从麻醉状态恢复。
      注意：在此期间，小鼠常出现自发性转圈行为，表明闭塞成功。
    3. 40分钟后，按照1.4、1.5和1.7步骤中所述的相同麻醉和消毒程序，再次对小鼠进行麻醉。 将其放回手术台，并拆除颈部的缝线。
  15. 缺血45分钟后，松开固定单丝线的结。缓慢轻柔地拉动尼龙丝，并确认组织再通发生。
  16. 拉出灯丝并扎紧结以防止失血。
  17. 解开CCA结。确保动脉壁无损伤。
  18. 移除牵开器，复位肌肉、腺体和皮肤。用6-0缝线缝合皮肤，并涂抹消毒剂。
  19. 断开多普勒探头并取下固定器。缝合并消毒头部皮肤。
  20. 在麻醉恢复期间，将小鼠置于配备加热装置的笼子中以维持体温。需持续观察，直至小鼠完全从麻醉状态中恢复。恢复后，可将小鼠放回其原有笼具中。
    ​注意：强烈建议采用社交环境丰富的饲养方式。然而，为防止攻击行为，切勿将手术后小鼠与未手术小鼠同笼饲养，除非采取物理隔离措施。

4. 术后护理

  1. 根据当地法规规定的程序和要求，定期对动物进行监管。按照适当的时间表给予镇痛治疗，以尽量减轻术后疼痛。
    注意：在本研究中，术后6小时和24小时给予与干预开始时相同的镇痛药（布托啡诺 0.05 mg/kg 体重）。
  2. 当监管参数表明需要实施安乐死时，应遵循机构批准的方案进行。
  3. 每天监测动物体重。术后最初几天为动物提供软质食物。此外，术后立即通过皮下注射生理盐水（200 µL）对动物进行补水，并在之后根据需要定期补充，特别是当观察到小鼠未能自行充分饮水时。将食物和水放置在动物易于接触的位置。
  4. 一旦 体内 研究完成后，对小鼠实施麻醉，处死，并取出脑组织以进行进一步的组织病理学分析（如需要）。

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结果

评估tMCAo手术结果有多种方法。体内神经影像学技术（MRI）和行为学检测在此被采用。

小鼠脑部会出现缺血性病灶，主要影响同侧大脑中动脉（MCA）供血区域，如纹状体和背外侧皮层。目前有多种方法可用于确定病灶范围，包括2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）组织染色、组织学染色（苏木精/伊红、醋酸硫堇）以及 体内 神经影像学技术，如 MRI。此处选择 MRI 是因其具有非侵入性，且可对同一组织进行其他研究，从而对每只小鼠的病灶进行全面评估。此外，MRI 能够在同一批动物中进行多次测量，提高结果的可重复性，并通常减少研究所需的动物数量。

在MRI扫描过程中采用相同的异氟烷麻醉方案（诱导浓度5%，维持浓度1.5%）。为评估病灶体积，使用快速T2加权序列（T2w turbo RARE快速自旋回波）9，以尽量缩短动物处于麻醉状态的时间，这一点在对同一批小鼠进行多次时间点的纵向MRI研究时尤为重要。该方法可在同一动物体内动态评估病灶随时间的变化，广泛应用于神...

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讨论

血管内线栓法tMCAo是基础研究中最为常用的一种具有再灌注的局灶性脑缺血动物模型。目前，小鼠因其存在多种基因修饰品系而成为首选的实验动物模型。然而，必须认识到基因修饰小鼠及其遗传背景可能影响脑部血管分布。不同动脉供血区域之间侧支循环和吻合支的存在会显著影响实验操作的结果11。

在进行该操作时，必须考虑某些关键要点。损伤可能发生在大脑中动脉（MCA）供血区域以外的部位，影响海马、丘脑或下丘脑等区域，通常由后交通动脉闭塞所致。此外，尽管手术过程看似成功，仍有少数小鼠可能未表现出明显的梗死灶。

手术过程中需要监测多个变量。脑损伤的发生直接取决于脑血流量（CBF）下降的程度及其持续时间5,12。为了在手术过程中追踪CBF，并评估阻塞期间及再灌注后的血流变化，强烈建议使用如LDF（激光多普勒血流仪）或激光散斑血流成像系统13<...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

由资助号 PID2020-113202RB-I00 资助，该资助由 科学与创新部 （MCIN）西班牙国家研究局 （AEI）， 西班牙政府/10.13039/501100011033 和 "欧洲区域发展基金（ERDF）。共建欧洲之路"NCC 和 MAR 获得了由 MCIN/AEI/10.13039/501100011033 资助的博士前奖学金（编号分别为 PRE2021-099481 和 PRE2018-085737）以及由 "欧洲社会基金（ESF）投资于您的未来". 我们感谢 Francisca Ruiz-Jaén 和 Leonardo Márquez-Kisinousky 提供的技术支持。感谢巴塞罗那奥古斯特·皮·苏尼耶生物医学研究所（IDIBAPS）磁共振成像设施的支持。加泰罗尼亚政府的加泰罗尼亚研究中心（CERCA）计划为 IDIBAPS 提供资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6/0 缝合线 Arago血管结扎
带弯针的 6/0 缝合线Arago皮肤缝合
9 mg/mL 生理盐水Fresenius KabiCN616003 EC用于水化
麻醉系统SurgiVet
钝性牵开器，1 mm 宽Fine Science Tools18200-09
布托啡诺Buprex用于镇痛
持夹钳Fine Science ToolsS&T CAF4
杜蒙微型镊Fine Science ToolsM3S 11200-10
镊子Fine Science Tools91106-12
胶水Loctite用于将激光多普勒血流仪探头粘附于颅骨
握力计IITC Life Science Inc.#2200
异氟烷B-BraunCN571105.8
激光多普勒血流仪（Perimed）PerimedPeriflux System 5000
激光多普勒探头固定器PerimedPH 07-4
医用胶带
磁共振成像磁体Bruker BioSpin, Ettlingen, GermanyBioSpec 70/30 水平动物扫描仪 
带剪刀的持针器Fine Science Tools12002-14
尼龙细丝Doccol701912PK5Re
带加热垫的恢复笼
手术剪刀Fine Science Tools91401-12
小血管电凝器套件Fine Science Tools18000-00
体视显微镜与冷光源LeicaM60
打结镊Fine Science Tools18025-10
恒温器、直肠探头和小鼠垫Letica Science InstrumentsLE 13206
万纳斯弹簧剪刀（4 mm 刃口）Fine Science Tools15019-10
血管夹Fine Science Tools00396-01

参考文献

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