从人阴道中组织处理和分离原代成纤维细胞

Summary

该方案展示了一种可靠且有效的技术，可从绝经前或绝经后人类阴道组织中分离原代成纤维细胞。现有的阴道成纤维细胞分离方案没有考虑从衰老组织中分离细胞的挑战。阴道组织是从盆腔器官脱垂手术后的女性获得的。

Abstract

盆腔器官脱垂是一种严重影响女性生活质量的疾病。当肌肉和韧带变弱并导致盆腔器官在骨盆中下降，从而在阴道中形成隆起时，就会发生这种情况。矫正盆腔器官脱垂的手术一直是主要治疗方法。最近，人们对在细胞水平上研究脱垂患者的组织成分越来越感兴趣。

目前关于供体或患者年龄对基于细胞的疗法的影响几乎没有共识。目前公布的阴道成纤维细胞分离方案要么集中在绝经前组织，要么忽略了对供体组织的年龄的评论。大多数现有协议使用动物模型。人体阴道组织的稠度比大多数方案中使用的组织更致密。在这项研究中，人类阴道组织主要来自年长的供体，这可能导致现有方案的失败。

本研究的目的是描述一种可靠获取人阴道成纤维细胞的标准方案，无论供体年龄和更年期状态如何。使用来自接受盆腔器官脱垂手术的 9 名独立供体的组织再现结果。6 例患者为绝经后患者，其中最年长的供体为 78 岁。组织捐献者的中位年龄为 59 岁。

在这里，我们描述了一种可靠的方法，该方法使用酶和机械解离以及来自单个供体的多个阴道活检的细胞悬液混合来生成富含成纤维细胞的单细胞悬液。可靠分离人阴道原代成纤维细胞可能有助于研究盆腔器官脱垂以及微生物组与宿主的相互作用。

Introduction

科学和研究中的性别差异是一个持续存在的问题。对主要影响女性人群的疾病的研究资金不足¹.盆腔器官脱垂是一种与女性密切相关的疾病。当肌肉和韧带变弱并导致盆腔器官在骨盆中下降，从而在阴道中形成隆起时，就会发生这种情况².对这种病理生理学背景下的细胞相互作用知之甚少，也不知道组织水平因素如何影响手术干预的成功³。

原代细胞而不是细胞系被广泛认为对于转化临床研究至关重要，因为它提供了更多的生理相关性⁴。原代细胞直接取自感兴趣的身体组织，可以更准确地模拟 体内生理 学。考虑到关键供体特征，例如年龄和绝经状态，从人阴道中分离原代成纤维细胞可能有助于研究盆腔器官脱垂的生物学机制和疾病建模。

盆腔器官脱垂通常影响老年人或绝经后个体。在研究这种情况时，原代成纤维细胞的分离和增殖具有挑战性，因为老年供体的细胞群和克隆形成能力减少⁵。根据我们的经验，使用先前描述的阴道组织解离方案未能从标准的 1 cm² 组织活检中提取任何成纤维细胞。

通过文献综述，我们发现类似的研究被细分为两组:动物模型，如小鼠⁶，和人类模型 ^7,8。当遵循小鼠方案时，使用剪刀对人类阴道组织进行组织处理导致机械消化不足。使用小鼠组织和其他组织部位⁹ 的方案外推不成功。

大多数使用人类阴道样本的论文都使用了盆腔器官脱垂的绝经前个体的组织 ^7,10。尽管一些论文报告了绝经前和绝经后个体样本的使用¹¹，但它们没有足够详细地描述用于从老年或绝经后供体中成功分离成纤维细胞的方案。使用绝经后组织的成纤维细胞进行分离和疾病建模对于了解盆腔器官脱垂的细胞病理生理学可能至关重要，因为这种情况在绝经后十年内的个体患病率最高¹²。

我们描述了一种使用机械和酶解离相结合从人阴道组织中分离和培养富含成纤维细胞的单细胞悬液的方法。本文介绍了有关如何获取绝经后或衰老人类阴道成纤维细胞的可靠方案。通过使用相差显微镜和免疫荧光 （IF） 的形态学检查确认分离的细胞是成纤维细胞，以评估波形蛋白、 F-肌动蛋白和 α-平滑肌肌动蛋白 （α-SMA） 的表达。

Protocol

阴道组织取自接受盆腔器官脱垂手术的女性。手术后收集的阴道组织被视为废料，否则将被丢弃。该研究是按照机构指南进行的，并获得了马萨诸塞州布莱根将军机构审查委员会的批准。

1. 从患者身上采集阴道组织

1. 通过询问病史并使用盆腔检查结果诊断盆腔器官脱垂:在诊所获得盆腔器官脱垂定量 （POP-Q） 测量值，显示盆腔器官脱垂的证据。
2. 使用以下纳入标准:年满 18 岁;有症状的盆腔器官脱垂史;选择盆腔器官脱垂的手术矫正。
3. 不包括以下内容: 孕妇和拒绝捐献组织的患者。
4. 修剪多余的阴道组织是盆腔器官脱垂手术的必要步骤。在以下手术后，该阴道上皮的总厚度被切除:阴道前缝合术、阴道后缝合术和阴道缝合术。
5. 将组织装在无菌标本采集杯中，使用生理盐水或无血清 DMEM/F12 （Gibco） 培养基运输至实验室。保持在冰上。

2. 组织处理和消化

1. 组织制备
   1. 测量并切割组织以包含阴道上皮的整个厚度，创建大约 1 cm² 的段。
   2. 确保精确测量 1 cm² 的活检大小。
      注意:高估组织活检大小可能会损害组织消化。
   3. 从单个供体准备 2-3 个额外的阴道活检，每个尺寸为 1 cm² ，并将活检放在一边。
2. 机械消解
   1. 将阴道活检置于 10 cm 细胞培养培养皿中。移液管 500-1,000 μL 补充有 100 U/mL 青霉素/链霉素、2.5 μg/mL 两性霉素的无血清培养基，用于阴道组织，以防止组织干燥。
   2. 用两只手用两把无菌手术刀（11 号或 15 号）将阴道组织切成小块。
   3. 确保刀片的尖端垂直于组织表面。使用两把手术刀在组织表面施加相等且稳定的压力。执行交替拉动动作，将组织切成非常小的块。
   4. 使用双手术刀技术重复这种切碎技术，直到样品与 1-2 mm 的碎片保持一致。
      注意:使用这种 1 cm² 活检的双手术刀技术进行机械消化大约需要 15-20 分钟才能完成。
   5. 向板中加入 2-3 mL 补充有 100 U/mL 青霉素/链霉素、2.5 μg/mL 两性霉素 B 的无血清 DMEM/F12 培养基，悬浮切碎的组织。上下移液管含有组织碎片的溶液以打碎任何团块。
3. 酶消化
   1. 将含有组织碎片的溶液转移到 15 mL 锥形管中。将无血清 DMEM/F12 培养基添加到组织培养皿中，将阴道组织切碎，以收集任何残留的组织片段。将含有组织碎片的溶液转移到锥形管中。添加额外的无血清 DMEM/F12 培养基，直到总体积为 10 mL。
   2. 将 5 mg Liberase 溶于 1 mL 无菌水 （5 mg/mL） 中。以 230 μL 等分试样在 -20 °C 下储存长达一个月或 -80 °C 下储存 6 个月。
   3. 向试管中加入 230 μL Liberase（原液 13 U/mL），终浓度为 0.3 U/mL。
      注意:Liberase 活性可能因批次而异。使用前立即使用水浴解冻每个等分试样。避免反复冻融。
   4. 对同一供体的 2-3 个额外阴道活检重复步骤 2.1-2.3。
      注:将包含来自单次活检的组织碎片的每种溶液保存在单独的锥形管中。例如，在 4 根试管中进行 4 次阴道活检。这对于离心后的最佳细胞沉淀非常重要。
   5. 将试管在 37 °C 下孵育 3 小时，并使用样品混合器持续、剧烈搅拌。
   6. 将样品混合器放入 CO₂ 培养箱中。保持持续的激动。（混合器设置示例:25 rpm 旋转运动 5 s，30° 往复（倾斜旋转）5 s，2° 振动（涡旋）运动 3 s）。
   7. 在孵育期间，每隔 30 分钟涡旋试管。
   8. 将样品以 3,000 x g 离心 5 分钟。取出并丢弃上清液。
   9. 将沉淀重悬于 1-2 mL DMEM/F12 培养基中，其中含有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 100 U/mL 青霉素/链霉素、2.5 μg/mL 两性霉素 B 以稀释 Liberase 酶。用力移液，直到沉淀完全重悬。

3. 细胞培养

1. 去除未消化的组织碎片
   1. 将 100 μm 细胞过滤器放在无菌 50 mL 锥形容器上。
   2. 将来自同一供体的多个组织活检的细胞悬液汇集在一起。
   3. 过滤组织/酶悬浮液，用 5 mL 注射器柱塞压穿。重复此步骤，直到剩余的组织碎片似乎被完全压穿。
      注意:阴道组织碎片中可能有一些粘液没有完全通过过滤器。用细胞过滤器丢弃粘液。
2. 细胞培养池
   1. 将来自多个阴道活检（来自同一供体）的混合细胞悬液铺在培养皿 （60 mm x 15 mm） 上。
   2. 将培养皿在 CO₂ 培养箱中于 37 °C 孵育过夜。
   3. 用相差显微镜观察并确认非贴壁细胞的存在。
   4. 确保显微镜的焦点位于板的底部。
      注意:前台可能有许多免疫细胞。少量成纤维细胞将附着在板的底部。
   5. 在更换细胞培养基之前等待 18-24 小时，以确保足够的细胞粘附性。
   6. 每三天更换一次培养基，直到发生 80% 汇合。当细胞汇合度达到 80-90% 时，扩增至更大的培养瓶或冷冻等分试样的细胞以备将来使用。

Results

从 10 例接受盆腔器官脱垂手术的独立供体中收集阴道组织。使用所描述的方案，从人阴道组织中分离细胞。细胞群具有特征性的细长、扁平和纺锤形外观。与其他研究一样，我们观察到随着供体年龄的增加，成纤维细胞的细胞倍增能力显着减慢，克隆形成能力降低。当比较从老年人 （75-78 岁） 分离的成纤维细胞与从年轻人 （35-47 岁） 分离的成纤维细胞时，这些差异很明显。来自中年供体的细胞表现出中等特征 （56-61 岁）。细胞增殖速率最初通过使用具有相同已知接种密度的相差显微镜直接观察来估计。

图 1:协议的图解表示。请单击此处查看此图的较大版本。

图 1 显示了解离和隔离协议的图示表示。按照这些步骤，该方案在十分之九的供体中产生了 90% 的原代成纤维细胞分离成功率，这些供体的细胞数量足以允许传代培养细胞。捐献者的中位年龄为 59 岁。

协议 （作者，年份）	原始方案的供体组织	捐助者数量	供体年龄（岁）	获得的成纤维细胞	形态学
Ruiz-Zapata等人，2013 年	人类阴道	3	56-78	不	不适用
Khan 等人，2016 年	鼠耳和鼠尾	2	48-65	不	不适用
Waise等人，2019 年	人体组织	3	56-75	不	不适用
Nadalutti 等人，2020 年	人体包皮	1	65	不	不适用
当前	人类阴道	10	35-79	是的	纺锤形

表 1:成功分离人阴道成纤维细胞的方案比较。将不同的现有方案与我们的方案进行比较，并由形态学结果证明。

表 1 显示了本研究中使用其他方案尝试阴道成纤维细胞分离的结果。我们开发了一种从阴道粘膜和老年供体中分离原代成纤维细胞的标准方案⁵。

我们测试了几种已建立的方案，包括 表 1 中列出的方案，并在我们的研究中观察到使用这些方案进行细胞分离没有成功。我们提出了以下限制性原因。

Ruiz 等人3 发表的^{方案涉及刮} 掉筋膜并将组织切成小块。根据我们的经验，很难区分筋膜，尝试刮擦可能会导致细胞产量显着降低。虽然这种方法很简单，但它缺乏关键细节，这限制了它的通用性。此外，该方案中的机械消化似乎不足以用于往往更致密的绝经后组织。

Khan 等人 ⁹ 和 Waise 等人 ¹³ 发表的方案使用剪刀进行组织切碎，与手术刀技术相比，它不会引入显着的多向剪切力。根据我们的经验，剪刀法也没有有效。

最后，使用外植体方法的 Nadalutti 等人 ¹⁴ 方案在我们手中没有成功产生成纤维细胞。由于绝经后组织的性质，这种方法可能不太有效，可能需要更积极的机械和酶加工才能成功解离成纤维细胞。

图 2:第 0 天悬浮细胞的相差图像。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2 显示了使用我们的方案在第 0 天的悬浮细胞。

图 3:培养第 14 天阴道原代成纤维细胞的相差图像，放大 100 倍，来自三个 1 cm² 组织活检的混合细胞悬液。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3 显示了 100 倍放大的原代成纤维细胞，该细胞悬液由 3 个尺寸为 1 cm² 的组织活检组成。

如前所述，通过免疫荧光技术研究成纤维细胞身份，并进行了细微的修改。为了验证原代阴道细胞的细胞来源，我们通过免疫荧光染色使用了成纤维细胞来源的特异性生物标志物。根据绝经前和绝经后组织样本中波形蛋白（图 4）、F-肌动蛋白和 α-SMA 的阳性染色，将细胞鉴定为成纤维细胞（图 5）。成纤维细胞培养至扩增，具有高活力 （>90%） 用于实验。

图 4:阴道成纤维细胞波形蛋白阳性染色。 对分离的绝经前和绝经后组织原代成纤维细胞进行 IF 分析，并以 200 倍放大倍率拍摄图像。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5:阴道成纤维细胞的 F-肌动蛋白和 α-SMA 阳性染色。 蛋白表达结果与 IgG 对照相比。图像以 200 倍放大倍率收集。 请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

许多以前的研究都报道了如何从人阴道中分离原代成纤维细胞 ^3,7。几项研究使用了盆腔器官脱垂绝经前个体的人类阴道组织。尽管一些论文报道了绝经前和绝经后个体组织的使用^7,11，^但它们没有足够详细地描述用于从老年或绝经后供体中成功分离成纤维细胞的方案。生殖器脱垂的绝经后妇女的阴道壁比绝经前妇女更厚，这可能是该人群隔离难度增加的原因¹³。与绝经后供体成功分离对于疾病建模和调查至关重要，因为盆底疾病在绝经后或老年人群中最为普遍。

我们建立了一个方案，以成功且持续地从 35-78 岁的供体中收获和培养人阴道成纤维细胞。原代阴道细胞的细胞来源通过免疫荧光染色通过成纤维细胞来源的生物标志物证实。

此处介绍的人阴道成纤维细胞分离程序能够分离和培养原代成纤维细胞。根据我们的经验，在这项研究中，使用先前发表的动物⁹和人类^3、14、16 组织解离原代细胞的方案未能从人类阴道样本中提取任何成纤维细胞¹⁴。

我们假设了细胞从人类阴道组织解离挑战的两个可能原因:（1） 老年供体的粘膜真皮厚度更大，与老年供体的非粘膜组织相比^13,17 使细胞解离更加困难和 （2） 老年人成纤维细胞的密度可能显着降低¹⁷。

鉴于这些挑战，该协议中的一些关键步骤不应修改。第一个关键步骤是实施非常严格的机械消解。在这里，我们使用双手术刀技术。根据我们的经验，用剪刀代替组织切碎不会产生足够小的片段来将成纤维细胞从人体阴道组织中解离。

另一个关键步骤是合并细胞悬液和合并来自单个供体的 3-4 个全层活检 （1 cm²）。这对于获得足够的细胞进行持续培养是必要的。在所有情况下，我们收获的组织明显超过 1 cm² ，因为多余的阴道上皮被修剪为盆腔器官脱垂手术的必要部分。在这项研究中，我们只混合了来自同一供体的细胞悬液，因为我们试图研究和区分不同供体之间的细胞特征和增殖。

我们的方案有一个明显的优势:机械和酶消化可以提高绝经后组织的产量，但不会对绝经前样品产生负面影响。

我们承认我们的协议存在一些限制。在未进行阴道脱垂手术的情况下，进入人体阴道组织可能具有挑战性。需要混合多个组织活检样本的细胞悬液也可能是一个限制。

总之，这种获取人阴道成纤维细胞的方案将成为未来盆底疾病研究的有用工具，尤其是在绝经后个体中，也是女性健康研究的重要补充。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
两性霉素 B	Bio Techne	B23192
细胞过滤器 （100 &μ;m）	ThermoFisher Scientific	22363549
锥形离心管 （15 mL）	Fisher Scientific	14-959-53A
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320033
羽毛一次性手术刀 No. 15	Socorex	FB.15
胎牛血清	Sigma Aldrich	NC1983075
高透明度锥形离心管 （50 mL）	Fisher Scientific	14-432-22
HulaMixer 样品混合器	ThermoFisher Scientific	15920D
人纤连蛋白 DuoSet ELISA	R&D Systems	DY1918-05
人前胶原蛋白 I α 1 DuoSet ELISA	R&D Systems	DY6220-05
Liberase 研究级	Sigma Aldrich	05 401 119 001
青霉素/链霉素 （5000U/ml）	ThermoFisher Scientific	15070063
皿，聚苯乙烯 （100 mm x 20 mm）	Millipore Sigma	P5606
血清移液管 （10 mL）	ThermoFischer Scientific	170356N
无菌注射器 （5 mL）	Fischer Scientific	14-955-458