本方案展示了一种可靠且有效的方法，用于从绝经前或绝经后的人类阴道组织中分离原代成纤维细胞。现有的阴道成纤维细胞分离方案未考虑从衰老组织中进行细胞分离所面临的挑战。阴道组织来源于接受盆腔器官脱垂手术后的女性。
本文内容
摘要
摘要
盆腔器官脱垂是一种严重影响女性生活质量的疾病。当盆底肌肉和韧带变弱时，盆腔器官会下移至较低的骨盆位置，导致阴道内出现膨出。 手术是治疗盆腔器官脱垂的主要方法。近年来，人们对在细胞水平上研究脱垂患者组织构成的兴趣日益增加。
目前，关于供体或患者年龄对细胞治疗影响的研究尚无明确共识。现有的阴道成纤维细胞分离方案大多集中于围绝经期前组织，或未对供体组织的年龄进行说明。大多数现有方案使用动物模型，而人类阴道组织的质地比这些方案中常用的组织更为致密。本研究中的人类阴道组织主要来自年长供体，这可能是导致现有方案失败的主要原因。
本研究的目的是描述一种标准方案，用于可靠地获取人阴道成纤维细胞，且不受供体年龄和绝经状态的影响。该结果通过来自九位接受盆腔器官脱垂手术的不同供体的组织重复验证。其中六位患者为绝经后女性，年龄最大的供体为78岁。组织供体的中位年龄为59岁。
本文介绍了一种可靠的方法，通过结合酶消化与机械解离，并汇集来自同一供体的多个阴道活检样本的细胞悬液，从而制备富含成纤维细胞的单细胞悬液。可靠地分离人阴道原代成纤维细胞，可能有助于盆腔器官脱垂以及微生物组-宿主相互作用的研究。
引言
科学与研究领域中的性别差异是一个持续存在的问题。主要影响女性群体的疾病研究长期面临资金不足的困境1。盆腔器官脱垂是一种与女性性别密切相关的疾病，当盆底肌肉和韧带变弱时，盆腔器官会下移至骨盆更低的位置，导致阴道内出现膨出2。目前对于该病理生理过程中细胞间的相互作用知之甚少，也不清楚组织层面的因素如何影响手术干预的效果3。
相较于细胞系，原代细胞因其更接近生理相关性，被广泛认为在转化临床研究中至关重要4。原代细胞直接取自目标机体组织，能够更精确地模拟体内（in vivo）生理状态。考虑到供体年龄和绝经状态等关键特征，从人类阴道组织中分离原代成纤维细胞，可能有助于盆腔器官脱垂的生物学机制研究及疾病模型构建。
盆腔器官脱垂常见于老年人群或绝经后个体。由于老年供体的细胞数量减少且克隆形成能力下降，分离和扩增原代成纤维细胞以研究该疾病具有较大挑战性5。根据我们的经验，采用既往报道的阴道组织解离方案，无法从标准的1 cm2组织活检样本中提取出任何成纤维细胞。
通过文献回顾，我们发现类似研究可分为两类：动物模型（如小鼠模型6）和人类模型7,8。在遵循小鼠实验方案时，使用剪刀对人阴道组织进行组织处理，无法实现充分的机械消化。将基于小鼠组织及其他组织部位的实验方案外推应用时也未能成功9。
大多数使用人类阴道样本的研究采用了来自患有盆腔器官脱垂的围绝经期个体的组织7,10。尽管少数研究报道了同时使用围绝经期和绝经后个体的样本11，但并未详细描述从年龄较大或绝经后供体成功分离成纤维细胞所采用的方案。由于盆腔器官脱垂在绝经后十年内的个体中患病率最高12，因此利用绝经后组织来源的成纤维细胞进行细胞分离和疾病建模，对于理解该疾病的细胞病理生理机制可能至关重要。
我们介绍一种利用机械和酶解离解相结合的方法，从人类阴道组织中分离和培养富含成纤维细胞的单细胞悬液。本文描述了一种可靠的方案，用于获取绝经后或衰老的人类阴道成纤维细胞。通过相差显微镜进行形态学观察以及免疫荧光（IF）检测波形蛋白、F-肌动蛋白和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达，确认所分离的细胞为成纤维细胞。
方案
阴道组织取自接受盆腔器官脱垂手术的女性。手术后收集的阴道组织被视为废弃材料，否则将被丢弃。本研究遵循机构指南，并已获得麻省总医院布莱根分院机构审查委员会的批准。
1. 患者阴道组织的采集
- 通过采集病史并结合盆腔检查结果诊断盆腔器官脱垂：在门诊进行盆腔器官脱垂定量（Pelvic Organ Prolapse Quantification, POP-Q）测量，以确认盆腔器官脱垂的存在。
- 采用以下纳入标准：年龄超过18岁；有症状性盆腔器官脱垂病史；选择接受盆腔器官脱垂手术治疗。
- 排除以下情况：孕妇及拒绝捐献组织的患者。
- 修剪多余的阴道组织，作为盆腔器官脱垂手术的必要步骤。在以下手术后，将全层切除该阴道上皮组织：前壁阴道修补术、后壁阴道修补术和阴道封闭术。
- 将组织置于无菌标本采集杯中，加入生理盐水或无血清DMEM/F12（Gibco）培养基，运送至实验室，并保持冰上运输。
2. 组织处理与消化
- 组织准备
- 测量并切割组织，确保包含阴道上皮的全层厚度，制备成约 1 cm2 的组织片段。
- 精确测量活检组织的大小为 1 cm2。
注意：高估组织活检尺寸可能影响组织消化效果。 - 从同一供体额外准备 2–3 份大小为 1 cm2 的阴道活检组织，并将其暂存备用。
- 机械消化
- 将阴道活检组织置于一个 10 cm 的细胞培养培养皿中。加入 500–1,000 µL 无血清培养基，其中添加 100 U/mL 青霉素/链霉素和 2.5 µg/mL 两性霉素 B，覆盖阴道组织以防止其干燥。
- 使用两把无菌手术刀（No. 11 或 No. 15），双手操作将阴道组织切成小碎片。
- 确保刀片尖端垂直于组织表面，用两把手术刀对组织表面施加均匀且稳定的压力，交替进行拉切动作，将组织切割成非常小的碎片。
- 重复使用双刀法进行切碎，直至样品形成大小均一的 1–2 mm 碎片。
注意：使用双刀法对 1 cm2 活检组织进行机械消化，通常需要约 15–20 分钟完成。 - 向培养皿中加入 2–3 mL 无血清 DMEM/F12 培养基，其中添加 100 U/mL 青霉素/链霉素和 2.5 µg/mL 两性霉素 B，使切碎的组织悬浮。用移液器反复吹打含有组织碎片的溶液，以打散任何团块。
- 酶消化
- 将含有组织碎片的溶液转移至一个 15 mL 圆锥形离心管中。向曾用于切碎阴道组织的细胞培养皿中加入无血清 DMEM/F12 培养基，以收集残留的组织碎片。将该溶液也转移至同一离心管中。继续添加无血清 DMEM/F12 培养基，直至总体积达到 10 mL。
- 将 5 mg Liberase 溶解于 1 mL 无菌水中（终浓度为 5 mg/mL）。分装为 230 µL 每份，于 −20 °C 保存可使用一个月，或于 −80 °C 保存六个月。
- 向离心管中加入 230 µL Liberase（储存液浓度为 13 U/mL），使其终浓度为 0.3 U/mL。
注意：Liberase 的酶活性可能因批次而异。每次使用前应立即在水浴中解冻，避免反复冻融。 - 对同一供体的另外 2–3 份阴道活检组织重复步骤 2.1–2.3。
注意：每份来自单个活检组织的含组织碎片溶液应分别置于不同的离心管中。例如，4 份阴道活检组织应分装在 4 个离心管中。这对于离心后获得最佳的细胞沉淀至关重要。 - 将离心管在 37 °C 条件下孵育 3 小时，同时使用样品混合器持续剧烈振荡。
- 将样品混合器置于 CO2 培养箱内，保持持续振荡。（样品混合器设置：每 5 秒进行 25 rpm 的旋转运动，每 5 秒进行 30° 的往复（倾斜旋转）运动，每 3 秒进行 2° 的振动（涡旋）运动）。
- 在孵育过程中，每隔 30 分钟涡旋振荡一次离心管。
- 以 3,000 x g 离心 5 分钟。移除并弃去上清液。
- 用 1–2 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素/链霉素和 2.5 µg/mL 两性霉素 B 的 DMEM/F12 培养基重悬沉淀，以稀释 Liberase 酶。剧烈吹打直至沉淀完全重悬。
3. 细胞培养
- 去除未消化的组织碎片
- 将一个100 µm细胞筛置于无菌的50 mL锥形管上方。
- 合并同一供体的多个组织活检样本所得的细胞悬液。
- 将组织/酶混合悬液过筛，并用5 mL注射器活塞压滤。重复此步骤，直至残留的组织碎片几乎全部通过筛网。
注意：阴道组织碎片可能含有部分无法完全通过筛网的黏液。请将黏液与细胞筛一并丢弃。
- 细胞培养合并
- 将来自同一供体的多个阴道活检样本合并后的细胞悬液接种至培养皿（60 mm × 15 mm）中。
- 将培养皿置于37 °C、CO2培养箱中过夜培养。
- 使用相差显微镜观察并确认存在非贴壁细胞。
- 确保显微镜聚焦在培养皿底部。
注意：视野前景中可能存在大量免疫细胞。仅有少量成纤维细胞会贴附在培养皿底部。 - 换液前需等待18–24小时，以确保细胞充分贴壁。
- 每三天更换一次培养基，直至细胞融合度达到80%。当细胞融合度达到80–90%时，传代至更大的培养瓶或分装冻存以备后续使用。
结果
从10名接受盆腔器官脱垂手术的独立供体中采集阴道组织。根据所述方案，从人阴道组织中分离细胞。细胞群体具有典型的细长、扁平且呈纺锤形的形态。与其他研究类似，我们观察到随着供体年龄增长，成纤维细胞的倍增能力显著下降，克隆形成能力减弱。在比较老年个体（75-78岁）与年轻个体（35-47岁）来源的成纤维细胞时，这些差异尤为明显。来自中年供体的细胞表现出中间表型（56-61岁）。细胞增殖率最初通过相差显微镜直接观察，并结合已知的接种密度进行初步估算。
图1：实验方案的示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。
图1 展示了细胞解离与分离方案的示意图。按照这些步骤操作后，该方案在十名供者中的九名实现了原代成纤维细胞的分离，成功率达到90%，且获得的细胞数量足以进行传代培养。供者的中位年龄为59岁。
| 实验方案（作者，年份） | 原始方案的供体组织 | 供体数量 | 供体年龄（岁） | 获得成纤维细胞 | 形态学 |
| Ruiz-Zapata et al., 2013 | 人类阴道 | 3 | 56-78 | 否 | 不适用 |
| Khan et al., 2016 | 小鼠耳部和尾部 | 2 | 48-65 | 否 | 不适用 |
| Waise et al., 2019 | 人类组织 | 3 | 56-75 | 否 | 不适用 |
| Nadalutti et al., 2020 | 人类包皮 | 1 | 65 | 否 | 不适用 |
| 本研究 | 人类阴道 | 10 | 35-79 | 是 | 纺锤形 |
表1：人阴道成纤维细胞成功分离方案的比较。不同现有方案与本方案的对比，并以形态学结果作为证据。
表1展示了本研究中尝试使用其他方案进行阴道成纤维细胞分离的结果。我们建立了一种从阴道黏膜及老年供体中分离原代成纤维细胞的标准方案5。
我们测试了多种已建立的方案，包括表1中列出的方案，在本研究中使用这些方案均未成功分离细胞。我们提出以下原因以解释其局限性。
Ruiz 等人3发表的方案涉及刮除筋膜并将组织切割成小块。根据我们的经验，筋膜难以辨别，尝试刮除可能导致细胞得率显著降低。尽管该方法较为直接，但缺乏关键细节，限制了其普适性。此外，该方案中的机械消化步骤对绝经后组织似乎不够充分，因为后者通常更为致密。
Khan 等人9 和 Waise 等人13 发表的实验方案采用剪刀进行组织切碎，与手术刀法相比，该方法引入的多方向剪切力并不显著。根据我们的经验，剪刀法同样未能有效发挥作用。
最后，我们尝试使用 Nadalutti 等人14报道的采用组织块法的实验方案时，未能成功获得成纤维细胞。该方法效果较差可能与绝经后组织的特性有关，此类组织可能需要更强烈的机械和酶消化处理才能有效解离成纤维细胞。
图2：第0天悬浮细胞的相差显微图像。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2 显示了使用本方案在第0天的悬浮细胞。
图3：阴道原代成纤维细胞在培养第14天时的相差显微图像（100倍放大），细胞来源于三个1 cm2 组织活检样本的混合细胞悬液。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3显示了来自3个尺寸为1 cm²的组织活检样本混合细胞悬液的原代成纤维细胞，放大倍数为100倍。
成纤维细胞的身份通过免疫荧光技术进行鉴定，方法与之前描述的相似，仅作轻微修改。为验证阴道原代细胞的细胞来源，我们采用成纤维细胞特异性生物标志物进行免疫荧光染色。根据波形蛋白（图4）、F-肌动蛋白和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的阳性染色结果，可将来自绝经前和绝经后组织样本的细胞鉴定为成纤维细胞（图5）。这些成纤维细胞在培养中成功扩增，且细胞活力高（>90%），可用于后续实验。
图4：阴道成纤维细胞波形蛋白的阳性染色。对分离获得的绝经前和绝经后组织原代成纤维细胞进行免疫荧光（IF）分析，图像以200倍放大倍数拍摄。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：阴道成纤维细胞F-肌动蛋白和α-SMA的阳性染色。 蛋白质表达结果与IgG对照组比较。图像以200倍放大倍数采集。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
既往许多研究已报道了如何从人类阴道组织中分离原代成纤维细胞3,7。一些研究使用了来自患有盆腔器官脱垂的围绝经期个体的人类阴道组织。尽管少数论文报道了使用围绝经期和绝经后个体的组织7,11，但并未详细描述从年长或绝经后供体成功分离成纤维细胞所采用的具体方案。患有生殖器脱垂的绝经后女性其阴道壁比围绝经期女性更厚，这可能是导致该人群中细胞分离难度增加的原因之一13。 成功从绝经后供体分离细胞对于疾病建模与研究至关重要，因为盆底功能障碍在绝经后或老年群体中最为常见。
我们建立了一种可成功且稳定地从35至78岁供体中分离和培养人阴道成纤维细胞的实验方案。通过免疫荧光染色检测成纤维细胞来源的生物标志物，确认了原代阴道细胞的细胞来源。
本文介绍的人阴道成纤维细胞分离方法能够实现原代成纤维细胞的分离与培养。根据我们的经验，此前发表的用于动物9以及人类3,14,16组织的原代细胞解离方案，在本研究中均未能从人阴道样本中分离出任何成纤维细胞14。
我们推测，从人类阴道组织中分离细胞存在困难的两个可能原因是：（1）老年供体的黏膜真皮层厚度大于年轻供体，且与老年供体的非黏膜组织相比也更厚13,17，这使得细胞解离更加困难；（2）老年个体中成纤维细胞的密度可能显著降低17。
鉴于这些挑战，本方案中有几个关键步骤不应修改。第一个关键步骤是实施非常严格的机械消化。在此，我们采用双手术刀技术。根据我们的经验，若改用剪刀来切碎组织，则无法获得足够小的组织片段，从而难以从人阴道组织中解离出成纤维细胞。
另一个关键步骤是汇集细胞悬液以及汇集来自同一供体的3-4个全层活检组织（1 cm2）。这是获得足够细胞以进行持续培养的必要条件。在所有情况下，我们采集的组织量均明显超过1 cm2，因为在盆腔器官脱垂手术中，切除多余的阴道上皮是必要的操作步骤。在本研究中，我们仅汇集来自同一供体的细胞悬液，目的是研究并区分不同供体之间的细胞特性与增殖能力。
我们的方案具有明显优势：机械和酶消化法可提高绝经后组织的得率，但对绝经前样本无负面影响。
我们认识到本方案存在若干局限性。在未进行阴道脱垂手术的情况下，获取人阴道组织可能较为困难。此外，需要合并多个组织活检样本的细胞悬液也可能是一个局限性。
总之，该获取人阴道成纤维细胞的实验方案将成为未来研究盆底功能障碍的重要工具，尤其适用于绝经后个体，并将为女性健康研究提供重要的补充。
披露
我们没有需要披露的利益冲突。
致谢
我们想要表达我们的 感谢文森特中心的所有成员 马萨诸塞州生殖生物学研究所 综合医院以及文森纪念医院基金会，对他们的 大力支持。特别感谢 Dr. Bo Rueda 及其团队提出的宝贵建议 并感谢他们出借实验室设备。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 两性霉素B | Bio Techne | B23192 | |
| 细胞筛（100 μm） | ThermoFisher Scientific | 22363549 | |
| 锥形离心管（15 mL） | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| Feather 一次性手术刀 15号 | Socorex | FB.15 | |
| 胎牛血清 | Sigma Aldrich | NC1983075 | |
| 高透明度锥形离心管（50 mL） | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| HulaMixer 样品混合器 | ThermoFisher Scientific | 15920D | |
| 人纤维连接蛋白 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY1918-05 | |
| 人前胶原I型α1 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY6220-05 | |
| Liberase 研究级酶 | Sigma Aldrich | 05 401 119 001 | |
| 青霉素/链霉素（5000 U/mL） | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| 培养皿，聚苯乙烯材质（100 mm × 20 mm） | Millipore Sigma | P5606 | |
| 血清移液管（10 mL） | ThermoFischer Scientific | 170356N | |
| 无菌注射器（5 mL） | Fischer Scientific | 14-955-458 |
参考文献
- Mirin, A. A. Gender disparity in the funding of diseases by the U.S. J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).
- MacLennan, A. H., Taylor, A. W., Wilson, D. H., Wilson, D. The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery. BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).
- Ruiz-Zapata, A. M., Kerkhof, M. H., Zandieh-Doulabi, B., Brölmann, H. A. M., Smit, T. H., Helder, M. N. Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Rorteau, J., et al. Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors. Cells. 11 (5), 858(2022).
- Blum, M., Koehler, J., Yangdon, T., Chatterjea, D. Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines. MethodsX. 7, 101100(2020).
- Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).
- Ruiz-Zapata, A. M., et al. Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content. Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).
- Khan, M., Gasser, S. Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues. J Vis Exp. (107), e53565(2016).
- Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).
- Medel, S., Alarab, M., Kufaishi, H., Drutz, H., Shynlova, O. Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma. Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).
- Awwad, J., Sayegh, R., Yeretzian, J., Deeb, M. E. Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse. Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).
- Waise, S., et al. An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis. Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).
- Nadalutti, C. A., Wilson, S. H. Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction. Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).
- Da Silva Lara, L. A., et al. Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response. J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).
- Stasio, D. D., Lauritano, D., Iquebal, H., Romano, A., Gentile, E., Lucchese, A. Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography. Diagnostics. 9 (3), 90(2019).
- Zorina, A., Zorin, V., Kudlay, D., Kopnin, P. Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging. Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).
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