本文提供了一种通用方案，用于通过联合酶解和半自动化机械解离方法处理组织，以获得适用于流式细胞术等下游分析的单细胞悬液。方案中包含了为此开发的低成本机械装置的制作、组装及操作说明。
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本文内容
摘要
摘要
能够分离并制备用于组织样本分析的单细胞，已迅速成为生物医学新发现与研究的关键环节。传统的手工单细胞分离方案耗时极长，且易受操作者差异的影响。自动化的机械分离方案虽可缩短处理时间并降低样本间的变异性，但在资源有限的研究环境中往往难以获取或成本过高。本文所述装置旨在利用商业化材料实现半自动化的组织解离，为学术实验室提供一种低成本替代方案。文中提供了该装置的制作、组装及操作说明。该解离方案可稳定地获得单细胞悬液，其细胞得率和样本活力在多种小鼠组织中均与手工制备方法相当。该方案支持每台设备同时处理多达12个组织样本，使需要大样本量的研究更易于实施。配套软件还允许根据不同的组织类型和实验条件对装置运行程序进行个性化设置。
引言
单细胞分析已迅速成为生物医学新发现的关键技术，无论是在流式细胞术、鉴定不同细胞类型、单细胞测序，还是在识别细胞间的基因组或转录组变异等应用中均发挥着重要作用1。从目标组织中进行此类细胞分离 需要将解剖获得的组织切碎，并通过细孔细胞筛网过滤，以去除结缔组织，保留所需细胞（图1A）。对于贴壁型细胞（如树突状细胞或巨噬细胞）或来自纤维化程度较高的组织的细胞，还需额外的机械或酶解分离步骤2,3,4。该过程通常依赖人工操作，导致耗时较长，并在评估细胞得率和样本活力时容易引入操作者间的差异。因此，开发可定制的自动化组织解离方案至关重要。尽管已有研究尝试设计此类系统，但现有设备并非总能便捷获取，尤其在学术实验室和资源有限的环境中，这主要归因于这些设备高昂的成本5。此外，这些设备也往往无法根据特定研究团队的具体需求进行个性化调整6。
本文设计了一种组织解离装置，可在消化酶和机械剪切的辅助下，将完整组织或组织块自动消化为单细胞悬液。该装置可在实验室中轻松组装，可置于加热或冷却腔内以调节温度，可根据所需解离的组织数量进行定制，并可编程设定所需的解离程序。该装置的广泛应用有望显著提高细胞提取方案的可重复性，并为手动解离提供一种节省时间的替代方案。
该设计通过自动化流程实现最多12个组织样本的同时消化。设备由12个并联连接的独立电机组成，通过标准电源插座和交直流适配器供电，并配有可调节电压旋钮，用于控制电机的转速。电机带动六角螺栓旋转，该螺栓紧密嵌入C管顶部。C管由一块亚克力板通过向下的张力固定，该板两侧卡扣在顶部固定电机的面板上（图1B）。由于电机采用并联连接，在给定电压下各电机转速差异应较小，但负载（即设备上安装的C管数量）仍会影响转速，即使电压保持恒定。为测量每分钟转数（rpm），系统集成了基于霍尔效应传感器和固定于某一电机轴上的磁铁构成的转速计（补充图1）。构建电机阵列的CAD文件见补充代码文件1。设备还包括一个可编程开关，通过反转输送至电机的正负电荷来改变旋转方向。所有功能均通过Arduino Nano上的编码软件（Arduino IDE软件，参见材料表）实现集成（补充代码文件2）。通过连接的按钮和LCD显示屏（补充图2），用户可创建并运行已保存或自定义的实验程序，在程序运行的指定时间自动反转旋转方向，通过调节电压调整转速（补充图3），并实时显示当前电机转速及完成预设程序所需的剩余时间（补充图4）。
本研究中，采用该设备进行机械-酶解组织解离以及手动-酶解组织解离两种方法制备单细胞悬液，以评估在后续应用中回收细胞是否存在差异（如有）。根据每份组织的总细胞得率及 细胞活力百分比对细胞制备效果进行评价。通过流式 细胞术比较表面标志物表达的潜在差异。数据采用图形绘制与统计分析软件进行分析。使用非配对 Welch t 检验对样本或组别之间的成对数据进行比较，样本量 n > 4 只小鼠，代表 2 次重复实验。该设备的制备与组装详细说明见补充文件 1。本实验方案所需的材料列于材料表中。
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方案
本方案已获得马里兰大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。实验所用组织来自7至9周龄的雌性C57BL/6J小鼠。实验动物购自商业来源（见材料表）。
1. 手工解离
注意：此步骤改编自 Maisel K. 等人7。
- 取出解剖的组织，将其放入含5%胎牛血清（FBS）的冷细胞培养基中。
- 使用锋利的解剖剪将组织剪碎，直至碎片在任何维度上均小于1 mm。
- 将剪碎的组织转移至15 mL锥形管中，并加入5 mL培养基。
- 根据所分离的组织和细胞类型添加消化酶。对于本实验，使用胶原酶4（1 mg/mL）、胶原酶D（1 mg/mL）和DNase（40 µg/mL）。
- 在37 °C条件下，于摇床或振荡器上孵育1小时，孵育过程中保持轻柔振荡。用移液器将样品上下吹打100次。
- 加入EDTA，使样品终浓度为5 mM。用移液器将样品上下吹打100次，然后剧烈吹打100次。
- 将样品通过70 µm细胞滤筛过滤，并收集至50 mL或15 mL离心管中。
- 在4 °C条件下，以300 x g离心5分钟，收集细胞。用移液器吸除上清液，将细胞重悬于1 mL红细胞裂解缓冲液中，在室温下孵育1分钟。
- 加入9 mL冷的1X磷酸盐缓冲液（PBS）以中和裂解缓冲液。
- 再次在4 °C条件下，以300 x g离心5分钟，收集细胞。用移液器吸除上清液，将细胞重悬于所需的缓冲液或培养基中。
2. 半自动机械解离
- 将解剖的组织置于含5%胎牛血清（FBS）的冷细胞培养基中。
注意：本方案适用于从实体组织中分离细胞。 - 使用锋利的解剖剪将组织剪碎，直至组织碎片在任一维度上约为5 mm。将剪碎的组织转移至C管中，并加入1 mL培养基。
- 将C管装入仪器。将管架板（补充图1A）套在D形管底部。
- 通过将张力臂卡入丙烯酸板，将管子固定在电机板上（补充图3）。
- 设置自定义程序：正向旋转30秒，反向旋转10秒，循环4次。
- 按下蓝色按钮，从主菜单中选择自定义模式。
- 在第一个自定义模式菜单中，按下红色按钮，将正向旋转持续时间设置为30秒，直至屏幕显示值为30秒。按下蓝色按钮以选择该值并进入下一个菜单界面。
- 在第二个自定义模式菜单中，按下红色按钮，将反向旋转持续时间设置为10秒，直至屏幕显示值为10秒。按下蓝色按钮以选择该值并进入下一个菜单界面。
- 在第三个自定义模式菜单中，按下红色按钮，将步骤2.5.2–2.5.3中设定的操作重复次数设置为4次（屏幕显示4X）。按下蓝色按钮以选择该值并启动程序。
注意：自定义程序不会保存在设备内存中，但可编程为预设程序之一以加快操作（设备编程说明见补充文件1）。
- 通过调节电压控制旋钮（补充图3），运行自定义程序，使液晶屏右下角显示的计算转速值为200 rpm（补充图4）。
- 根据待分离的组织和细胞类型，在4 mL 培养基中加入消化酶。
注意：在本实验中，使用胶原酶4（1 mg/mL）、胶原酶D（1 mg/mL）和DNase（40 µg/mL）。 - 将C管装入仪器，并重复步骤2.3–2.6，以200 rpm运行以下程序：正向旋转30秒，反向旋转10秒，循环4次。
- 将装有管子的仪器转移至37 °C培养箱中孵育45分钟。
- 将C管装入仪器，并重复步骤2.3–2.6，以50 rpm运行以下程序：正向旋转270秒，反向旋转30秒，循环9次。
- 加入EDTA，使样品中终浓度达到5 mM。
- 将C管装入仪器，并重复步骤2.3–2.6，以100 rpm运行以下程序：正向旋转30秒，反向旋转10秒，循环2次。
- 将样品通过70 µm细胞滤网过滤，并收集至50 mL或15 mL离心管中。
- 在4 °C条件下，以300 x g离心5分钟收集细胞。用移液器弃去上清液，将细胞重悬于1 mL红细胞裂解缓冲液中，在室温下孵育1分钟。
- 加入9 mL冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）以中和裂解缓冲液。
- 再次在4 °C条件下，以300 x g离心5分钟收集细胞。用移液器弃去上清液，将细胞重悬于所需的缓冲液或培养基中。
3. 数据分析
- 使用绘图和统计分析软件分析数据（参见 材料表）。
- 采用非配对的 Welch t 检验 比较样本或组别之间的差异，每组样本量 n > 4 只小鼠，代表 2 次重复实验。
注：当 (p < 0.05) 时，认为差异具有统计学显著性。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
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结果
这种半自动化的机械操作方案能够重现手动处理细胞实验所得的结果。使用该设备与手动解离方法制备的细胞悬液，在小鼠肺、肾和心脏组织中表现出相当的细胞得率和样品活力（图 2A、B）。免疫细胞群体（如T细胞和树突状细胞）的分离结果在不同分离方案之间无显著差异（图 2C）。类似地，对这些免疫细胞群体表面标志物表达的分析显示，手动分离与设备分离获得的T细胞频率相似（图 3A），树突状细胞中抗原呈递标志物MHC-II的平均荧光强度也相当（图 3B）。
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讨论
该装置专为在 研究环境中便捷组装而设计，可从完整组织中制备单细胞悬液，用于后续的单细胞分析。尽管其功能较为基础，但已足以满足学术机构及其他研究环境中的科研人员需求。使用该装置的一个关键优势在于其有望通过减少操作变异性来改善单细胞悬液的制备质量。此外，该装置可同时处理12个以上样本，有助于提高样本间的一致性，而传统手工解离方案因耗时较长，可能对样本间一致性造成不利影响。在科研机构和工业环境中，此类装置以及其它商业化的设备可实现更快速且可定制的组织处理；然而，商业化设备的价格超过本文所述装置的10倍以上，限制了其可及性，尤其是在资源有限的研究环境中8,9。在学术实验室中，该装置可通过缩短组织处理所需时间，使受训人员（包括本科生和研究生）能够开展更为复杂的科研工作。
此处所述的机械解离方案改编自一种常规用于从肺组织中分离免疫细胞的方案7。耗时的人工操作步骤，例如精细剪切和多次或剧烈的移液操作，已被自动化的机械处理所...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究获得了Fischell生物工程系（KM）、T32 GM080201（MA）、Vogel冠名暑期奖学金（MA）、LAM基金会（KM）和美国肺脏协会（KM）的资助。 作者谨此感谢Michele Kaluzienski在编辑方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ¼ 英寸亚克力板 12" x 24" | Acrylic Mega Store | N/A | |
| ½ 英寸亚克力板 12" x 12" | SimbaLux | SL-AS13-12x12 | |
| 12 号不锈钢丝（用于张力臂） | Everbilt | 1000847413 | |
| 16 号多股电线 | Best Connections | N/A | |
| 2 x 3 mm 磁铁 | SU-CRO0587 | N/A | |
| 双通道继电器板（用于反转电机电流极性） | AEDIKO | AE06233 | |
| 37 mm 直径直流电机（12 V，200 rpm）x 12 | Greartisan | N/A | 额定扭矩：2.2 Kg·cm 减速比：1:22 额定电流：0.1 A D 型输出轴尺寸：6 x 14 mm（0.24" x 0.55"）（D x L） 减速箱尺寸：37 x 25 mm（1.46" x 0.98"）（D x L） 电机尺寸：36.2 x 33.3 mm（1.43" x 1.31"）（D x L） 安装孔尺寸：M3（不包含） |
| 带可变电压控制器的交流/直流电源适配器 （5 安培，3–12 伏） | Mo-gu | J19091-2-MG-US | |
| 交流转直流 5 V 1 A 精密降压转换器 | Walfront | 1A | （为 Arduino Nano 供电的电源适配器） |
| Arduino Nano （Lafvin） | LAFVIN | 8541582500 | |
| 按钮 | Awpeye | Push-button | |
| C57BL/6J 小鼠 | Jackson Laboratory | ||
| 胶原酶 4 | Worthington | CLS4 LS004188 | |
| 胶原酶 D | Roche | 11088866001 | |
| DMEM（杜氏改良伊格尔培养基） | Corning | 10-013-CV | |
| 脱氧核糖核酸酶（DNAse） | Roche | 11284932001 | |
| 双面泡沫胶带 | SANKA | N/A | |
| 双面原型电路板 | deyue | N/A | |
| EDTA | Sigma- Aldrich | E7889 | |
| 焊锡及电烙铁 | LDK | 1002P | |
| 绝缘胶带 | 3M | 03429NA | |
| FBS（胎牛血清） | Gibco | 16140089 | |
| gentleMACS C 管 | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Graphpad Prism | GraphPad, La Jolla, CA | 绘图与统计分析软件 | |
| 霍尔效应传感器 尺寸：0.79 x 0.79 x 0.39 英寸 | SunFounder | 43237-2 | |
| 六角联轴器 6 mm 孔径 黄铜电机用 x 2 x 12 | Uxcell | N/A | |
| 六角头螺栓（M4-0.70 x 12 六角头内六角螺钉）x 12 | FAS | N/A | |
| 跳线（用于 Arduino Nano） | ELEGOO | EL-CP-004 | |
| LCD 屏幕 | JANSANE | N/A | |
| M3 内六角圆柱头螺钉 x 12 | Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd | 310luosditaozhuang | |
| M3 不锈钢平头内六角圆柱头螺钉（30 mm）x 36 | Still Awake | a52400001 | |
| 快速断开终端连接器 | IEUYO | 22010064 | |
| 红细胞裂解缓冲液（10 倍浓缩） | Cell Signaling | 46232 | |
| Arduino Nano 用终端适配器扩展板 12" x 24" | Shenzhen Weiyapuhua Technology | 60-026-3 |
参考文献
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- Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022(2022).
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