使用电动设备对组织进行机械解离以进行单细胞分析

Summary

提供了组织结合酶法和半自动机械解离以产生用于下游分析（例如流式细胞术）的单细胞悬浮液的通用方案。包括为该协议开发的低成本机械装置的制造、组装和操作说明。

Abstract

能够分离和制备用于分析组织样本的单细胞对于新的生物医学发现和研究迅速变得至关重要。单细胞分离的手动方案非常耗时，并且容易出现用户差异。自动化机械方案能够减少处理时间和样品变异性，但在资源匮乏的研究环境中不容易获得或具有成本效益。这里描述的设备是为使用市售材料进行半自动组织解离而设计的，作为学术实验室的低成本替代品。提供了制造、组装和操作设备设计的说明。该解离方案可靠地产生单细胞悬浮液，其细胞产量和样品活力与跨多个小鼠组织的手动制备相当。该方案能够为每台设备同时处理多达 12 个组织样本，使需要大样本量的研究更易于管理。随附的软件还允许自定义设备协议，以适应不同的组织和实验限制。

Introduction

无论是流式细胞术、识别不同细胞类型、单细胞测序，还是用于识别细胞之间的基因组或转录组变异，单细胞分析都已迅速成为新的生物医学发现的关键¹。从感兴趣的组织中进行这种细胞分离需要切碎解剖的组织并将它们推入细细胞过滤器，以从所需细胞中过滤掉结缔组织（图1A）。分离贴壁细胞类型，例如树突状细胞或巨噬细胞，或来自特定纤维组织的细胞，需要额外的机械或酶分离步骤^2,3,4。该过程通常是手动完成的，因此在评估细胞产量和样品活力时非常耗时且容易出现用户差异。因此，引入可定制的自动组织解离选项至关重要。虽然已经对设计此类系统进行了一些尝试，但现有的选项并不总是容易获得，特别是在学术实验室和资源匮乏的环境中，这主要是由于这些设备的成本过高⁵.此外，这些设备并不总是可以根据研究小组的个性化需求^{进行定制 6}.

在这里，设计了一种组织解离装置，用于在消化酶和机械破坏的帮助下将整个组织或组织块自动消化成单细胞悬浮液。该设备可以在实验室中轻松组装，放入加热或冷却室中进行温度调节，根据所需数量的解离组织进行定制，并使用所需的解离方案进行编程。该装置的广泛使用可以显着提高细胞提取方案的可重复性，并提供一种节省时间的手动解离替代方案。

该设计允许通过自动化过程同时消化多达 12 个组织。该设备由 12 个并联的独立电机组成，并通过带有可调电压刻度盘的 AC/DC 适配器由标准壁式插头供电，以控制电机的旋转/速度。电机转动一个紧贴 C 型管顶部的六角螺栓。C型管通过亚克力板上的向下张力固定到位，亚克力板在两侧锁定在固定电机的顶板上（图1B）。由于电机是并联接线的，因此它们在任何给定电压下的速度变化不大，但即使电压保持恒定，负载（安装在设备上的 C 管数量）也会影响速度。为了测量每分钟转数 （rpm），在其中一个电机轴上安装了使用霍尔效应传感器和固定磁铁的转速计（补充图 1）。用于构建电机阵列的 CAD 文件在 补充编码文件 1 中提供。还包括一个可编程开关，通过反转传递到电机的正/负电荷来反转旋转方向。所有这些功能都使用编码软件（Arduino IDE软件，请参阅 材料表）集成在Arduino Nano（补充编码文件2）上。使用连接的按钮和 LCD 面板（补充图 2），可以创建和运行保存的和自定义的协议，在协议的指定时间自动反转旋转方向，使用电压调整速度（补充图 3），并显示当前电机速度和完成编程协议的剩余时间（补充图 4）。

在本研究中，使用该装置的机械-酶促组织解离和手动酶促组织解离制备单细胞悬浮液，以确定为下游应用回收的细胞中的差异（如果有的话）。根据每个组织的总细胞产量和细胞活力百分比评估细胞制剂。流式细胞术用于比较表面标志物表达的潜在差异。使用图形和统计分析软件对数据进行分析。使用未配对的 Welch t 检验 来比较成对的样本或组，样本量 n > 4 只小鼠代表 2 个重复实验。有关制造和组装此设备的详细说明，请参阅 补充文件 1。该协议所需的材料列在 材料表中。

Protocol

该协议已获得UMD机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。这些研究使用了 7 至 9 周龄雌性 C57BL/6J 小鼠的组织。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。

1.手动解离

注意：此步骤改编自 Maisel K. 等人 ⁷。

1. 取出解剖的组织并将其置于含有5%胎牛血清（FBS）的冷细胞培养基中。
2. 使用锋利的解剖剪刀切碎组织，直到碎片在任何尺寸上都小于 1 毫米。
3. 将切碎的组织转移到 15 mL 锥形管中，并加入 5 mL 培养基。
4. 根据分离的组织和细胞类型添加消化酶。对于所提出的实验，使用胶原酶 4 （1 mg/mL）、胶原酶 D （1 mg/mL） 和 DNase （40 μg/mL）。
5. 在37°C下在振荡器或摇杆上孵育1小时，在整个孵育过程中轻轻搅拌。上下移液100次。
6. 加入EDTA以达到5mM浓度的样品体积。上下移液100次，然后用力上下移液100次。
7. 将样品通过 70 μm 细胞过滤器，并将其收集在 50 mL 或 15 mL 管中。
8. 将收集的细胞在4°C下以300× g 离心5分钟。 使用移液管除去上清液，并将细胞重悬于 1 mL 红细胞裂解缓冲液中。在室温下孵育1分钟。
9. 通过加入 9 mL 冷 1X 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中和裂解缓冲液。
10. 将收集的细胞在4°C下再次以300× g 离心5分钟。 使用移液管除去上清液，并将细胞重悬于所需的缓冲液或培养基中。

2.半自动机械解离

1. 将解剖的组织置于含有 5% 胎牛血清 （FBS） 的冷细胞培养基中。
   注意：该协议旨在从实体组织中分离细胞。
2. 使用锋利的解剖剪刀切碎组织，直到组织碎片在任何尺寸上约为 5 毫米。将切碎的组织转移到 C 管中并加入 1 mL 培养基。
3. 将 C 管装入设备。将管架板（补充图 1A）安装在 D 形管底上。
4. 通过将张力臂锁定到亚克力板中，将管子固定到电机板上（补充图 3）。
5. 设置自定义程序：前进，30 秒;反转，10 秒;循环，4次。
   1. 按蓝色按钮从主菜单中选择自定义模式。
   2. 在第一个自定义模式菜单中，按 红色 按钮将向前旋转的持续时间指定为 30 秒，直到屏幕上的值显示为 30 秒。按 蓝色 按钮选择此值并前进到下一个菜单屏幕。
   3. 在第二个自定义模式菜单中，按 红色 按钮将反向旋转的持续时间指定为 10 秒，直到屏幕上的值显示为 10 秒。按 蓝色 按钮选择此值并前进到下一个菜单屏幕。
   4. 在第三个自定义模式菜单中，按 红色 按钮直到屏幕上的值显示为 4X，指定重复步骤 2.5.2-2.5.3 中设置的选择的次数。按 蓝色 按钮选择此值并启动程序。
      注意： 自定义程序不存储在设备内存中，但可以编程为预设程序之一以加快操作速度（ 补充文件 1 中提供了设备编程说明）。
6. 通过调整电压控制拨盘以 200 rpm 的速度运行自定义程序（补充图 3），直到 LCD 屏幕右下角的计算转速值为 200（补充图 4）。
7. 根据分离的组织和细胞类型，在 4 mL 培养基中加入消化酶。
   注意：对于提出的实验，使用胶原酶4（1mg / mL），胶原酶D（1mg / mL）和DNase（40μg/ mL）。
8. 将 C 管装入设备并重复步骤 2.3-2.6 以 200 rpm 的速度运行以下程序：前进，30 秒;反转，10 秒;循环，4次。
9. 将仍加载的管转移到37°C培养箱中45分钟。
10. 将 C 管加载到设备上并重复步骤 2.3-2.6 以 50 rpm 的速度运行以下程序：前进，270 秒;反转，30 秒;循环，9次。
11. 加入EDTA以在样品中达到5mM浓度。
12. 将 C 管加载到设备上并重复步骤 2.3-2.6 以 100 rpm 的速度运行以下程序：前进，30 秒;反转，10 秒;循环，2次。
13. 将样品推入 70 μm 细胞过滤器，并将其收集在 50 mL 或 15 mL 管中。
14. 将收集的细胞在4°C下以300× g 离心5分钟。 使用移液管弃去上清液，并将细胞重悬于1mL红细胞裂解缓冲液中。在室温下孵育1分钟。
15. 用 9 mL 冷磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中和裂解缓冲液。
16. 将收集的细胞在4°C下再次以300× g 离心5分钟。 使用移液管弃去上清液，并将细胞重悬于所需的缓冲液或培养基中。

3. 数据分析

1. 使用图形和统计分析软件分析数据（参见 材料表）。
2. 使用未配对的 Welch t 检验 来比较成对的样本或组，样本量 n > 4 只小鼠代表 2 个重复实验。
   注：当（p < 0.05）时，差异被认为具有统计学意义。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

Results

这种半自动机械方案可以复制手动处理细胞的实验结果。使用该装置和通过手动解离制备的细胞悬液在小鼠肺、肾和心脏组织中显示出相当的细胞产量和样品活力（图 2A、B）。免疫细胞群，如T细胞和树突状细胞，不受分离方案差异的显着影响（图2C）。同样，对这些免疫细胞群表面标记物表达的分析显示，在手动和设备分离之间，分离的T细胞（图3A）的频率相似，树突状细胞中抗原呈递标记MHC-II的平均荧光强度相当（图3B）。

图 1

Discussion

该设备设计用于在研究环境中轻松组装，以提供来自整个组织的单细胞悬浮液，用于随后的单细胞分析。这些功能虽然很基本，但足以满足学术环境及其他环境中的研究人员的需求。使用该装置的一个主要优点是它有可能通过减少变异性来改进单细胞悬浮液的制备。此外，同时处理 12+ 个样品的能力可以提高样品间的一致性，这可能会受到手动解离方案所需时间增加的影响。在研究机构和行业环境中，像这样的设备和其他商用设备可以实现更快和可定制的组织处理;然而，商用设备的成本是本文所述设备的 10 倍以上，限制了它们的可访问性，尤其是在资源匮乏的研究环境中 ^8,9。在学术实验室中，该设备可以通过减少处理组织进行体内分析所需的时间，使受训者（本科生和研究生）能够完成更复杂的研究。

这里描述的机械解离方案改编自通常用于从肺组织中分离免疫细胞^{的方案 7}。耗时的手动步骤，如细碎和大量或剧烈的移液，被自动化机械处理所取代，节省了产生与手动方案相似的结果所需的时间和精力...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ 英寸亚克力板  12" x 24"	亚克力大型商店	N/A
½ 英寸亚克力板12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12 12
G不锈钢线（用于张紧臂）	Everbilt	1000847413
16 G电线（绞合）	最佳连接	N/A
2 x 3 mm 磁体	SU-CRO0587	N/A
2 通道继电器板（用于反转电机电流的极性）	AEDIKO	AE06233
37 mm 直径直流电机（12 V，200 rpm）x 12	Greartisan	N/A	额定扭矩：2.2 Kg.cm 减速比：1：22 额定电流：0.1 A D 形输出轴尺寸：6 x 14mm （0.24" x 0.55"） （D x L） 变速箱尺寸： 37 x 25毫米（1.46英寸 x 0.98英寸） 电机尺寸：36.2 x 33.3毫米（1.43英寸 x 1.31英寸）（深 x 长） 安装孔尺寸：M3（不包括在内）
带可变电压控制器的AC/C电源适配器  （5 安培，3-12 伏）	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A精密降压转换器降压变压器	Walfront	1A	（为Arduino Nano供电的电源适配器
）Arduino Nano  "（拉夫文，Lafvin）	LAFVIN	8541582500
按钮	Awpeye	按钮
C57BL6/J 鼠标	Jackson 实验室
胶原酶 4	Worthington	CLS4 LS004188
胶原酶 D	罗氏	11088866001
DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）	康宁	10-013-CV
DNAse	罗氏	11284932001
双面泡沫胶带	SANKA	N/A
双面原型电路板	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
电焊料和烙铁	LDK	1002P
电工胶带	3M	03429NA
FBS（胎牛血清）	Gibco	16140089
gentleMACS C 管	Miltenyi	130-093-237
Graphpad 棱镜	GraphPad，拉霍亚，加利福尼亚州		绘图和统计分析软件
霍尔效应传感器 尺寸：0.79 x 0.79x 0.39 英寸	SunFounder	43237-2
六角耦合器 6 毫米孔径电机黄铜 x 2 x 12	Uxcell	N/A
六角头螺栓（M4-.70 X 12 六角头帽螺钉） x 12	FAS	N/A
跳线（用于 Arduino Nano）	ELEGOO	EL-CP-004
液晶屏	JANSANE	N/A
M3 内六角头螺丝 x 12	深圳 百时创友 科技有限公司Ltd	310罗斯迪陶庄
M3 不锈钢机械螺丝 平头内六角螺丝 （30 mm） x 36	仍然醒着	a52400001
快速断开端子连接器	IEUYO	22010064
红细胞裂解缓冲液 （10x）	细胞信号传导	46232
端子适配器盾 Arduino Nano 扩展板  12" x 24"	深圳 伟亚普华 科技	60-026-3