本文介绍了一套全面的行为测试组合，包括新奇水箱、群集和社会偏好测试，可用于通过单个水箱有效评估化学品（如甲基苯丙胺和草甘膦）对成年斑马鱼的潜在神经毒性效应。该方法与神经毒性和环境研究密切相关。
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摘要
摘要
多年来，神经病理学效应的存在一直是评估化学物质神经毒性的主要终点。然而，在过去50年中，化学物质对模式物种行为的影响得到了广泛研究。行为学终点逐步被纳入神经毒理学筛查方案中，这些功能性结果如今已常规用于识别和确定化学物质潜在的神经毒性。成年斑马鱼的行为检测为研究多种行为（包括焦虑、社会互动、学习、记忆和成瘾）提供了标准化且可靠的方法。成年斑马鱼的行为检测通常涉及将鱼置于实验环境中，并使用视频追踪软件记录和分析其行为。可通过施加多种刺激来观察鱼类行为，并利用多种指标对其进行量化。新环境 tank 测试（novel tank test）是研究鱼类类焦虑行为中最被广泛接受和使用的行为检测方法之一。群聚（shoaling）和社会偏好测试则在研究斑马鱼社会行为方面具有重要价值，该检测的特别之处在于可对整个鱼群的行为进行观察。这些检测方法已被证实具有高度可重复性，并对药理学和遗传学干预敏感，因此成为研究行为背后神经回路和分子机制的有力工具。此外，这些检测还可用于药物筛选，以鉴定可能具有行为调节潜力的化合物。
本研究将展示如何在鱼类神经毒理学中应用行为学工具，分析娱乐性药物甲基苯丙胺和环境污染物草甘膦的影响。结果表明，成年斑马鱼行为学检测对理解环境污染物和药物的神经毒理学效应具有重要意义，同时有助于揭示可能改变神经元功能的分子机制。
引言
斑马鱼（Danio rerio）是一种广泛用于生态毒理学、药物发现和安全性药理学研究的模式脊椎动物。由于其成本低廉、分子遗传学工具成熟，且在神经系统形态发生和维持过程中涉及的关键生理过程具有高度保守性，斑马鱼已成为神经科学研究的理想动物模型，包括神经行为毒理学研究1,2。过去，评估化学物质神经毒性的主要终点是神经病理学效应的存在与否。然而近年来，行为学终点已被纳入神经毒理学筛选方案中，这些功能性指标现已被广泛用于识别和判定化学物质潜在的神经毒性3,4。此外，从生态学角度来看，行为学终点具有高度相关性，因为即使鱼类发生轻微的行为改变，也可能危及其在自然环境中的生存5。
在成年斑马鱼研究中，最常用的行为学检测方法之一是新环境水箱实验（NTT），用于测量类似焦虑的行为6,7。在该实验中，将斑马鱼暴露于新奇环境（即将鱼放入一个陌生的水箱）这一轻度厌恶刺激中，并观察其行为反应。NTT主要用于评估鱼类的基础运动活性、趋地性、僵直不动以及异常运动等行为，其中异常运动
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方案
严格遵守伦理标准，以确保实验所用斑马鱼的福利和得到妥善处理。所有实验操作均依照机构动物护理和使用委员会（CID-CSIC）制定的指南进行。下述方案与结果均在地方政府授予的许可下实施（协议编号 11336）。
1. 行为学测试的动物饲养
- 执行所有测试（在下文中列出的） 图1) 在27-℃的独立行为学实验室内28 °C 10:00 至 17:00 之间。
- 用洁净的鱼用水[反渗透纯化水，含90 mg/L水族系统盐、0.58 mM CaSO₄]将对照组和暴露组的鱼分别反复清洗数次。4·2H2O 和 0.59 mM NaHCO₃3] 在开始实验前，以避免实验水箱受到任何潜在污染。
- 实验开始前1小时将动物适应至行为学实验房间。
- 确保动物（≈50:50 的雄性与雌性比例）均为未经实验处理的动物，所有行为学测试均在观察者对实验分组不知情的情况下以盲法进行。
- 为在行为学实验中获得有意义的结果，每种条件应至少有18只受试动物（n = 18），理想情况下来自两次或更多次独立实验。例如，在个体测试中，每次重复分析每种条件下9只动物的行为；在群体测试中，每次重复分析每种条件下由6至9只动物组成的鱼群的行为。
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结果
在本节中，我们将探讨这些行为学工具在鱼类神经毒理学中的一些可能应用。以下结果对应于娱乐性药物甲基苯丙胺（METH）的急性或暴发性效应，以及草甘膦亚慢性效应的表征，草甘膦是水生生态系统中主要的除草剂之一。
成年斑马鱼甲基苯丙胺暴发性神经毒性模型的表征
在评估40 mg/L METH对NTT的影响时（图3），Kruskal-Wallis检验证实，暴露动物表现出正向地理趋向性，其特征为在实验水箱上层区域的探索时间减少（H(2) = 35.964，P = 1.55 × 10-8），在该区域移动的距离减少（H(2) = 32.272，P = 9.82 × 10-8），以及进入该区域的次数减少（H(2) = 36.527，P = 1.17 × 10-8）.......
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讨论
在NTT中观察到的典型焦虑行为与大脑中分析得到的5-羟色胺水平呈正相关21。例如，暴露于对氯苯丙氨酸（PCPA）——一种5-HT生物合成抑制剂——后，鱼类表现出正向趋地性以及脑内5-HT水平降低22，该结果与甲基苯丙胺（METH）处理所获得的结果非常相似。因此，METH暴露的斑马鱼脑内5-羟色胺水平降低并表现出正向趋地性，提示该药物引起焦虑行为是通过5-羟色胺能通路介导的。有趣的是，在成年斑马鱼中，暴露于两种具有环境相关浓度的草甘膦（0.3 µg/L 和 3 µg/L）2周后，也可观察到类似的表型，即对趋地性产生促焦虑效应。此前也有报道显示，成年斑马鱼暴露于神经毒素丙烯酰胺后，趋地性增加6,23。在所有这些情况下，这种行为表型（NTT中趋地性增加，为促焦虑物质的特征）均与单胺类神经递质水平的降低相关。因此，NTT范式结合脑部神经化学分析，可提供生态学相关的资讯，包括探索行为、觅食效率，并将行为神经表型与神经递质调节联系起来。<.......
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披露
作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
本工作由西班牙科学与创新部的“"Agencia Estatal de Investigación"（项目编号 PID2020-113371RB-C21）、IDAEA-CSIC 以及卓越 Severo Ochoa 中心（CEX2018-000794-S）资助。Juliette Bedrossiantz 获得了由西班牙政府与欧洲社会基金（ESF）共同资助的博士生奖学金（PRE2018-083513）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 水族箱 立方体形状 | Blau Aquaristic | 7782025 | 立方全景 10 (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm) |
| Ethovision 软件 | Noldus | Ethovision XT | 版本 12.0 或更新 |
| GigE 相机 | Imaging Development Systems | UI-5240CP-NIR-GL | |
| GraphPad Prism 9.02 | GraphPad 软件公司 | GraphPad Prism 9.02 | 适用于 Windows |
| IDS 相机管理器 | Imaging Development Systems | ||
| LED 背光照明 | Quirumed | GP-G2 | |
| SPSS 软件 | IBM | IBM SPSS v26 | |
| uEye Cockpit 软件 | Imaging Development Systems | 版本 4.90 |
参考文献
- Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
- Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D.
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重印与许可
