本文介绍了一套全面的行为测试组合，包括新奇水箱、群集和社会偏好测试，可用于通过单个水箱有效评估化学品（如甲基苯丙胺和草甘膦）对成年斑马鱼的潜在神经毒性效应。该方法与神经毒性和环境研究密切相关。
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摘要
摘要
多年来，神经病理学效应的存在一直是评估化学物质神经毒性的主要终点。然而，在过去50年中，化学物质对模式物种行为的影响得到了广泛研究。行为学终点逐步被纳入神经毒理学筛查方案中，这些功能性结果如今已常规用于识别和确定化学物质潜在的神经毒性。成年斑马鱼的行为检测为研究多种行为（包括焦虑、社会互动、学习、记忆和成瘾）提供了标准化且可靠的方法。成年斑马鱼的行为检测通常涉及将鱼置于实验环境中，并使用视频追踪软件记录和分析其行为。可通过施加多种刺激来观察鱼类行为，并利用多种指标对其进行量化。新环境 tank 测试（novel tank test）是研究鱼类类焦虑行为中最被广泛接受和使用的行为检测方法之一。群聚（shoaling）和社会偏好测试则在研究斑马鱼社会行为方面具有重要价值，该检测的特别之处在于可对整个鱼群的行为进行观察。这些检测方法已被证实具有高度可重复性，并对药理学和遗传学干预敏感，因此成为研究行为背后神经回路和分子机制的有力工具。此外，这些检测还可用于药物筛选，以鉴定可能具有行为调节潜力的化合物。
本研究将展示如何在鱼类神经毒理学中应用行为学工具，分析娱乐性药物甲基苯丙胺和环境污染物草甘膦的影响。结果表明，成年斑马鱼行为学检测对理解环境污染物和药物的神经毒理学效应具有重要意义，同时有助于揭示可能改变神经元功能的分子机制。
引言
斑马鱼（Danio rerio）是一种广泛用于生态毒理学、药物发现和安全性药理学研究的模式脊椎动物。由于其成本低廉、分子遗传学工具成熟，且在神经系统形态发生和维持过程中涉及的关键生理过程具有高度保守性，斑马鱼已成为神经科学研究的理想动物模型，包括神经行为毒理学研究1,2。过去，评估化学物质神经毒性的主要终点是神经病理学效应的存在与否。然而近年来，行为学终点已被纳入神经毒理学筛选方案中，这些功能性指标现已被广泛用于识别和判定化学物质潜在的神经毒性3,4。此外，从生态学角度来看，行为学终点具有高度相关性，因为即使鱼类发生轻微的行为改变，也可能危及其在自然环境中的生存5。
在成年斑马鱼研究中，最常用的行为学检测方法之一是新环境水箱实验（NTT），用于测量类似焦虑的行为6,7。在该实验中，将斑马鱼暴露于新奇环境（即将鱼放入一个陌生的水箱）这一轻度厌恶刺激中，并观察其行为反应。NTT主要用于评估鱼类的基础运动活性、趋地性、僵直不动以及异常运动等行为，其中异常运动8表现为方向的突然改变（之字形游动）和反复的加速冲刺行为。这是一种警觉反应，通常出现在僵直行为之前或之后。僵直行为是指鱼在水箱底部完全停止运动（仅保留鳃盖和眼球的运动），这与镇静引起的不动状态不同，后者会导致运动减少、运动不能和下沉现象8。僵直行为通常与高度的应激和焦虑状态相关，也是顺从行为的一部分。复杂行为是动物焦虑状态的优良指标。研究表明，NTT对药理学和遗传学干预具有敏感性9，使其成为研究焦虑及其相关障碍神经机制的重要工具。
斑马鱼是一种高度社会性的物种，因此我们可以测量其多种社会行为。群集测试（ST）和社会偏好测试（SPT）是评估社会行为最常用的两种实验方法10。ST通过量化鱼类的空间行为和运动模式，来测量鱼类聚集在一起的倾向11。ST有助于研究群体动态、领导行为、社会学习，并理解许多鱼类物种的社会行为12。成年斑马鱼的SPT借鉴了Crawley用于小鼠的社会新奇性偏好测试方法13 ，并迅速成为研究该模式物种社会互动的一种流行行为学实验方法14。这两种测试也已被改造用于药物筛选实验，并在识别调节社会行为的新型化合物方面展现出良好前景15,16。
总体而言，成年斑马鱼的行为学检测是研究行为机制或活性化合物及滥用药物神经表型的有力工具17。本方案详细介绍了如何利用基本的实验材料资源开展这些行为学检测7，并将其应用于毒性检测，以表征多种神经活性化合物的作用效果。此外，我们将看到，相同的检测方法不仅可用于评估神经活性化合物（如甲基苯丙胺）急性暴露后的神经行为学效应，还可用于表征环境浓度农药（草甘膦）长期暴露后的此类效应。
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方案
严格遵守伦理标准，以确保实验所用斑马鱼的福利和得到妥善处理。所有实验操作均依照机构动物护理和使用委员会（CID-CSIC）制定的指南进行。下述方案与结果均在地方政府授予的许可下实施（协议编号 11336）。
1. 行为学测试的动物饲养
- 执行所有测试（在下文中列出的） 图1) 在27-℃的独立行为学实验室内28 °C 10:00 至 17:00 之间。
- 用洁净的鱼用水[反渗透纯化水，含90 mg/L水族系统盐、0.58 mM CaSO₄]将对照组和暴露组的鱼分别反复清洗数次。4·2H2O 和 0.59 mM NaHCO₃3] 在开始实验前，以避免实验水箱受到任何潜在污染。
- 实验开始前1小时将动物适应至行为学实验房间。
- 确保动物（≈50:50 的雄性与雌性比例）均为未经实验处理的动物，所有行为学测试均在观察者对实验分组不知情的情况下以盲法进行。
- 为在行为学实验中获得有意义的结果，每种条件应至少有18只受试动物（n = 18），理想情况下来自两次或更多次独立实验。例如，在个体测试中，每次重复分析每种条件下9只动物的行为；在群体测试中，每次重复分析每种条件下由6至9只动物组成的鱼群的行为。
- 采用电池测试法进行所有测试（参见规划方案中的建议） 图2在伦理上更为可取，该方法能够减少研究所需的动物数量，符合3R原则中的减量原则7.
- 大多数情况下，行为学实验需与生物学实验相结合，因此应按照安乐死指南处死动物18 在采集和分析样本（组学或化学物质）之前。如果终点指标不涉及取样，则在实验结束时重新建立对照组。几天后可将对照组动物重新用于繁殖或实验目的。
图1：实验装置。 三种方形水箱配置，用于研究成年斑马鱼的多种行为。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：实验时间线。行为测定记录的两个实验规划方案。请点击此处查看此图的放大版本。
2. 水箱的实验配置
- 类似焦虑的行为：新环境 tank 测试（NTT）
- 调整实验装置（包括 tank 数量、摄像头和计算机），以同时记录尽可能多的鱼类。由于个体行为检测耗时较长，需优化时间、材料和空间的使用。
- 准备用于 NTT 的实验 tank：使用尺寸为长 20 cm、宽 20 cm、高 25 cm 的方形 tank，其侧壁和底部覆盖亚克力板，以避免反光及个体之间的干扰。
- 向实验 tank 中加入 7 L 充分供氧的养鱼用水，水深为 20 cm，水温保持在 28 °C。
- 调整 tank 在摄像头前的位置，以避免图像畸变。
- 检查照明设置。使用 LED 背光（10000 lux）为整个 tank 提供均匀照明，以确保视频录制条件良好。
- 打开摄像头，并按照第 3 节所述进行调整。
- 在开始录制前，尽快将实验个体逐一从 tank 底部放入。
注：开始录制时，动物必须位于 tank 的底部。 - 录制过程中注意不要干扰动物。可使用帘子或隔板，以限制 tank 之间以及实验装置与外部环境之间的视觉交互。
- 录制结束后（标准录制时间为 6 分钟），将已完成测试的动物转移至另一个 tank，避免与未受处理的动物混合。
- 对所有可用个体重复上述操作。为获得有意义的个体实验结果，建议每种实验条件至少包含 18 个个体（来自两次或更多次独立重复实验）。
- 在不同实验轮次中随机分配每个 tank 对应的实验组，以避免潜在的 tank 效应（若同时记录多个实验条件）。
- 社会性群聚行为：群聚测试（ST）
- ST 的实验配置与 NTT 相同（可直接重复使用相同的 tank）。
- 按照步骤 2.1.1–2.1.6 设置 ST 实验装置。
- 在开始录制前，尽快将一个群体（同时放入 6 至 9 个个体）从实验 tank 底部放入。
注：开始录制时，动物必须位于 tank 的底部。 - 按照步骤 2.1.8–2.1.11 执行 ST 实验。
- 对所有可用个体重复该操作。为获得有意义的实验结果，每组实验应至少进行两次独立重复，且每次重复中使用相同规模的群体。
- 在同一实验中，所有实验组及重复之间的群体规模应保持一致。
- 社会性个体行为：社会偏好测试（SPT）
- 调整实验装置，以优化实验空间和录制时间。
- 准备用于 SPT 的实验 tank：使用透明（玻璃或塑料）的方形 tank（长 20 cm、宽 20 cm、高 25 cm），以提供侧向可视性。单个目标鱼可自由选择与同种虚拟区域（一侧外部饲养 tank 中放置的鱼群）或非特异性虚拟区域（一侧外部空的饲养 tank）进行互动。
- 向实验 tank 中加入 5 L 清洁的养鱼用水，水深为 15 cm（与外部饲养 tank 的水柱高度相同），水温保持在 28 °C。
- 调整 tank 在摄像头前的位置，以避免图像畸变。
- 检查系统是否接收到均匀的光照。
- 在开始录制前，尽快将实验个体逐一从 tank 底部中央放入，并立即开始录制。
- 录制过程中避免观察者与动物之间的视觉交互。
- 6 分钟录制结束后，将当前动物转移至另一个 tank，避免与未受处理的动物混合。
- 对所有可用个体重复上述操作。为获得有意义的个体实验结果，建议每种实验条件至少包含 18 个个体（来自两次或更多次独立重复实验）。
3. 行为学测试的视频记录
- 打开相机管理器以检查每台计算机上GigE相机的可用性。
- 启动GigE相机控制软件（例如此处所述的uEye Cockpit）。打开 相机 选项，选择 单色 模式，并调整图像大小（1:2）。
- 打开 相机属性
- 在……下方 相机，设置 像素时钟 至 最大值，设置 帧率 至 30 帧每秒（fps），并调整 暴露 (自动 或 手动 如果图像过暗，请进行调整。
- 下 图像，设置 增益 至 0 (自动）和 黑色水平 (自动 或 手动 调整以获得良好的对比度）。
- 下 大小调整窗口大小至需要雕刻的区域（宽度：Width-Left，高度：Height-Top）。此步骤可减小图像尺寸，从而减小最终视频的大小。
- 关闭 相机属性.
- 为实验会话创建一个通用文件夹，用于保存相机设置和视频。
- 为保存相机设置，请设置 文件 > 保存参数 > 存档 并选择最近创建的实验文件夹。
注意：因此，可随时在应用程序中重新加载相机设置文件，以继续使用相同的图像参数（例如，当相机突然关闭时，或为了重复使用相同设置，从而减少准备时间并使实验条件均一化）。如果在录制视频过程中某一时刻相机发生卡顿，请停止录制，退出并关闭相机；然后重新开启相机，并通过以下步骤重新加载相机参数： 文件 > 加载参数 > 存档，然后重新开始录制。检查当前视频是否已完整获取，以决定是否弃用或重复使用该斑马鱼（若需重复，请给予动物一定时间重新适应环境）。 - 对所有相机重复此相机设置步骤（步骤 3.1–3.5）。
- 当所有摄像头都正确配置后，打开 记录视频序列.
- 选择 创建 将视频另存为新文件时，选择最近创建的实验文件夹，并在视频文件名中注明受试者信息、实验类型及日期。
- 选择 最大帧数在帧框中输入 10800。标准视频录制时长为 6 分钟（视频 1以30 fps的帧率录制AVI格式视频，因此总帧数为6分钟 × 60秒 × 30 fps = 10800帧。
- 选择 计算帧率 或手动指定帧率（录制速度：30 fps）。
- 在所有计算机上重复视频文件创建流程。
- 将受试对象逐一引入每个实验水箱的底部。所有测定将同时进行。
- 快速点击以开始记录 记录 等待获取请求的最大帧数（步骤 3.10）。
- 视频录制完成后，会弹出一个聊天框，显示如下消息 已达到最大帧数！选择 接受.
- 选择 关闭 完成录制并关闭视频文件。
- 移除刚刚观察过的鱼，注意将其与未经处理的鱼分离开来。
- 直接选择 创建 并重复该过程以继续录制视频。
- 所有记录完成后，选择 退出.
- 关闭摄像头，请选择 关闭相机 和 退出 该程序。
4. 录制视频的分析
- 启动分析软件（参见 材料表).
- 要编辑新模板，请单击 新模板 > 应用预定义模板 > 从视频文件，选择一个视频以开始设置模板。尽量选择一个能代表该实验的视频，且受试对象应表现出良好的活动能力以及良好的录制条件。
- 在 参数，配置以下窗口（1 至 4/7）中的参数。选择模型 鱼类 > 成年斑马鱼，竞技场 开放场方格 > 一个竞技场，数量 每位受试者对应一个实验区域 （对于ST，需要一个多目标追踪软件包[可在同一实验区域内同时追踪多个对象]），类型 中心点检测 最后将帧率调整至 30 fps在接下来的窗口（5 至 7/7）中，无需更改参数；默认配置即可。
- 将实验命名为模板，并将其放置在与已存储视频相同的文件夹中。该模板将创建为一个实验文件夹，内含多个子目录，用于存储所有设置信息。
- 下 实验设置，检查预设的设置（来自视频文件、实验区域、受试者数量、每秒帧数）。此处可修改系统单位。
- 下 竞技场设置，右键单击屏幕中央并选择 抓取. 来自文件 在显示中选择高质量的视频图像并 接受 用于背景设置的图像采集。首先， 校准 图像，生成一个校准标尺。使用水箱的宽度作为标度（19 cm）。然后绘制实验区域。绘制时需谨慎，确保方形区域大小适中，以避免动物接近水面时产生反射，或防止鱼类分析软件与水箱的黑色区域发生混淆。最后，绘制区域形状时使用 框架 功能
- 用于 NTT 和 ST, 分割 将水箱前部划分为两个相等的虚拟区域：上部和下部（参见 图1）。绘制两个大小相等的水平矩形框，每个框覆盖半场区域。命名为 顶部 和 底部 分别为上区和下区。注意确保各区域的宽度（9-10 cm）和长度（8-9 cm）相同，不超出实验区域边界（橙色方框），且彼此不重叠，并检查每个箭头所指区域准确对应其指定区域。
- 对于SPT，将实验区域在概念上划分为三个大小相等的区域：空置区、中心区和同种个体区（参见 图1）。画出三个相等的垂直框。将朝向鱼群水箱的框命名为 同种的，盒子朝向空箱体摆放 空，中间的一个作为 中心注意确保各盒子的宽度（6 cm）和长度（18–19 cm）相同，不得超过区域边界，且不可相互重叠。
- 下 检测设置，确认需要处理的视频是哪一个 视频文件然后，检查检测质量（黄色的鱼，红色中心点）。单击 自动检测 调整检测，重新对焦动物（选择一张动物在白色背景下游泳的侧身图像，完整描绘其整个身体，并通过 是）。打开 高级 通过选择来提高检测灵敏度 动态减影、暗色主体、背景设置、背景学习、主体尺寸、降噪等
- 下 试验设置，保留一次试验并删除其余试验（右键单击并删除）
- 在……下方 数据设置，创建 结果 对话窗口。按时间和区域参数化结果。例如，创建一个按分钟输出数据的结果窗口，以及另一个按总时间（6 分钟）输出数据的结果窗口。请求每个区域的结果数据输出（如果需要各区域内的距离，请一并请求）。将不同的结果窗口与 开始 窗格 箭头.
- 下 分析设置，选择 参数 用于分析及其类型 统计学 针对每个参数。这些参数将根据追踪所获取的数据自动计算。
- 对于 NTT 和 SPT，选择如下定义的选项：
- 选择 移动距离 （选择 总计以获取在实验区域中移动的距离（cm）以及在各个分区中移动的距离（cm）。
- 选择 在区域中 （选择 区域，频率，累积，以及 首次潜伏期在区域内的停留时间（s）以及首次进入区域的潜伏期（s）。
- 选择 区域转换 （选择 阈值0 cm 添加区域 1 > 2区；2区 > 1区在任何区域 频率）以获取各区域内的进入次数。
- 选择 移动状态 （填写高移动性高于70%，静止低于3%，最少150帧，并选择持续时间、累积值及首次出现的潜伏期），以获得高移动性持续时间（s）和静止持续时间（s）。
注：有关使用自动化分析估算冻结行为以及冻结事件的次数和持续时间（秒）的更多细节，请参见讨论部分。 - 选择 加速度 和 转向角 （选择频率和累积值）以评估复杂行为（如冲刺和 erratic（快速加速运动））的发生情况。
- 对于ST，除了上述探索性参数外，选择该选项 受试者之间的距离 （选择所有个体、平均值、最大值、最小值）以获取鱼之间的平均距离（cm）、与最近邻之间的平均距离（cm）以及与最远邻之间的平均距离。
- 对于 NTT 和 SPT，选择如下定义的选项：
- 模板已准备就绪，可供使用。 保存 最后的修改和 关闭 无需从视频中获取任何数据即可使用模板（保留模板文件；其体积小，便于管理和复制）。如果有多个软件许可证，将同一模板复制到每台计算机上，并据此分析视频。
- 复制并使用该模板有两种选择：
- 使用行为分析软件打开模板文件，转到 文件 > 保存为 创建一个相同的新文件。
- 在欢迎界面中，选择 新模板 > 应用了自定义模板 > 从视频文件 （选择模板。EthXV 文件）。命名新实验并选择其存储位置。软件可能需要几分钟时间从模板文件复制信息。
- 前往 竞技场设置 如果使用不同的摄像机录制视频，则需重新调整模板（按照步骤 4.6 和 4.7 操作）。
- 前往 检测设置 或 采集 检查已选中的视频，并在需要时更改视频文件。
- 下 采集，选择 DDS > 准备开始软件处理视频可能需要几分钟时间。
- 当采集完成后，前往 轨迹编辑器选择16倍加速以更快地读取处理后的视频，并检查追踪是否正确。
注意：有时可能会有 "损失" 在追踪过程中（由于反光或软件自身的混淆）可能出现错误。如果错误较少，可在此部分手动编辑修正；否则，建议重新处理整个实验，优化画布定义和检测效果。 - 下 统计学，点击 计算 > 导出数据数据导出直接位于实验文件夹中。
- 下 轨迹可视化 或 热图，生成并导出（右键单击，选择“导出图像”，然后选择文件夹 导出文件 实验过程中用于保存数据并与电子表格报告关联的动物追踪图像
- 前往 文件 至 关闭 主动实验，并对下一个视频重复此步骤。
5. 统计学分析
- 使用Shapiro-Wilk检验分析每组数据的正态性。
- 使用Levene检验评估数据的方差齐性。
- 当正态性和方差齐性的检验结果未被拒绝时，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Dunnett和Tukey多重比较检验，以分析组间差异。
- 当正态性或方差齐性检验结果被拒绝时，采用Kruskal-Wallis检验，并结合Bonferroni校正进行两两比较，以分析组间差异。
- 使用图形软件绘制数据图表。
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结果
在本节中，我们将探讨这些行为学工具在鱼类神经毒理学中的一些可能应用。以下结果对应于娱乐性药物甲基苯丙胺（METH）的急性或暴发性效应，以及草甘膦亚慢性效应的表征，草甘膦是水生生态系统中主要的除草剂之一。
成年斑马鱼甲基苯丙胺暴发性神经毒性模型的表征
在评估40 mg/L METH对NTT的影响时（图3），Kruskal-Wallis检验证实，暴露动物表现出正向地理趋向性，其特征为在实验水箱上层区域的探索时间减少（H(2) = 35.964，P = 1.55 × 10-8），在该区域移动的距离减少（H(2) = 32.272，P = 9.82 × 10-8），以及进入该区域的次数减少（H(2) = 36.527，P = 1.17 × 10-8）...
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讨论
在NTT中观察到的典型焦虑行为与大脑中分析得到的5-羟色胺水平呈正相关21。例如，暴露于对氯苯丙氨酸（PCPA）——一种5-HT生物合成抑制剂——后，鱼类表现出正向趋地性以及脑内5-HT水平降低22，该结果与甲基苯丙胺（METH）处理所获得的结果非常相似。因此，METH暴露的斑马鱼脑内5-羟色胺水平降低并表现出正向趋地性，提示该药物引起焦虑行为是通过5-羟色胺能通路介导的。有趣的是，在成年斑马鱼中，暴露于两种具有环境相关浓度的草甘膦（0.3 µg/L 和 3 µg/L）2周后，也可观察到类似的表型，即对趋地性产生促焦虑效应。此前也有报道显示，成年斑马鱼暴露于神经毒素丙烯酰胺后，趋地性增加6,23。在所有这些情况下，这种行为表型（NTT中趋地性增加，为促焦虑物质的特征）均与单胺类神经递质水平的降低相关。因此，NTT范式结合脑部神经化学分析，可提供生态学相关的资讯，包括探索行为、觅食效率，并将行为神经表型与神经递质调节联系起来。<...
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披露
作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
本工作由西班牙科学与创新部的“"Agencia Estatal de Investigación"（项目编号 PID2020-113371RB-C21）、IDAEA-CSIC 以及卓越 Severo Ochoa 中心（CEX2018-000794-S）资助。Juliette Bedrossiantz 获得了由西班牙政府与欧洲社会基金（ESF）共同资助的博士生奖学金（PRE2018-083513）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 水族箱 立方体形状 | Blau Aquaristic | 7782025 | 立方全景 10 (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm) |
| Ethovision 软件 | Noldus | Ethovision XT | 版本 12.0 或更新 |
| GigE 相机 | Imaging Development Systems | UI-5240CP-NIR-GL | |
| GraphPad Prism 9.02 | GraphPad 软件公司 | GraphPad Prism 9.02 | 适用于 Windows |
| IDS 相机管理器 | Imaging Development Systems | ||
| LED 背光照明 | Quirumed | GP-G2 | |
| SPSS 软件 | IBM | IBM SPSS v26 | |
| uEye Cockpit 软件 | Imaging Development Systems | 版本 4.90 |
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