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远程神经元激活结合自动化采血以诱导并测量小鼠循环黄体生成素

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DOI：

10.3791/65875

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2023年8月25日

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1Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, 2Mouse Metabolic Phenotyping Center-Live, University of Michigan, Ann Arbor

本文内容

摘要

黄体生成素（LH）的脉冲式分泌是生殖功能的显著特征。本文介绍一种通过远程激活特定神经元群体并结合连续自动采血的实验方案。该技术可实现定时激素调控、多重检测，并最大限度减少操作干预对清醒、自由活动且未受干扰动物体内LH水平的影响。

摘要

循环黄体生成素（LH）水平是评估下丘脑-垂体对生殖功能调控作用的重要指标。目前，多种输入信号及神经元群体在调节LH释放中的作用仍不明确。在小鼠中检测LH水平的变化常常具有挑战性，因为其极易受到环境应激的干扰。现有的测量LH释放及其脉冲波动的技术需要对小鼠进行长期训练，以适应操作应激、一定程度的束缚以及研究人员的存在，且通常只能针对单个动物进行，从而限制了其在许多研究问题中的应用价值。

本文介绍了一种利用仅由设计药物激活的设计受体（DREADDs）技术，结合自动化连续采血系统，在清醒、自由活动且未受干扰的小鼠中远距离激活特定神经元群体的技术。我们首先描述了立体定位手术方案，用于将表达DREADDs的腺相关病毒（AAV）载体递送至特定神经元群体。接着，我们介绍了颈动脉和颈外静脉插管的实验步骤，以及术后与CULEX自动化采血系统的连接方法。最后，我们阐述了通过静脉注射氯氮平-N-氧化物以实现远距离神经元激活及自动化血液采集的操作流程。该技术可在设定时间段内按程序实现每5分钟或更长时间间隔的自动化采样，并可在指定时间点或持续时间段内进行静脉给药。总体而言，我们发现该技术是研究神经内分泌调控的一种强有力的方法。

引言

下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的核心调控机制是促性腺激素释放激素（GnRH）以脉冲方式释放进入垂体门脉系统。在垂体中，GnRH 控制促性腺激素——黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）——以脉冲形式释放到循环系统中。LH 的脉冲式释放是中枢 HPG 轴功能的标志性特征1,2,3,4。例如，它可反映遗传改变或激素及环境因素变化对轴的神经部分的影响5,6,7。直到最近，由于需要高频采样和较大的血样体积才能识别脉冲，LH 脉冲模式的测量仅限于大型哺乳动物8和大鼠9。

检测小鼠中的黄体生成素（LH）脉冲具有重要意义，因为该物种拥有广泛的遗传模型，且易于通过基因组工程技术进行操作，从而进一步研究特定基因和细胞群体。在过去十年中，利用夹心法黄体生成素酶联免疫吸附测定（LH ELISA）分析小鼠体内LH浓度的技术取得了重大进展，使得仅需微量血液即可检测LH10。频繁尾尖采血技术的发展，使得能够进行高频次采样，从而实现对小鼠LH脉冲频率和幅度的准确检测10,11。然而，尾尖采血仅适用于清醒状态下的动物，需要较长的训练周期，使小鼠适应操作过程以及采样期间特定研究人员的存在。该方法的成功率极易受到环境应激因素的影响，可能不适用于表现出高度焦虑行为的小鼠品系。心房插管技术也曾用于自由活动的清醒小鼠的频繁采血12。然而，该方法仍需重复手动采血，限制了动物的活动空间，且心房插管可能引起心脏功能的动态变化。因此，建立一种在无应激条件下，无需预先训练、无需人为操作或人员在场，即可对清醒、自由活动且不受干扰的小鼠进行血液采集的方法具有重要意义。

自动化的血液或透析液采样此前已被用于测量不同激素水平（例如褪黑素13,14）及其脉冲式分泌（例如生长激素）15，在未束缚的啮齿类动物中进行。本文介绍一种针对清醒且未束缚动物的自动化长期频繁采血方案，并结合化学遗传学技术实现对特定神经元群体的远程时序激活： 即仅由设计药物激活的设计受体（DREADDs）。我们将描述腺相关病毒（AAV）载体的立体定位注射，以及通过自动化静脉（IV）给予氯氮平-N-氧化物（CNO）实现远程激活16,17。该方案可同时在多只动物中顺序检测黄体生成素（LH）脉冲的基础水平及诱导后的变化。血液采样和化合物的静脉给药均由计算机程序精确控制时间，无需研究人员亲自在场，也无需预先训练小鼠。该方法克服了手动采血的主要局限性，能够在无应激条件下进行血液采集，并实现静脉给药与远程神经元活动调控的同步操作。我们展示了单独使用自动化采血或将其与远程神经元激活结合的代表性结果，并讨论其优势、局限性及其他潜在应用。

方案

所有动物实验操作均依照《美国国家研究委员会实验室动物护理与使用指南》进行18 以及联邦、州和地方法律。本方案演示使用成年雌性小鼠（3-6月龄），包括4只C57BL/6J雌性小鼠和4只Kiss1-Cre;ChR2-eYFP（Kiss1-eYFP）雌性小鼠。小鼠饲养于12小时光照:12小时黑暗循环条件下，环境温度控制在22 °C，并提供标准饲料喂养 随意摄取 采用低植物雌激素饮食。实验操作和方案已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC，动物实验方案编号：PRO00010420 和 PRO00010138）的批准。

1. 将 AAV 递送至特定细胞群体的立体定位注射

  1. 手术准备
    1. 对所有器械进行灭菌。准备多套外科手术器械包，确保每套器械包用于不超过五只动物。准备无菌手套，每只动物至少使用一副。
    2. 使用以下参数（参见材料表）拉制用于注射的玻璃微电极，以获得细长、注射平稳且不易堵塞的微电极：加热1：915，加热2：630，拉制：630。根据不同的拉制仪优化上述参数。
    3. 在指定的手术区域进行操作。使用70%乙醇对术区表面进行消毒。
    4. 使用无菌手术单以维持手术区域的无菌状态。穿戴洁净的实验服或一次性手术衣，并佩戴口罩。
    5. 准备吸入式麻醉系统。打开氧气供应，并将流速调节至0.8 L/min。
  2. 手术操作
    1. 将小鼠放入麻醉箱，开启异氟烷至2.5%。初始诱导后将异氟烷流量降至2%，并在整个手术过程中维持该流量。如采用其他麻醉方法，请参照动物实验方案及当地伦理委员会指南。
    2. 根据动物使用委员会建议及当地法规，预先注射镇痛剂（卡洛芬，5 mg/kg，皮下注射）。
    3. 使用电动剃毛器剃除小鼠头部毛发。
    4. 将动物固定于立体定位仪上，安装耳杆，并确保头部正确固定且稳定。将小鼠的嘴部固定在咬合器上，注意将舌头移至一侧并置于口外，以防窒息。
    5. 手术开始前通过脚趾夹捏测试确认动物已深度麻醉，并在手术过程中持续监测其呼吸频率和体色变化。
    6. 在小鼠身体下方放置垫高支撑物，以保持躯干与头部处于水平位置。使用覆盖纸巾的加热垫为动物保温。双眼涂抹眼膏，防止角膜干燥。
    7. 尽可能保持手术区域清洁。佩戴无菌手套。在切开皮肤前，使用碘伏和酒精对小鼠头部进行消毒。使用手术刀沿中线切开头皮，切口范围约从眼后至人字缝后方。暴露颅骨后，用浸有无菌0.9% NaCl溶液的棉签清洁表面。
    8. 找到前嗅静脉（RRV），并用无菌记号笔标记。后续操作使用体视显微镜进行。
      注：我们发现以前嗅静脉作为前后方向（AP）参考点效果更佳，但通常以前囟（bregma）作为参考。
    9. 使用无菌针头作为参考，确认在进行立体定位测量前脑部方向正确。同时确保前嗅静脉和人字缝处颅骨表面的高度以及左右倾斜度一致（± 0.02 mm）。
      注：当注射靶点位于更外侧的脑区时，左右倾斜度的影响更为显著。
    10. 将无菌玻璃微电极吸入待注射的病毒溶液。将其移至前嗅静脉处作为前后方向（AP）零点参考。沿矢状缝移动至目标AP坐标位置，用无菌记号笔标记该位置，抬起针头，随后进行颅骨开窗。
    11. 小心钻出围绕标记点的小圆孔，避免损伤上矢状窦。钻孔时将钻头倾斜而非垂直放置，以减少钻孔压力。使用小镊子移除颅骨碎片。
    12. 暴露血管后，以上矢状窦中线作为内外侧（ML）参考（即0点），此方法比使用矢状缝更为精确。移动至目标ML坐标位置。将微电极下降至接触硬脑膜，作为背腹向（DV）参考（即0点）。轻微刺破硬脑膜后，将微电极继续下降至目标DV位置。
    13. 注入所需体积的AAV病毒（50–200 nL），留置微电极3分钟以确保液体充分扩散。随后小心将微电极从脑组织中撤出。
    14. 松开耳杆，解除动物固定。使用手术夹或其他合适方式缝合皮肤。将动物置于独立的加温笼中恢复。密切观察其苏醒后的恢复情况、反应性及活动能力。待完全恢复后，将小鼠放回原饲养笼。
  3. 在进行后续实验步骤前，至少等待3–4周以确保病毒充分表达。

2. 颈静脉和颈动脉插管

  1. 手术准备
    1. 在指定的手术区域进行手术操作。在开始操作前，使用70%乙醇对手术台面进行消毒。准备多套手术器械包，确保每套器械包用于不超过五只动物。
    2. 将所有手术器械进行高压灭菌。随后，在每次手术之间使用无菌水或生理盐水清洗，并按照制造商说明使用热珠灭菌器对器械灭菌至少15秒。
    3. 使用无菌手术巾以维持手术区域的无菌状态。穿戴洁净的实验服或一次性手术衣，并佩戴口罩。
    4. 准备用于颈动脉和颈外静脉插管的微型导管。动脉导管由一段微小的Microrenathane管（拉伸后外径[OD]为0.025英寸，内径[ID]为0.012英寸）与Silastic管（外径0.025英寸，内径0.012英寸）连接而成；静脉导管仅使用Silastic管（外径0.025英寸，内径0.012英寸）。所有导管在手术前需在70%乙醇中浸泡过夜。
    5. 根据动物的体重和体长预估长度，将两根导管的切割端以45°角进行斜面处理。
  2. 手术操作
    1. 使用台式低流量异氟烷系统，以2%异氟烷对动物实施麻醉，以精确控制手术期间的麻醉深度和阶段。
    2. 预先注射镇痛剂（卡洛芬，5 mg/kg，皮下注射），并涂抹眼用软膏以防止角膜干燥和损伤。
    3. 剃除颈部腹侧和背部区域的毛发，并使用碘伏溶液与70%乙醇交替清洗皮肤三次。在肩胛骨之间做一条垂直皮肤切口（12 mm），并用手术纱布覆盖以备后续使用。将动物置于仰卧位，头部朝向术者。
    4. 以下所述操作的大部分步骤均使用体视显微镜进行。
    5. 在颈部右侧锁骨上方做一小段垂直切口（约10 mm），剪开皮肤后使用尖端精细的无齿显微镊进行钝性分离，以暴露皮下组织，进而显露右侧颈外静脉和右侧颈总动脉。
    6. 结扎颈外静脉远端以阻断血流，使用显微镊和剪刀在塌陷的静脉壁上剪开一小孔。将静脉导管斜面朝下、近端朝前插入，使用显微镊辅助推进，使其经上腔静脉到达右心房水平。对于体重30 g的瘦小小鼠，插入长度约为10–12 mm。使用7-0丝线将导管与血管结扎固定。
      注：当导管位置正确时，可轻松回抽血液；否则导管可能误入胸外侧静脉，需重新插入。
    7. 仔细分离结缔组织，暴露位于胸骨舌骨肌、胸锁乳突肌和二腹肌所围成三角区域内的右侧颈总动脉。必要时使用金属牵开器分离上述肌肉。在颈内动脉与颈外动脉分叉处使用7-0丝线结扎动脉，并预先放置两根未打结的缝合线环于近端。
    8. 通过牵拉预先放置的缝合线环暂时阻断血流，使用显微剪刀或27 G针头在血管壁上剪开或穿刺一小孔。将动脉导管斜面朝下、近端朝前插入至预估长度，使其到达主动脉弓水平但不接触主动脉瓣。对于体重30 g的瘦小小鼠，插入长度约为9–10 mm。使用两根预先放置的缝线将导管与血管结扎固定。
    9. 将所有导管经皮下隧道引出，通过预先切开的背部切口穿出，并连接至由25 G针管制成的硅胶涂层管路连接器的静脉或动脉接口：该连接器为改良型MASA19，由两段25 G针管和两段4.0 cm长的PE-20管组成，外层套有2.0 cm长、内径0.062英寸的Silastic管，并附带一小段金属丝制成的环。每根导管（含连接器）的总管腔体积为6–8 µL（图1A）。
    10. 缝合腹侧切口，并在背部皮肤缝合时将连接器皮下固定。用肝素化生理盐水（200 U/mL）充满两根导管，并用不锈钢手术丝线紧密封堵末端。
    11. 小鼠在数分钟内即可从异氟烷麻醉中恢复，术后5天内完全康复。手术后24小时将动物放入自动化采血饲养舱，通过将系统上的系绳挂钩连接至颈部背部植入的管路连接器上的金属环，使动物与系统相连。在采血开始前24小时，将动脉和静脉导管分别连接至系统的采样管路和注射管路（图1B）。采样管路总长度为55 cm，管腔体积为40 µL。
      注：注射与采样管路的设置、采样程序的编程以及自动化采血系统笼体的平衡机制已有详细描述20,21。该系统通过每20分钟自动注入10 µL肝素化生理盐水以保持导管通畅。
    12. 通过系统的计算机程序设定给药前采样、给药及给药后采样的时间与频率。当前参数设置详见下文步骤3.1。
    13. 该系统通过感知小鼠运动并使饲养舱向相反方向旋转，使动物可在不缠绕采样和/或输注管路的情况下自由活动21（图1）。
    14. 在输注或注射开始前至少2小时，重新填充输注或注射管路中的化合物，并重新连接至静脉导管。
      ​注：手术可能出现并发症，需密切监测动物术后恢复情况及术后数日的状态。请参照动物实验方案中的正确监测方法、终止标准及相关操作流程。

3. 自动化采血与静脉注射

  1. 自动采血
    1. 要遵循本方案，请使用一个 采样体积 的 20.0 µL 并设置一个间隔 即， 7.0 分钟) 每次取样之间 具有一个 采样频率 的每一 每样本 10.0 分钟。该 最大速率 连续采样 3.0 分钟/样品；该 最小值 可能的 采样体积 是 5.0 µL系统会自动回输等量的生理盐水以替代采集的血液，维持体液平衡。
    2. 设定 总采样时间 作为 30 (t = -30 - 0分钟前和 30 (t = 0 - 30) 分钟 在静脉注射CNO（0.5 mg/kg， 图2).
    3. 每份采集的血液样本（20.0 µL）将被自动稀释于 50 µL 生理盐水（含 10 U/mL 肝素） 并由系统存放在冷藏样品转盘中的微量离心管内，单独保存。
  2. 自动静脉注射
    1. 在采血开始前至少2小时，断开静脉管路与静脉导管的连接，重新填充CNO（按0.5 mg/kg剂量计算，体积约为50–60 µL）。
    2. 用注射器从管路中逆行手动抽出溶液（略多于计算体积），在溶液与管路中已有的生理盐水之间留出一个小的气泡。
    3. 重新连接注射管路至静脉导管，并设置 注射速率 在 500 µL/min 以及 注射开始时间 在 2 分钟 t = 0 采样结束后。该 每只动物的总注射时间 是 5-6 秒.
      注意：如有需要，也可通过手动腹腔注射（IP）给予化合物，但这将在血液采集程序期间或之前干扰动物。我们在结果部分也展示了这一替代方法。

4. 动物灌注和脑组织采集（可选）

注意：仅当需要分析神经元激活的脑区位置或下游反应时，才应遵循此操作步骤。

  1. 在采血程序结束时，将小鼠从采血系统中断开。静脉注射后2小时，使用首选方法或如其他文献所述方法，用10%中性缓冲福尔马林（NBF）灌注动物22。
  2. 解剖脑组织，并将其保存于含20%蔗糖的10% NBF溶液中固定3小时。
  3. 3小时后，将固定好的脑组织转移至含20%蔗糖的PBS溶液中，于4 °C保存，直至准备切片。
    注意：避免过度固定，否则会掩盖cFOS抗原。在20%蔗糖溶液中，脑组织应沉入容器底部。
  4. 使用冷冻切片机或恒冷切片机进行切片，并采用合适的方法检测神经元激活情况（例如，本文展示了cFOS免疫组织化学染色结果）。
    ​注意：本实验所用抗体详见材料表。

5. 样品处理与分析

  1. 实验结束后立即将血样从自动采样器中取出，并置于冰上。
  2. 以 14,000 × g 离心 30 秒。
  3. 收集血浆，于 -80 °C 保存直至分析。
  4. 按照先前所述方法10,23，采用 LH ELISA 检测血样。

结果

表达Kisspeptin的神经元（Kiss1 位于下丘脑弓状核的基因是促性腺激素释放激素（GnRH）的强效刺激因子，因而也是垂体释放黄体生成素（LH）的强效刺激因子24,25在本方案演示中，我们采用促性腺激素释放肽（kisspeptin）诱导的黄体生成素（LH）分泌来展示自动采血技术的操作流程。 图2 显示成年 Kiss1-eYFP 雌性小鼠的代表性 LH 模式，这些小鼠此前在弓状核（AP: -4.95，ML: -0.35，DV: -5.7）接受了单侧立体定位注射 AAV-hM3Dq-mCherry。ChR2-eYFP 用作荧光报告分子 Kiss1 细胞。立体定位手术一个月后，小鼠接受颈动脉和颈静脉插管，并在术后第4天连接至自动采血装置。术后次日开始采集血液以测定基础LH水平，采样频率为每10分钟一次（样本间间隔7分钟，每次采样持续3分钟），随后自动进行尾静脉CNO注射，并继续每10分钟采血一次，持续30分钟。动情间期的LH水平通常较低（图2A），但由于其脉冲式释放，通常会观察到变异图2B）。在注射CNO（并激活kisspeptin神经元）后，LH水平迅速上升（10分钟内）。上升的幅度和峰值持续时间取决于多种因素，包括注射位点、被激活的神经元数量或所靶向的神经元群体。

图3展示了雌性小鼠弓状核中注射位点，该位点对应于图2A所示位置。Kiss1-eYFP神经元以绿色标记，而mCherry免疫反应性显示了AAV注射位点以及CNO处理后的激活区域。通过DAB标记的cFOS免疫反应性检测到被激活的神经元。大多数mCherry神经元与Kiss1-eYFP共定位，且其中许多神经元呈现cFOS免疫反应阳性，表明病毒转染及神经元激活特异性地发生在目标神经元群体中。

典型的黄体期野生型（C57BL/6J）小鼠促黄体生成素（LH）脉冲式释放模式及其对腹腔注射kisspeptin-10的反应如图所示 图 4小鼠在手术后4天进行颈动脉插管，并连接至自动采血系统。次日早晨检测动情周期，并在动情间期进行采血和醋酸酮戊环庚肽（kisspeptin-10）注射。26每7分钟采集一次血液样本，持续2小时（注射前120分钟内，每4分钟间隔加3分钟采样），以测定黄体生成素（LH）的基础水平及脉冲分泌特性；随后腹腔注射kisspeptin-10（65 µg/kg），并在之后继续每7分钟采样一次，持续30分钟。观察到典型的动情间期雌性动物的清晰LH脉冲，表现为低基础LH水平、脉冲频率约为每小时2次，脉冲幅度约为1 ng/mL27注射kisspeptin后，黄体生成素（LH）出现迅速且显著的升高28促性腺激素分泌模式及刺激后的变化与其他采用手动采血的研究结果一致10,27,29,30这些结果表明，自动化采血方法能够在无应激条件下捕捉到典型的以及受刺激的黄体生成素分泌情况。

神经生理学实验装置；A：探针示意图；B：小鼠探针用于数据采集。
图1：连接系统及小鼠与输注和采样系统管路连接的细节。（A）一种使用两个25G针头管和两段PE-20管、外层套有硅胶管并连接一个小金属环制成的硅胶涂层管路连接器（MASA）。（B）一只小鼠在采样笼中与输注和采样管路相连，于采血期间静卧于巢穴中。请点击此处查看该图的放大版本。

Kiss1-CRE 实验图；注射 CNO 后 LH 水平的时间过程分析示意图。
图 2：在弓状核注射 AAV-hM3Dq 并通过 CNO 远程激活的 Kiss1-Cre 雌性小鼠中 LH 脉冲的代表性结果。 基础 LH 水平每 10 分钟测定一次，持续 30 分钟。在时间点 0（采血后），雌性小鼠接受静脉注射氯氮平-N-氧化物（clozapine-N-oxide，0.5 mg/kg），随后继续从颈动脉每 10 分钟采血一次，持续额外 30 分钟。（A）显示基础 LH 水平较低的雌性小鼠。（B）显示注射前出现 LH 脉冲的雌性小鼠。缩写：Kiss1 = Kisspeptin；AAV = 腺相关病毒；CNO = clozapine-N-oxide；LH = 黄体生成素。请点击此处查看该图的放大版本。

Neural tissue microscopy, fluorescent markers. Diagram shows neural connections, cellular structures.
图3：Kiss1-Cre;Chr2-eYFP（Kiss1-eYFP）雌性小鼠弓状核中的脑区激活情况示意图 图 2A. ChR2-eYFP 仅用作报告基因以标记 kiss1 神经元。 (A低倍荧光图像显示在弓状核中的AAV注射位点。绿色：eYFP免疫反应性，洋红色：mCherry免疫反应性。B低倍明场成像对应区域的图像 图3A，显示弓状核内AAV注射位点的cFOS免疫反应性（黑色）。(C高倍荧光与明场图像结合，展示神经元的更清晰细节 图3A，B共表达AAV-mCherry且被激活的Kiss1-eYFP神经元表现为白色胞质和黑色细胞核（箭头所示）。比例尺 = 50 µmA，B），20 µm（C缩写：Kiss1 = Kisspeptin；AAV = 腺相关病毒；eYFP = 增强型黄色荧光蛋白。 请点击此处以查看此图的放大版本。

发情间期雌性 LH 水平图；显示 Kisspeptin-10 注射随时间对激素测定的影响
图 4：每 7 分钟测量一次、持续 2 小时的发情间期野生型雌性基础 LH 脉冲分泌。 随后，该雌性在 0 时刻接受腹腔注射 kisspeptin-10（65 µg/kg），并在之后半小时内每 7 分钟持续采集一次血样。缩写：LH = 黄体生成素。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

通过本方案，我们能够显示神经元群体在基础状态下的黄体生成素（LH）脉冲式分泌以及刺激后的LH分泌。该系统的主要优势在于采样过程处于无应激的环境中，采样期间无需人员在场或对动物进行操作。此外，实验前无需耗时的动物训练，也无需让动物适应人员在场或操作。以往采用手动采血的实验需要投入大量时间和精力以尽量减少应激因素7,31,32。然而，仅剪尾操作本身即构成一种应激刺激33。在共享动物设施中实施无应激环境和训练范式可能受到不可预测干扰的限制。在某些实验室中，动物通常需要被转运至其他操作室进行采血。这些限制可能使手动方法不适用于检测LH水平的细微变化，因此在这些情况下，非接触式方法可能更为适用。自动采样系统设置于安静的房间内，小鼠需提前数天放置其中以适应新环境。我们此前使用该方案的经验表明，可精确检测小鼠皮质酮和脉冲式生长激素的分泌模式，并且在自动采样过程中未观察到皮质酮水平升高15。在本研究的实验中，所有动物均很好地适应了采样系统，在采样约24小时后于采样舱内表现出筑巢行为，毛发色泽光亮，表明其无应激反应且整体健康状况良好（图1）。

导致实验结果呈阴性的主要困难可能是腺相关病毒（AAV）未能准确靶向目标神经元群体。立体定位注射的精确性至关重要，因此应在正式实验前进行预训练，以验证注射坐标和注射体积。预训练可通过在非存活手术中向目标位置注射少量0.5-1%伊文思蓝溶液实现，随后使用小鼠脑切片模具（例如Ted Pella）对新鲜解剖的脑组织进行切片，并借助体视显微镜观察注射位点及范围，以确认注射准确性。

还需要注意的是，从自动采血系统收集的血液和血浆会被肝素化生理盐水稀释（例如，在我们的结果中，20 µL 血液稀释于 50 µL 生理盐水中）20，且可能需要根据所选分析方法的灵敏度调整稀释比例。我们测试了将全血稀释于 BSA-PBS（如超敏 LH ELISA 所推荐）10 或生理盐水中检测 LH 水平，发现 LH 测定值无差异。稀释液中不能使用 Tween，因为其会进入血液循环，通过替换样本液体来提取样本20。根据我们的经验，稀释倍数小于 1:10 时可获得良好的 LH 检测结果，但与 1:3.5 稀释相比，LH 水平略有低估。这表明如有必要，可进一步调整稀释比例以减少采集的血量。

一种替代自动化化合物递送的方法是通过静脉导管进行手动注射。在此情况下，研究人员会短暂进入房间以完成注射操作。然而，该过程不涉及与动物及其饲养环境的直接接触，并且与腹腔或皮下注射不同，动物通常不会察觉整个操作过程。手动注射的优点在于无需预先配制化合物稀释液，这对于那些因成本过高而不适合在较大体积中使用，或随时间推移易发生降解的化合物尤为重要；此外，由于操作体积较小，相较于自动化递送（后者需要以更多化合物溶液预填充输注管路和导管）更为节约。

自动采血为研究睡眠期间黄体生成素（LH）的变化提供了独特的机会。我们经常观察到动物在采血期间于巢穴中自然睡眠。该采血过程可与脑电图（EEG）记录相结合，从而更详细地分析神经活动与LH分泌模式之间的关系34。如本研究所示，自动采血的应用范围广泛：既可用于基础状态下的LH采样，也可用于检测LH对内源性或外源性化合物的反应，或对神经元群体进行激活或抑制后的LH变化。神经元操控可通过化学遗传学或光遗传学进行急性干预，也可利用转基因小鼠模型及促凋亡或神经元沉默工具实现长期干预。自动采血还可用于检测其他具有强烈脉冲式分泌特征的激素（例如生长激素15）。在雌性小鼠中，若需特定动情周期阶段，可在启动实验方案前数小时小心采集阴道涂片26，而不会干扰输注和采血管路。动物可连接至采样系统达7–10天，但随着时间延长，动脉导管发生堵塞的风险会逐渐增加。

然而，该技术仅限于单独饲养的动物使用，因此可能不适用于研究社会互动行为。此外，该技术具有侵入性，且需要技术难度较高的手术操作，因此可能无法在幼年动物或某些疾病模型中实施。最后，由于购买该系统的成本可能过高，单个研究实验室难以承担，建议将其建立在核心实验室中，作为提供所述实验方案的服务平台。

综上所述，本实验方案展示了如何进行立体定位注射腺相关病毒（AAV）并结合自动化血液采样。该技术实现了精确的空间和时间控制，且可灵活应用于不同动物模型、检测方案及激素种类，因而是研究啮齿类动物激素调控的有力方法。尤为重要的是，该方法通过在注射和/或采样过程中消除人为干预和动物抓取，并省去前期训练步骤，为实验动物提供了无应激的环境。这些优势，加之多路复用的可能性，使该方法成为研究清醒、自由活动且不受干扰的小鼠神经调控激素变化的独特工具。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Daniel Haisenleder 博士在测试不同血液稀释方法过程中提供的帮助。血清激素检测由弗吉尼亚大学生殖研究中心配体检测与分析核心实验室完成，该实验室由 Eunice Kennedy Shriver 国立儿童健康与人类发育研究所（NICHD）资助项目 R24 HD102061 支持。密歇根小鼠代谢表型分析中心-活体（Michigan Mouse Metabolic Phenotyping Center-Live）由美国国立卫生研究院（NIH）中心资助项目 U2C DK135066 支持。JF 和 NQ 的研究工作获得资助项目 DK020572（MDRC）和 DK089503（MNORC）的支持。CFE 和 CSM 的研究工作获得 NICHD 资助项目 R21 HD109485 和 R01 HD096324 的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AAV8-hSyn-hM3D(Gq)-mCherryAddgene44361不一定必须使用该病毒，但代表性结果中使用的是此病毒
酒精消毒
麻醉诱导箱Vetequip
麻醉诱导机Kent Scientific EquipmentSomnoSuite
小鼠用麻醉面罩Kent Scientific EquipmentSOMNO-0801
9 mm 自动夹施加器Clay Adams427630
9 mm 自动夹移除器Clay Adams427637
9 mm 自动夹Clay Adams427631
BASi Culex 控制器CulexSN: 2151, 2152, 2156, 21584 个通道
BASi Honey Comb 组分收集器Honey CombSN: 2105, 2106, 2107, 21084 个通道
BASi Ratrun 旋转控制器RATURN 2SN: 5680, 5681, 5682, 56834 个通道
C57BL/6J 小鼠JAX # 000664
卡洛芬ZoetisRimadyl镇痛药
毛发修剪器Braun
氯氮平-N-氧化物ENZOBLM-NS105-0005
棉签
CULEX 自动化活体采样系统BASiDS000627含 CX-4000S 替换管路套装
带齿弯镊FST11151-10
钻机Dremel61100
Empis 控制模块EMPIS CMSN: 174
Empis 可编程输注系统EMPISSN: 2125 , 2126, 2127, 2128配备 CX-7010S 4 套 BAS-2 输注组件；4 个通道
Envigo 2016 饲料低植物雌激素饲料 
眼膏DechraPuralube Vet Ointment凡士林眼用软膏
玻璃移液管World Precision InstrumentsMIB100-6
止血钳Roboz Surgical   RS-7101
碘Betadine 外科洗手液
异氟烷VetOneFluriso麻醉剂
异氟烷蒸发器或 SomnoSuite 低流量麻醉系统Surgivet 或 Kent Scientific CorpSS-01麻醉机
Kiss1-Cre;ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) 小鼠 JAX # 023436 和 #024109
Kisspeptin-10Phoenix Pharmaceuticals048-56
Micro-renathane 管路 Braintree ScientificMRE025手术导管置入
微型剪刀Roboz Surgical  RS-5606
持针器Roboz Surgical   RS-7842
皮升级注射器Warner InstrumentsPLI-100A
移液管拉制仪Sutter Instruments P30
啮齿类动物加热垫 X2Stoelting53850
手术刀FST10003-12
剪刀Roboz Surgical  RS-6808
硅胶管Liveo 实验室管路NO.508-001内径 0.012 英寸 × 外径 0.025 英寸
立体定位仪RWDE06208
无菌 0.9% 生理盐水Baxter2F7124
无菌手术巾Dynarex4410
手术刀片SKLAR06-3011
手术体视显微镜Zeissf-160
镊子Roboz Surgical  RS-4960
镊子Roboz Surgical  RS-4972
镊子Roboz Surgical  RS-5058
抗体
抗-cFos MilliporeABE457抗原靶点：cFos N 端；宿主生物：兔；使用稀释度：1:5,000；RRID: AB_2631318 
抗-GFPAves LabsGFP-1010抗原靶点：重组 GFP 缺失型；宿主生物：鸡；使用稀释度：1:10,000；RRID: AB_2307313 
SP-生物素偶联的驴抗兔 IgG 二抗Jackson ImmunoResearch Labs711-065-152抗原靶点：兔 IgG (H+L)；宿主生物：驴；使用稀释度：1:1,000；RRID: AB_2340593 
驴抗大鼠 IgG，AlexaFluor 594 标记Thermo Fisher ScientificA-21209抗原靶点：大鼠 IgG (H+L)；宿主生物：驴；使用稀释度：1:500；RRID: AB_2535795 
山羊抗鸡 IgY，Alexa Fluor 488 标记Thermo Fisher ScientificA-11039抗原靶点：鸡 IgY (H+L)；宿主生物：山羊；使用稀释度：1:500；RRID: AB_2534096
mCherry 单克隆抗体 (16D7)Thermo Fisher ScientificM11217抗原靶点：mCherry 标签；宿主生物：大鼠；使用稀释度：1:5,000；RRID: AB_2536611 

参考文献

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