止泻药和植物提取物对黑腹果蝇效果的评估

胃肠道 （GI） 也称为消化道，负责营养物质的消化和吸收以及未消化产物的排泄¹.胃肠道容易受到一系列疾病的影响，这些疾病会引起不适、疼痛和日常生活中断。胃肠道疾病包括腹痛和不适、腹胀、胃灼热、消化不良或消化不良、恶心、呕吐、腹泻和便秘².腹泻是胃肠道疾病³ 最常见的症状，它被定义为在 24 小时内至少有 3 次稀便和水样便的疾病⁴。腹泻由多种病原体引起，包括细菌、病毒、寄生虫、真菌，也可能由药物引起 ^5,6。在世界范围内，腹泻仍然是 5 岁以下儿童死亡的第二大原因⁷.虽然腹泻可以自行消退，但如果持续超过几天，也可能表明存在更严重的潜在疾病。

为了研究肠道，研究人员转向小鼠、大鼠和猪等动物模型 ^8,9。然而，使用这些动物可能既昂贵又耗时，因为它们需要专门的设施和道德考虑。最近的研究表明，黑腹果蝇可以作为研究胃肠道的模型，并研究一些机制，例如维持再生稳态、免疫衰老的发展、上皮屏障功能的丧失和代谢稳态的下降^10,11。D. melanogaster，被称为果蝇，与人类具有高度的遗传同源性;大约 75% 的人类疾病基因被认为在苍蝇¹² 中具有功能同源物。它们还有一个简单的消化系统，包括前肠、中肠和后肠¹³。黑腹果蝇易于在实验室培养，可以以不同的方式进行基因改造¹⁴.因此，使用黑腹果蝇进行体内测试是一种强大的工具，使研究人员能够在受控环境中研究复杂的生物过程。

根据世界卫生组织 （WHO） 的数据，生活在发展中国家的约 80% 的人使用传统医学来满足其基本卫生需求¹⁵.药用植物的大量使用可以解释为它们易于获得、价格低廉且副作用小¹⁶.草药疗法中使用的主要植物部分包括叶子、树皮、根、种子¹⁷，而主要制备方法是输液、煎煮和浸渍¹⁸。这些草药含有植物化学物质，如生物碱、萜类、类黄酮、类固醇、单宁和碳水化合物¹⁹，对人体有治疗作用。人们使用各种药用植物来治疗胃肠道疾病，如腹泻、胃痛和痢疾²⁰.例如，番石榴是世界上最常用的治疗腹泻的植物之一。各种药理学和临床测试已经表明其安全性，这使其成为研究^21,22 的良好止泻候选药物。然而，草药的主要局限性是缺乏效率和安全性评估，以及缺乏关于所用植物提取物成分的明确和完整的信息²³。为了验证草药的有效性和安全性，需要一种涉及实验和临床验证的系统方法，并且该方法应得到来自体内和体外研究的足够数据的支持。

为了评估传统疗法在治疗腹泻方面的疗效，近几十年来，小鼠和大鼠的使用一直占主导地位^24,25。由于前面提到的主要优点，即易用性、价格实惠、可复制、保守的果蝇和哺乳动物之间的吸收和消化功能，我们建议使用黑腹果蝇作为模型来评估植物的止泻活性。黑腹果蝇的腹泻表型可以表征为几个特征，包括粪便沉积物的丰度增加、沉积物大小更大、颜色较浅（浓度较低）和粪便物质较高²⁶。这种表型可以使用各种参数进行量化:粪便沉积物数量、沉积物总面积、平均亮度和总综合光密度 （IOD）。总IOD定义为沉积物的总染料含量，即排泄的粪便总量²⁷。以前，已经开发了一种分析黑腹果蝇粪便沉积物的测定法 ^27,28。在该测定中，粪便的最终读取器（T.U.R.D.）被用作粪便分析工具，可以检查粪便沉积物的数量，大小和轻度，从而监测果蝇的肠道生理学。然而，这种方法从未用于评估果蝇的腹泻表型。离子转运肽 （ITP） 基因是口渴和排泄的重要内分泌调节剂，将水稳态与黑腹果蝇的摄食相结合。在最近的一项研究中，研究表明，食物在整个胃肠道中的运输速度和排便事件的频率因 ITP 过表达而降低，而 ITP 敲除则增加。本研究的作者将后一种表型描述为腹泻²⁹.

在该协议中，通过使用ITPi菌株作为腹泻模型，采用粪便沉积测定的修改版本来评估抗腹泻剂（即番石榴叶提取物）对黑腹果蝇胃肠道的影响。该方法的总体目标是:1）提供一种简单可靠的方法来评估药物和植物提取物的止泻作用，以及2）通过应用生物活性引导的方法，允许发现负责植物提取物中止泻作用的生物活性化合物。

1.制备植物提取物

1. 从一棵成年树上收集 Psidium guajava L.叶子³⁰ ，并按以下方法处理:将叶子在40°C的烤箱中干燥6天，然后风干6天，然后在40°C的烤箱中再次干燥4天，最后通过在研磨机或咖啡研磨机中研磨干燥的叶子来制备叶粉。
2. 将100g干燥粉末浸泡在1L96%乙醇中24小时，使用摇床连续搅拌。再次将植物残留物置于相同的过程中，并在40°C下使用真空旋转蒸发器在减压（175mbar）下将所得滤液蒸发至干燥。
3. 将植物提取物溶解在乙醇中以获得所需的浓度。通过测试一系列浓度来确定最佳浓度（使用此处描述的方案）。
   1. 对于植物提取物，测试浓度范围为 100 μg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL、100 mg/mL，并使用不影响苍蝇存活率的浓度范围。对于纯化合物，测试以下浓度范围:0.05、0.5、5 和 50 mM¹²。

2. 配制食品培养基

1. 测量 100 mL 蒸馏水，然后用 4 g 糖和 0.8 g 琼脂倒入烧杯中（见 材料表）。加热至100°C（同时搅拌）并保持10分钟。
2. 将温度降低至80°C，在搅拌的同时加入7.4克面粉和2.8克酵母。加热至少20分钟，仍然搅拌并控制温度，温度应在80°C左右。
3. 加入moldex-丙酸溶液（1 mL moldex 和 0.3 g 丙酸混合均匀）。等待温度降至50°C左右，加入植物提取物溶液（1mg / mL）和0.5g溴酚蓝粉。
   注意:有关要测试的其他浓度的更多详细信息，请参阅第 1.3.1 节。
4. 将食物倒入培养皿中，并在培养皿装满时停止（图1A）。让培养皿冷却至室温（约3小时），然后盖上盖子，并储存在4°C的冰箱中。
   注意:培养皿应在冰箱中存放不超过 2 周，以避免水分蒸发。

图1:粪便沉积试验的实验过程演示。 （A）显示装满食物培养基的培养皿的图像。确保培养皿中有足够的食物，这样就不会有缝隙困住苍蝇并阻止它们移动。但是，不要在培养皿中装满食物，以便均匀地覆盖表面。（B）协议中描述的刮刀图像。（C）协议中描述的粪便沉积测试的图像。 请点击这里查看此图的较大版本.

3.准备苍蝇

1. 准备 CO₂ 罐、带针的 CO₂ 吹气枪、飞垫、画笔和显微镜。飞行站为飞垫和吹气枪提供 CO₂ 。苍蝇垫用于分拣苍蝇，而 CO₂ 吹气枪用于麻醉小瓶、瓶子和培养皿中的苍蝇。
2. 通过选择含有蛹（至少10个）的小瓶来标准化苍蝇的年龄，并使用以下方法从管中丢弃成蝇。一个接一个地将小瓶倒置，将针头插入棉塞和小瓶侧壁之间。用CO₂ 吹气枪麻醉成年苍蝇，直到所有苍蝇都在棉塞上睡着（麻醉它们需要几秒钟，松开吹气枪后麻醉作用将持续几秒钟）。打开装有70%乙醇的玻璃瓶上方的小瓶，将苍蝇放入其中。用棉塞关闭小瓶，并将其保存在25°C和60%湿度的培养箱中。将培养箱的光照周期设置为12小时光照/12小时黑暗。
3. 孵育后（最多8小时），在显微镜下将它们分类为处女雌性和雄性，并通过将它们翻过来并观察它们的生殖器来飞垫。
   1. 与男性生殖器相比，女性生殖器是苍白的，男性生殖器呈红色。雄性也可以通过前腿上存在的深色刚毛（称为性梳）来识别。将苍蝇分成两个新鲜管（一个用于雄性，一个用于雌性），并在25°C下孵育6-8天。
      注:在25°C下，雌性在孵化后保持处女状态约8小时。

4.粪便沉积试验

1. 在培养皿上贴上相应的菌株、性别和药物标签，以避免培养皿之间混淆。将培养皿堆叠在一起。
2. 获取装有染色食物的培养皿，并将它们倒置在吸墨纸上以吸收多余的液体。使用刮刀（图1B），将食物切成12等份，然后用刮刀将一片放入空的培养皿中。
   注意:根据重复次数，每个培养皿最多可以增加要切割的切片数量，最多 20 个。每个切片的大小应相同。
3. 用 CO₂ 麻醉苍蝇，直到所有苍蝇都在棉塞上睡着了。在每个培养皿中转移六只健康的苍蝇（图1C），并立即盖上盖子，然后将它们放入培养箱中（25°C，60%湿度，12小时光照/ 12小时黑暗）。
4. 为确保苍蝇在实验过程中不会从培养皿中逸出，请用胶带固定培养皿的顶部和底部盖子。对于每个测试组，准备六个重复的培养皿（至少）。
5. 让苍蝇饲养24小时后，使用CO₂ 麻醉它们，将苍蝇转移到装有70%乙醇的容器中，并处理任何剩余的食物。
6. 保留培养皿并继续执行步骤5。

5. 培养皿的定量

1. 在计算机上设置一个文件夹并重命名它，包括实验菌株名称、苍蝇的性别和使用的药物类型。在此文件夹中，创建名为"原始"、"剪切"和"分析"的子文件夹。
2. 使用光学分辨率为 6,400 像素/英寸 （ppi） 的高分辨率扫描仪扫描培养皿。分别扫描每个培养皿的顶盖和底盖，将它们分别放置在扫描仪区域的中间。
3. 打开计算机上安装的应用程序。计算机屏幕上将打开一个欢迎窗口，其中包含所有常规设置（图 2A）。
   注意: 请勿修改高级设置。此步骤仅对拥有与 材料表中建议的相同扫描仪的用户有效。如果使用其他软件，请参阅指南。
   1. 在应用程序中命名培养皿，包括序列号、顶部或底部盖、性别和所用食物类型。选择在步骤 5.1 中设置的原始子文件夹。
   2. 预览培养皿。单击窗口底部的" 预览 "，等待几秒钟让扫描仪进行预扫描，然后计算机屏幕上会出现一个窗口。移动屏幕上显示的正方形以包围培养皿。
   3. 单击计算机屏幕上窗口右下角的 扫描 ，扫描会自动将扫描内容另存为所选文件夹中的图像。
4. 使用应用程序（例如，开源斐济应用程序）裁剪图像，以便不将人工制品和食物残渣视为沉积物。
   注意:以下步骤仅对拥有斐济应用程序的用户有效。如果使用其他软件，请参阅指南。
   1. 打开 Fiji 应用程序，等待几秒钟，直到屏幕上出现工具栏。
   2. 将要裁剪的图像拖动到工具栏上。在工具栏中选择第三个图标多边形选择，通过单击屏幕在饼图周围标记角度来裁剪照片中不需要的部分（彩色饼图）（图 2B-1,2）。
      注意:在图像中描绘裁剪区域时，所选帧必须端到端无缝连接。
   3. 单击栏左上角的"编辑"，然后单击"填充/清除外部"（图 2B-3）。
   4. 要保存照片，请单击栏左上角的 "文件 "，然后单击 "另存为"，最后单击 "Tiff"。选择在步骤 5.1 中设置的 子文件夹 Cut 。
      注意:保存裁剪后的图像时，请确保文件名中没有特殊字符（例如 ！、&、$、#、_,-,...）或字符过多。

图2:分析粪便沉积物测试数据过程中的关键步骤。 （A） 显示扫描应用程序设置信息的屏幕截图。（B） 使用斐济应用程序裁剪的图像。确保没有人工制品和食物残渣被视为沉积物。（C） 显示打开 Excel_merge-v4 应用程序时的屏幕截图。 请点击这里查看此图的较大版本.

6. 使用粪便开源软件的终极阅读器进行粪便沉积物识别

注:粪便软件终极阅读器的介绍和使用可以在 补充文件1中找到。

1. 首先，打开 T.U.R.D. 软件（补充图 1）。创建一个新实验并为文档命名，然后将其保存在步骤 5.1 中设置的"分析"子文件夹中。
2. 单击 "Plates "，然后单击 "Add plates"。选择要处理的培养皿。将出现一个新窗口，其中包含所选板的名称和新参数。设置块大小、偏移量、最小大小和最大大小（补充图 2）。
3. 要验证检测到的粪便沉积物是否正确，请单击" 板"，然后单击" 检查所选板"，然后单击" 图形"，然后单击" 查看注释图像 "（补充图3）。放大并查看计数。如果只有少数矿床不应包含在分析中，请取消选择要排除的矿床（补充图4）。
4. 对于要处理的每个新映像，请从步骤 6.3 重新启动。
5. 使用 T.U.R.D. 软件分析板后，通过单击"否"来修改苍蝇数量 。苍蝇 （补充图5）。
6. 通过单击 "板">"编辑组">"添加"来修改组名称，然后在 "组 列"上选择组名称。
7. 通过单击 "分析>描述性统计量">选择组 （补充图 6）分别导出不同的仿行数据。将所有电子表格文件 （.csv） 保存在同一文件夹中。
8. 为了将所有文件（在步骤6.7中获得）收集到一个唯一的电子表格中，打开应用程序Excel_merge-v4（补充编码文件1），等到出现以下句子选择文件夹的路径（包含.csv文件）:，然后粘贴上面的文件夹地址。例如，路径可以是 C:\Experiment\Fecal deposit test\，然后在键盘上单击 Enter 两次（图 2C）。之后，将在同一文件夹中创建一个新的电子表格文件。新的电子表格文件包括不同工作表中的所有导出文件。
9. 在上一个电子表格文件中，添加另一个工作表以收集所有仿行的每个参数的平均值（使用 VLOOKUP 函数处理数据）。 附表1中给出了一个例子。
10. 分析 p 值。

这里介绍的研究表明，可以通过使用粪便沉积测定来实现黑 腹果蝇 腹泻的测量。表型（腹泻与否）之间的显着差异可以通过分析各种参数来确定，包括粪便沉积物的数量、沉积物的总面积、沉积物的平均面积、平均亮度和总综合光密度 （IOD），IOD 是沉积物中存在的染料总量的量度，代表排泄的总粪便物质含量27。

果蝇中的 ITP 基因敲低可诱导腹泻表型，其特征是排便频率增加，使其成为研究腹泻的合适模型29。在该实验的背景下，使用 ITPi 菌株（w1118;daughterless-GeneSwitch，UAS-ITPi /（CyO））并在标准培养基上饲养。鉴于这种植物在热带地区广泛用于治疗腹泻，因此选择 番石榴 叶提取物作为止泻干预措施。Crofelemer是一种止泻药，被美国食品和药物管理局（FDA）批准用于缓解接受抗逆转录病毒治疗的成年HIV/AIDS患者的非感染性腹泻症状31。Crofelemer 是从 Croton lechleri Müll.Arg 的乳胶中提取的。茎皮32.洛哌丁胺是一种合成药物，在世界范围内用于治疗腹泻33.Crofelemer 和洛哌丁胺均被用作潜在的阳性对照。

假设是，与用正常食物喂养的果蝇相比，用番石榴提取物、Crofelemer 和洛哌丁胺喂养苍蝇会减少腹泻表型。为了验证这一假设，通过比较喂食正常食物的果蝇与喂食番石榴提取物（1 g/100 mL）、Crofelemer （1 g/100 mL） 和洛哌丁胺 （10 mM） 的果蝇之间的几个参数，对黑腹果蝇粪便沉积物进行了测量。对于实验设置，使用6-7天大的处女雌性或雄性。每个培养皿包含六只苍蝇，并进行了六次重复。将苍蝇饲养24 h，然后对每组进行分析。使用学生的 t 检验来比较测试组之间的显着差异。结果表明，与番石榴提取物（1 g/100 mL）组相比，正常食物组的粪便沉积物数量（图3A）、沉积物总面积（图3B）和总IOD（图3C）在处女雌性和雄性中都表现出显着更高的值。不幸的是，洛哌丁胺在两性中都没有显示出任何效果（但已经证明它在黑腹果蝇中起到解痉剂的作用）34，而克罗菲勒默只对雌性有影响。

图 3:ITPi 应变分析。在4种条件下分析ITPi菌株:以正常食物为食，补充1 g/100 mL番石榴提取物的食物，1 g/100 mL Crofelemer和10 mM洛哌丁胺。数据以雌性和雄性每种情况的平均±SD表示（培养皿两侧的六次重复）。使用比较两组的学生 t 检验进行统计分析。p 值如下所示: *: p < 0.05;**: p < 0.01;: p < 0.001， ****: p < 0.0001.（A） 比较了喂食补充有 1 g/100 mL Crofelemer、10 mM 洛哌丁胺、1 g/100 mL 番石榴提取物的食物的果蝇和喂食正常食物的果蝇的粪便沉积量。此外，还分析了处女雌性和雄性之间粪便沉积物数量的差异。在两组中，喂食正常食物的果蝇的粪便沉积数量明显高于喂食 1 g/100 mL 番石榴提取物的果蝇。（B） 比较了喂食正常食物的果蝇和喂食补充有 1 g/100 mL 番石榴提取物、1 g/100 mL Crofelemer 和 10 mM 洛哌丁胺的食物的果蝇的粪便沉积总面积。在雄性和雌性中，喂食正常食物的果蝇的粪便沉积总面积明显高于喂食 1 g/100 mL 番石榴提取物的果蝇。（C） 分析了以正常食物为食的果蝇与以补充 1 g/100 mL 番石榴提取物、1 g/100 mL Crofelemer 和 10 mM 洛哌丁胺为食的食物喂养的果蝇之间 ITPi 菌株总 IOD 的差异。在雄性和雌性中，喂食正常食物的果蝇的总IOD显著高于喂食1 g/100 mL番石榴提取物的果蝇。缩写:F = 女性;M = 男性;Crofe = Crofelemer;Lope = 洛哌丁胺;也没有食物=正常食物;P. gua ext = 番石榴提取物。请点击这里查看此图的较大版本.

为了证明在 番石榴 提取物组中观察到的排泄减少是由于提取物的抑制作用而不是食物消耗减少，我们进行了固体食物消耗量的直接摄入量估计和跟踪 （DIETS） 方法35。结果显示，除了雄性洛哌丁胺导致果蝇摄入的食物少于正常人外，药物供应组和未使用药物组之间的食物消耗没有显着差异（图4）。

图4:喂养试验。 喂养试验测量了果蝇的固体食物消耗量。用四种不同的培养基喂养果蝇:1 g/100 mL 番石榴 提取物、1 g/100 mL Crofelemer、10 mM 洛哌丁胺和普通食物。每组由 20 只苍蝇组成，有 5 次重复。数据以女性和男性每种情况的平均±标准差表示。使用比较两组的学生 t 检验进行统计分析。 p 值如下所示: *: p < 0.05;**: p < 0.01;: p < 0.001， ****: p < 0.0001. 请点击这里查看此图的较大版本.

粪便沉积物和饲养试验结果表明， 番石榴 提取物是治疗果蝇腹泻的可靠药用植物。

补充图1:T.U.R.D.打开窗口。请点击这里下载此文件。

补充图 2:T.UR.D. 窗口，设置有待调整。请点击这里下载此文件。

补充图 3:带有注释图像的 T.U.R.D. 窗口。请点击这里下载此文件。

补充图 4:T.U.R.D. 窗口显示已处理图像中检测到的每个点。请点击这里下载此文件。

补充图 5:T.U.R.D. 窗口显示每个处理后的图像。请点击这里下载此文件。

补充图 6:T.U.R.D. 窗口，显示导出每个组数据的过程。请点击这里下载此文件。

补充文件1:使用T.U.R.D.软件的快速指南。请点击这里下载此文件。

补充表 1:准备分析的最终电子表格示例。请点击这里下载此文件。

补充编码文件 1:合并电子表格的应用程序。 请点击这里下载此文件。

作者没有什么可透露的。