本方案通过结合苏木精-伊红（HE）染色与显微计算机断层扫描（Micro-CT）技术，提出了一种在骨质疏松小鼠模型中对骨微结构进行定量评估的经济且高效的方法。
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本文内容
摘要
摘要
骨微结构是指在显微水平上骨组织的排列方式和质量。了解骨骼的骨微结构对于揭示骨质疏松症的病理生理机制并改进其治疗具有重要意义。然而，由于骨组织坚硬致密，处理骨样本可能较为复杂；其次，专业软件的使用也使图像处理与分析变得困难。在本实验方案中，我们提供了一种经济高效且易于使用的骨小梁微结构分析解决方案，并详细列出了操作步骤和注意事项。微型计算机断层扫描（micro-CT）是一种非破坏性的三维（3D）成像技术，可提供骨小梁结构的高分辨率图像，能够对骨质量进行客观、定量的评估，因此被广泛视为骨质量评估的金标准方法。然而，组织形态计量学仍然不可或缺，因为它可提供关键的细胞水平参数，弥补了骨样本二维（2D）与三维（3D）评估之间的差距。在组织学技术方面，我们选择对骨组织进行脱钙处理，随后进行传统的石蜡包埋。总之，结合这两种方法可更全面、准确地获取骨微结构的相关信息。
引言
骨质疏松症是一种常见的代谢性骨病，尤其在老年人群中高发，与脆性骨折风险增加密切相关。随着骨质疏松症在中国的发病率不断上升1，对小型动物骨结构的研究需求也将日益增长2,3。既往测量骨量丢失的方法主要依赖于二维双能X射线吸收测定法的结果。然而，该方法无法反映骨小梁微观结构的改变，而骨小梁的微结构正是决定骨骼强度的关键因素4。骨的微结构直接影响其强度、刚度和抗骨折能力。通过比较正常状态与病理状态下骨微结构的差异，可识别骨质疏松症引起的骨组织形态、结构和功能的变化。这些信息有助于深入理解骨质疏松症的发生发展机制及其与其他疾病之间的关联。
微型计算机断层扫描（Micro-CT）成像近年来已成为评估骨形态的常用技术，可提供关于骨结构及密度参数（如骨体积分数、骨小梁厚度和骨小梁间距）的准确且全面的数据5,6。然而，Micro-CT 的结果可能受到分析软件的影响7。不同的商业 Micro-CT 系统采用各异的图像采集、评估和报告方法。这种不一致性使得不同研究之间报告的结果难以比较和解释5。此外，目前 Micro-CT 尚无法替代骨组织形态计量学，为研究人员提供关于骨骼系统细胞水平参数的信息8。相比之下，组织学技术能够实现对骨微观形态的直接观察和测量。苏木精-伊红（HE）染色是组织学中常用的染色方法，用于显示细胞和组织的一般结构，可用于识别骨组织的存在及其微细结构。
本文采用显微计算机断层扫描（Micro-CT）结合组织切片技术（苏木精-伊红[HE]染色）获取骨组织图像，并对小梁骨进行定量分析，以评估骨质疏松小鼠模型中骨微结构的变化。
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方案
动物实验方案已获成都中医药大学动物伦理委员会批准（记录编号：2020-34）。选用12周龄雌性C57BL/6J小鼠（n = 14），随机分为两组：假手术组（Sham组，n = 7）和模型组（OVX组，n = 7）。实验动物购自商业供应商（见材料表）。所有小鼠均单独饲养于温度22–26 °C、湿度45%–55%的环境中，适应新环境1周后开始实验，自由饮水并进食。所有动物实验均在成都中医药大学进行，实验过程中尽可能减少动物痛苦。
1. 动物模型制备
- 通过腹腔注射1.25%阿佛丁（Tribromoethanol溶于叔戊醇，参见材料表），剂量为0.02 mL/g，对12周龄小鼠进行麻醉。将小鼠俯卧位固定于无菌手术台上，并用胶带牢固固定其四肢。
- 使用剪刀（参见材料表）修剪可能影响手术操作的毛发。
注意：准备手术区域时应避免造成皮肤损伤。 - 彻底洗手并戴上外科手套。用聚维酮碘（参见材料表）对小鼠背部消毒三次，并用医用纱布（参见材料表）擦干。
注意：操作时需谨慎；消毒过程中若毛发过湿，可能导致小鼠术后低体温。 - 使用手术刀（参见材料表）在距小鼠背部中线三分之一处旁开1 cm的位置做一长约0.5–1.0 cm的切口。轻轻分离筋膜，并用组织剪（参见材料表）剪开肌肉，直至卵巢可见。用不可吸收缝线（参见材料表）结扎周围血管后切除卵巢。
- 用0.9%生理盐水冲洗术腔，然后分别缝合皮肤、肌肉和筋膜（参见材料表）。
- 在对侧重复相同的手术步骤。
- 切除与卵巢大小相当的卵巢周围脂肪组织，并对剩余步骤执行上述相同手术操作，以建立假手术模型。
- 术后给予1周恢复期。8周后，骨质疏松小鼠模型将成功建立9,10。
2. 微型计算机断层扫描（Micro-CT）
- 通过过量吸入 CO2 对小鼠实施安乐死。安乐死后，尽可能去除小鼠股骨上的软组织，并获取新鲜样本用于扫描。
注意：尽管目前尚无完美的样本保存方法，但可采取某些步骤以最大限度提高显微CT扫描结果的质量。在固定前，应尽量去除周围组织。福尔马林或缓冲福尔马林是最优选的固定方法，随后可储存于PBS中11,12。 - 双击桌面上的显微CT成像系统软件图标以启动系统（参见材料表）。选择与18 mm × 18 mm视场（FOV）相匹配的样品台。将合适的样品台装入仪器中，并关闭舱门。
- 在控制面板中点击预热按钮。
注意：需要短暂预热。当X射线正在产生时，切勿尝试打开舱门。请检查前面板和计算机显示器上的X射线开启指示灯，以确认X射线是否正在生成。 - 点击菜单按钮以创建新数据库，然后新建一个样本和研究项目。
- 从菜单下拉列表中选择手动模式，并在控制面板中输入自定义的电压和电流值。将电压（kV）设为90，电流（µA）设为80，扫描模式设为高分辨率、14分钟，视场（mm）设为18 mm × 18 mm。
注意：请参考不同显微CT系统的操作手册，以设置适当的参数。 - 使用塑料薄膜将骨骼牢固地固定在样品台上。关闭舱门。通过按下仪器上的调节按钮，确保样本在X射线捕获窗口中精确居中。
注意：调整样本时动作必须缓慢轻柔，以防样本意外落入仪器内部。 - 点击开始按钮以启动CT扫描。
3. CT 数据分析
- 启动软件（参见材料表），选择待分析的数据。点击Sub ，并将像素大小 设置为10 µm。移动并调整感兴趣区域（ROI）的大小，使其包含生长板上方的远端股骨。点击开始 （参见图1）。
注：选择10 µm作为亚体积重建的像素大小，是因为根据先前研究的组织学数据，成像小梁的厚度估计约为20–30 µm13。如果信噪比不足以进行数据处理，则必须进行高分辨率的1小时扫描。 - 点击3D分析按钮，以获得相应的3D重建结果。
- 将数据从显微CT系统导出至计算机进行分析。
- 导入重建后的CT数据。点击处理 > 图像计算器，然后点击区域填充 > 交互式。调整黄色复选框至适当的感兴趣区域（ROI）。
注：感兴趣区域（ROI）从生长板近端约540 µm处开始，向近端延伸1600 µm，以评估实际的骨代谢与骨重建情况。 - 选择骨微结构分析（BMA）插件（参见材料表）。点击分割皮质骨 ，然后点击分割小梁骨。
注：小梁骨和皮质骨将被自动选中。通常无需手动调整。 - 点击保存最终对象图 ，然后点击测量骨骼，以计算骨形态计量学参数。
注：此处仅计算了相对骨矿物密度（BMD），因为未添加对照样本。
4. 骨组织脱钙
- 将骨样本置于 4% 多聚甲醛（见材料表）中固定 24 小时。用 PBS（见材料表）清洗样本三次，每次 20 分钟。
- 用蒸馏水冲洗组织三次，每次 20 分钟。将组织转移至含 EDTA 的脱钙液（见材料表）中，每周更换一次溶液，持续脱钙 30 天，直至达到终点。
注意：当骨组织变软，或针刺时无阻力感时，可通过针刺、手指捏压或夹钳法判断脱钙终点。此类物理检测方法可能对组织结构造成一定损伤，应尽量避免用力过大或重复检测。 - 将组织从固定液中取出，在通风橱中使用解剖刀进行修整。将修整后的组织及相应标签放入脱水盒中。
- 将脱水盒放入篮子中，置于组织处理机（见材料表）中进行梯度酒精脱水（75% 乙醇 4 小时，85% 乙醇 2 小时，90% 乙醇 2 小时，95% 乙醇 1 小时，无水乙醇 30 分钟，无水乙醇 II 30 分钟，二甲苯 I 5–10 分钟，二甲苯 II 5–10 分钟，石蜡 I 1 小时，石蜡 II 1 小时，石蜡 III 1 小时）。
- 使用包埋机（见材料表）对浸蜡组织进行包埋。将熔化的石蜡倒入包埋盒中，在石蜡凝固前将脱水盒中的组织放入其中。
- 根据包埋面方向摆放组织，并贴上相应标签。在 -20 °C 冷冻台（见材料表）上冷却。待石蜡块凝固后，从包埋盒中取出，并根据需要修整石蜡块（见材料表）。
- 在切片机（见材料表）上将修整后的石蜡块切成 3 µm 厚的切片。将切片置于组织展片机（见材料表）上 40 °C 的温水中展平组织，然后用载玻片捞起。
- 在 60 °C 烘箱（见材料表）中烘烤，直至水分蒸发、石蜡熔化。取出后于室温（RT）保存，以备后续使用。
5. HE 染色
- 将切片放入二甲苯Ⅰ中 20 分钟，再放入二甲苯Ⅱ中 20 分钟。随后将切片依次放入无水乙醇Ⅰ和无水乙醇Ⅱ中各 5 分钟，75% 乙醇中 5 分钟，最后用自来水冲洗切片（参见材料表）。
- 用苏木精染液（参见材料表）孵育 3–5 分钟。用盐酸溶液（参见材料表）进行分化处理。用氨水溶液（参见材料表）处理切片以促蓝，然后用水冲洗切片。
- 将切片依次放入 85%、95% 梯度乙醇中脱水，再用伊红溶液（参见材料表）染色 5 分钟。
- 将切片依次放入无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ和无水乙醇Ⅲ中各 5 分钟。再将切片依次用二甲苯Ⅰ处理 5 分钟、二甲苯Ⅱ处理 5 分钟，最后用中性树胶封片（参见材料表）。
- 在显微镜下观察每张切片，然后选择具有代表性的切片进行全景扫描（参见材料表）。
注意：每个样本至少需要三张连续切片。在进行全景扫描前，必须在显微镜下检查切片，确保其完整且清晰。应确保骨髓腔、皮质骨和松质骨均完整显示，并能观察到不同类型的骨细胞。
6. HE 图像分析
- 使用 CaseViewer 软件打开 HE 图像（参见 材料表). 在切片上选择感兴趣区域（ROI），并将其保存为彩色图像。
注意：ROI 的选择与上述软件保持一致。 - 在 ImageJ 中打开图像（参见 材料表）。选择 魔棒 从工具栏中选择工具。点击小梁骨。
- 根据需要调整容差和相邻设置。前往 图像 > 调整 > 黑色 & 怀特 并点击 好的对骨骼的其他区域重复上述步骤。
- 反向选择并用白色填充。将图像保存为用于分析的掩膜（参见 图2).
注意：有关详细方法，请参阅先前已发表的研究工作14. - 在分析软件中打开掩膜15,16 （参见 材料表）。运行 过程 > 二元 > 制作二进制文件 将彩色图像转换为二值图像。
- 使用插件17 （参见 材料表）在软件中分析结构参数：运行 面积/体积分数 计算骨体积占总体积的百分比（BV/TV [%]）18,19.
注意：该方法适用于骨小梁和骨髓，可填充HE图像中整个感兴趣区域（ROI）。
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结果
微型计算机断层扫描分析
我们测量了两组小鼠的骨小梁微结构参数，并报告了其平均值和标准差 表1各组内部分参数（即骨体积与总体积之比、小梁厚度、小梁分离度）的分布情况如图所示 图3.
这些结果表明，根据Micro-CT分析的多个参数，OVX组与Sham组小鼠之间存在显著差异。具体而言，OVX组的骨体积与组织总体积之比（BV/TV）比Sham组低3%。OVX组小鼠的骨小梁厚度低于Sham组，相对差异百分比为39.3%。OVX组小鼠的骨小梁分离度高于Sham组。图4展示了从各组重建的骨体积中提取的骨小梁感兴趣区域（Trabecular ROIs）的三维图像。与Sham组（图4A）相比，卵巢切除术后小鼠的骨密度降低，骨小梁稀疏，呈现骨质疏松特...
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讨论
骨质疏松症可导致频繁发生骨折，这些骨折治疗成本高，可能引起疼痛、残疾甚至死亡，严重影响患者的生活质量20。多年来，卵巢切除模型已被公认为研究骨质疏松症的标准方法之一21。目前最常见的骨质疏松症临床前动物模型是卵巢切除（OVX）大鼠。尽管如此，大多数关于包括骨质疏松症在内的骨骼疾病机制的研究仍使用小鼠进行22。为了在成年雌性C57/BL6J小鼠中建立骨质疏松模型，通常在12周龄时实施卵巢切除术，这是进行该手术的最佳时间。小鼠在8至12周龄时已发育成熟并具备生育能力，此时进行卵巢切除对其骨量具有显著影响10。先前研究表明，在12周龄之前，小鼠骨骼生长迅速，骨形态学指标、骨密度（BMD）及骨生物力学指标快速上升，总BMD和皮质骨BMD与小鼠年龄显著相关。然而，12周龄之后，小鼠的骨代谢进入稳定期，上述各项指标趋于稳定23,24。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由四川省中医药管理局（2021YJ0175）和成都中医药大学临床医学院研究生科研创新项目（LCYJSKT2023-11）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 多聚甲醛 | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| 氨水溶液 | 成都科隆化工有限公司 | 2021070101 | |
| 解剖镊 | 金钟手术器械有限公司 | J3C030 | |
| 无水乙醇 | 成都科隆化工有限公司 | 2022070501 | |
| 自动染色机 | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| 骨微结构分析插件 | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J 小鼠 | SPF（北京）生物科技有限公司 | ||
| 载玻片 | 南通美维德实验设备有限公司 | 220518001 | |
| 盖玻片 | 南通美维德实验设备有限公司 | 220518001 | |
| 脱钙液 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | CR2203047 | |
| 精细剪刀 | 金钟手术器械有限公司 | ZJA010 | |
| 包埋盒标记机 | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| 包埋机 | 武汉俊杰电子有限公司 | JB-P5 | |
| Fiji：ImageJ | 美国国立卫生研究院（NIH） | ||
| 封片机 | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| 冷冻台 | 武汉俊杰电子有限公司 | JB-L5 | |
| H&E 染色试剂盒 | Leagene | DH0020 | |
| 盐酸溶液 | 四川西陇科学有限公司 | 210608 | |
| ImageJ2 插件 | BoneJ 7.0.16 | ||
| 医用纱布 | 山东昂阳医疗科技有限公司 | ||
| Mersilk 3-0 聚酯编织不可吸收缝线 | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| 持针器 | 金钟手术器械有限公司 | J32010 | |
| 中性树胶 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10004160 | |
| 烘箱 | 上海一恒科学仪器有限公司 | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC 数字切片扫描仪 | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS 缓冲液 | Biosharp | G4202 | |
| 5% 聚维酮碘溶液 | 成都永安制药有限公司 | ||
| Quantum GX2 microCT 成像系统 | PerkinElmer, Inc. | ||
| 轮转式切片机 | Thermo scientific | HM325 | |
| 手术刀 | 泉州卓越医疗用品有限公司 | 20170022 | |
| Scan & Browse 软件 | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| 一次性无菌橡胶外科手套 | 广东汇通乳胶制品集团有限公司 | 22B141EO | |
| 0.9% 氯化钠溶液 | 四川科伦药业股份有限公司 | ||
| 一次性无菌皮下注射器 | 山东威高集团医用高分子制品 有限公司 | ||
| 无菌医用缝合针 | 上海浦东金环医疗用品有限公司 | PW8068 | |
| 组织处理仪 | Thermo scientific | STP420 ES | |
| 组织展片与烘片机 | 武汉俊杰电子有限公司 | JK-6 | |
| 三溴乙醇 | 南京艾贝生物科技有限公司 | M2920 | |
| 石蜡修块机 | 武汉俊杰电子有限公司 | JXL-818 | |
| 二甲苯 | 成都科隆化工有限公司 | 2022051901 |
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