该方案简化了逆转录病毒载体的制备及小鼠T细胞的转导过程，有助于高效生成小鼠CAR-T细胞。
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本文内容
摘要
摘要
利用嵌合抗原受体（CAR）-T细胞的工程化细胞疗法在血液系统恶性肿瘤患者中已展现出显著疗效，目前正被开发用于多种实体瘤的治疗。迄今为止，新型CAR-T细胞产品的初步评估主要在免疫缺陷小鼠的异种移植肿瘤模型中进行。选择该方法是为了在实验条件下促进人源CAR-T细胞的成功植入。然而，在同源小鼠模型中，肿瘤和CAR-T细胞均来源于同一种小鼠品系，可在具有完整功能的免疫系统和全面的肿瘤微环境（TME）背景下评估新的CAR技术。本文所述方案旨在通过提供逆转录病毒转导和体外 T细胞培养的标准化方法，简化小鼠CAR-T细胞的制备流程。本方案中描述的方法可应用于本研究以外的其他CAR结构，从而实现在免疫健全系统中对新型CAR技术进行常规评估。
引言
表达嵌合抗原受体（CAR）的过继性T细胞疗法通过利用适应性免疫系统的功能，特异性地靶向并清除抗原阳性癌细胞，从而彻底改变了癌症免疫治疗领域1。尽管靶向B细胞恶性肿瘤的CAR-T细胞疗法已在临床上得到验证，但在动物模型中开展的临床前研究对于开发靶向实体瘤的新一代CAR仍至关重要。然而，迄今为止，在实体瘤适应症中该疗法的临床疗效仍有限，且日益明确的是，单一的临床前模型无法准确预测这种活体药物的药效动力学和临床疗效2,3。因此，研究人员已开始扩展CAR-T细胞产品的临床前研究，同时在人源肿瘤的异种移植模型和小鼠肿瘤的同源移植模型中进行平行评估。
与将人类肿瘤和T细胞移植到免疫缺陷小鼠体内的异种移植模型不同，同源模型能够在具有完整功能的免疫系统背景下研究CAR-T细胞的应答。具体而言，携带同源肿瘤的免疫健全小鼠为研究过继转移的T细胞与特定微环境之间的相互作用提供了体系——包括肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和调节性T细胞（Tregs），这些细胞已知可在肿瘤微环境（TME）中抑制T细胞功能4,5,6....
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方案
所有动物实验均经机构动物护理和使用委员会（哥伦比亚大学，方案编号 AC-AABQ5551 和 AC-AAAZ4470）批准，使用6至8周龄、体重在20至25克之间的雌性BALB/c或C57BL/6小鼠。实验动物购自商业来源（见材料表）。本实验方案以小鼠T细胞激活后的“激活后天数”为时间基准，病毒生产始于第-2天。逆转录病毒在初次制备后可保存于-80 °C，若后续使用本方案，可从第0天的T细胞分离与激活步骤（即步骤2）开始操作。
1. 逆转录病毒载体的制备
注意：通过将包装基因分到两个独立的质粒中（见材料表），病毒产物已被改造为复制缺陷型，从而极大降低了发生重组事件及意外产生具有复制能力病毒的可能性。
- 转染前一天准备 Phoenix Eco 细胞（第 -2 天操作）。
- 使用 30 mL 培养基（Phoenix Eco 培养基，详见 表 1），将约 1 × 107 个细胞接种至一个 15 cm 的组织培养处理培养皿或 T150 培养瓶中。
- 在 37 °C 下过夜孵育。18–24 小时后，细胞应达到约 70% 汇合度，并均匀分布，以确保获得高病毒产量且避免过度生长。
注：为获得最佳结果，....
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结果
本方案旨在标准化小鼠T细胞转导以生成小鼠CAR-T细胞的流程。 图1 详细描述了所涉及步骤。该过程始于逆转录病毒载体的制备 通过 将病毒组分共转染至Phoenix Eco细胞中。 图2 提供了转染当天Phoenix Eco细胞最佳密度的图像。随后，在转染后24小时（即本方案的“第0天”）激活分离的T细胞，为第1天的转导做准备。转导后，CAR-T细胞在重组人IL-7和IL-15存在条件下培养，以实现足够的扩增倍数，同时维持干细胞记忆样细胞群。
推荐使用小鼠T细胞分离试剂盒（参见 材料表) 采用本方案可获得T细胞纯度达 <转导前经流式细胞术测定，纯度达98%图 3A此外，使用本方案及经改造后由PGK启动子驱动CAR结构表达的pMSCV逆转录病毒载体，可实现65%–75%的可重复CAR表达率。图3B
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讨论
本方案描述了逆转录病毒转导小鼠T细胞以生成用于体内研究的CAR-T细胞所需的步骤和试剂。in vivo 研究中，优化逆转录病毒转导条件可实现稳定的CAR表达，无需通过超速离心或添加其他试剂对病毒进行浓缩。然而，该方法还可进行多种改进。
尽管本方案描述了生成靶向GFP的CAR的示例，但这些方法可进行调整，以生成靶向任何感兴趣细胞外抗原的小鼠CAR-T细胞。本研究中使用的pMSCV_PGK逆转录病毒载体可通过NotI和BamHI酶切高效释放GFP特异性纳米抗体序列，也可替换为用户自定义的抗原识别结构域，例如scFv、纳米抗体或配体结合结构域（补充文件1）。为了便于评估不同CAR的表达情况，建议设计带有N端表位标签的CAR，如Myc（EQKLISEEDL）或Flag（DYKDDDDK）标签，这些标签可利用荧光标记的抗体进行检测12。此外，本研究展示了单个转基因的生产；然而，通过引入自剪切肽（2A序列）或内部核糖体进入位点（IRES），可实现多个转基因的共表达，包括用于增强T细胞在体内的功能.......
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致谢
感谢 L. Brockmann 对手稿的审阅。本工作由 NIH 1R01EB030352 和 UL1 TR001873 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.45 μm 滤膜 | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL 注射器 | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| 10 mL 注射器 | BD | 14-823-16E | |
| 100 μm 细胞筛 | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm 组织培养处理细胞培养皿 | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
| 15 mL 锥形管 | Falcon | 14-959-70C | |
| 40 μm 细胞筛 | Corning | 07-201-430 | |
| 50 mL 锥形管 | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 μm 细胞筛 | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT 流式细胞仪 | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C，6-8 周龄 | Jackson Laboratory | 651 | |
| β-巯基乙醇 | Gibco | 21985023 | |
| 牛血清白蛋白 | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM 培养基 | Gibco | 11965092 | |
| 不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液 (PBS) | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 磁力架 | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep 磁力架 | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep 小鼠 T 细胞分离试剂盒 | Stemcell Technologies | 19851 | |
| FACS 缓冲液 | BD | BDB554657 | |
| 胎牛血清 (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| HEPES 缓冲液 | Gibco | 15-630-080 | |
| 人重组 IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| 人重组 IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| 人重组 IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM 非必需氨基酸溶液 | Gibco | 11140-050 | |
| 小鼠抗 CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| 小鼠抗 CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| 小鼠抗 CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| 小鼠抗 CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| 小鼠抗 CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| 小鼠抗 CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| 配备 Prime 95B 相机的 Nikon Ti2 显微镜 | Nikon | ||
| 未经处理的 24 孔板 | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| 青霉素/链霉素溶液 | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco 细胞 | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | 由 R.LV. 制备 | |
| 纯化的 sfGFP | N/A | 由 R.LV. 制备 | |
| RetroNectin（“转导试剂”） | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| 10 mL 血清移液管 | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 25 mL 血清移液管 | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| 5 mL 血清移液管 | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 丙酮酸钠 | Gibco | 11-360-070 | |
| 组织培养处理的 24 孔板 | Corning | 08-772-1 | |
| 台盼蓝 | Gibco | 15-250-061 |
参考文献
- June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
- Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
- Hou, A. J., Chen,....
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