方法文章

基于蒙药的 rats 慢性不可预测性轻度应激

DOI：

10.3791/65889

⸱

2023年10月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Humanities Education, Inner Mongolia Medical University, 2Faculty of Mongolian Medicine, Inner Mongolia Medical University, 3Faculty of Basic Medical, Inner Mongolia Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案基于蒙医学理论，阐述了一种用于抑郁症的慢性不可预测性轻度应激（CUMS）模型，并提供了行为学测试的验证方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

抑郁症是一种常见的情感障碍，是全球致残的主要原因之一。目前药物治疗手段的局限性加剧了该疾病带来的重大健康负担。迫切需要更深入地理解抑郁症的潜在机制，因此具有转化潜力的临床前模型显得尤为宝贵。蒙医药作为传统医学的一个分支，认为疾病的发生与风、胆、痰三者的平衡密切相关。本研究介绍了一种在大鼠中建立慢性不可预测性轻度应激（CUMS）模型的实验方案。在此框架下，通过施加一系列变化的轻度应激刺激，诱导大鼠产生类似人类抑郁症的表型，模拟人类抑郁症的发病过程。本方案中采用的行为学检测包括蔗糖偏好实验（SPT），用于评估快感缺失——抑郁症的核心症状之一；开放旷场实验（OFT），用于测量焦虑水平；以及Morris水迷宫实验（MWM），用于评估空间学习与记忆能力。CUMS方法能够有效诱导快感缺失，并导致长期的行为功能缺陷。此外，该方案相较于其他用于诱发抑郁样行为的动物模型，更符合蒙医理论体系。该动物模型的建立及相关研究为未来蒙医药领域的创新性研究提供了坚实的基础。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

重度抑郁症（MDD）是一种常见的精神疾病，全球范围内致残原因中排名第三，影响超过3亿人1，2，3。值得注意的是，据估计至少一半的患者未能获得充分治疗4。鉴于这一治疗缺口，动物模型成为研究抑郁症病因的关键工具。迄今为止，已有超过20种不同的抑郁症动物模型5。其中，由Paul Winer于1987年优化的慢性不可预见性轻度应激（CUMS）模型应用最为广泛6。CUMS模型基于以下假设：使啮齿类动物暴露于多种社会环境应激源中，会引发类似焦虑、紧张和抑郁的症状。该方法通过在数周内使动物经历各种轻度应激刺激，最终导致一系列行为改变，包括快感缺失和类抑郁行为7，8。这些变化伴随内分泌和神经递质谱的改变，例如5-HT水平降低9，10。这些结果与临床上MDD患者的观察结果高度相似，从而验证了该模型的有效性。CUMS模型尤其因其在抗抑郁药物评价中的有效性而受到重视，表现出高水平的表面效度、结构效度和预测效度11，12。与其他模型不同，CUMS对单胺类抗抑郁药的长期给药效应具有敏感性。例如，选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）如西酞普兰、帕罗西汀和氟西汀已被证明可在慢性应激条件下预防并逆转快感缺失12，13。此外，新型快速起效的抗抑郁药如氯胺酮在此模型中也显示出疗效14，15。相比之下，强迫游泳实验（FST）和悬尾实验（TST）等其他测试在模拟长期行为变化方面可靠性较低，通常反映的是对急性应激的适应，而非持续的抑郁症状16。这些特征凸显了CUMS模型在抑郁症研究中的强大效度。CUMS模型最显著的特征之一是在经典研究中公认的高可靠性指标——快感缺失，即无法从日常活动中体验愉悦或兴趣17，18。这一现象通常通过蔗糖偏好实验进行评估，许多抗抑郁药物已被证明可逆转蔗糖摄入减少的现象。在CUMS相关文献中还常用其他多种指标，包括旷场实验（OFT），用于评估自主运动行为、探索倾向和紧张程度，从而衡量抑郁严重程度19。其他测试如高架十字迷宫（EPM）用于评估类焦虑行为，莫里斯水迷宫实验（MWM）用于检测认知功能20，而FST则用于评估对负面情绪的易感性和行为绝望20。此外，影响人类的大多数应激源本质上是社会性的。社会关系不佳的个体，表现为社会活动、社交网络和支持有限，患多种疾病的风险更高21，22。这一点在啮齿类动物中同样适用，因其为群居动物。例如，单独饲养的大鼠会表现出所谓“隔离综合征”的特征，引发社会性应激并加速抑郁症的发生23。

蒙医药学是中医学的重要分支，认为疾病的发生是内在因素与外在因素复杂相互作用的结果。这些外在因素被称为“四种辅助条件”，包括气候变化、饮食、生活方式以及感染、惊吓事件和心理障碍等突发情况。疾病过程被概念化为“三种体液”与“七种身体构成要素”在四种辅助条件共同作用下的持续相互作用24。蒙医药学认为，人体是一个整体，其功能依赖于三种体液之间的相对平衡。这种平衡的破坏被认为是疾病发生的先兆24。鉴于动物实验在连接传统医学与现代医学中的关键作用，建立适用于蒙医药学研究的动物模型至关重要。因此，我们采用为期28天的隔离方法并结合慢性不可预知性应激（CUMS）来模拟这些生理和心理应激因素。我们选择了九种特定的不可预知性应激源，并试图通过蒙医药学的三种体液理论为该建模方法提供理论支持。建立可靠的动物模型对于推进蒙医药学的基础研究具有重要意义，并将为其基础研究提供重要支撑。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

实验方案已获得内蒙古医科大学动物实验伦理与护理委员会的批准（批准号：YKD202301172），并遵循美国国立卫生研究院关于动物护理与伦理的指南。本动物实验中心的许可证编号为NO.110324230102364187。实验所用24只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，均为8周龄（体重200 g ± 20 g），购入后饲养于温度为22°C ± 2°C、相对湿度为55% ± 15%的受控环境中。大鼠饲以标准啮齿类动物维持饲料，饮用纯净水，垫料使用玉米芯。实验前，大鼠在12小时光照/12小时黑暗循环条件下适应环境1周。

1. CUMS 大鼠模型的建立

  1. 分组
    1. 将24只大鼠随机分为2组：对照组（CON），不进行隔离或应激处理；模型组（MOD）。每组各含12只大鼠。
    2. 将大鼠饲养于规格为55 cm × 40 cm × 20 cm的标准笼具中，每笼6只。在整个适应期中保持笼位分配不变，除非另有说明。
    3. 每个饲养笼内铺新鲜垫料，并每周更换两次。
    4. 进行为期1周的适应性饲养。除慢性不可预知性轻度应激（CUMS）处理期间外，允许大鼠自由摄食和饮水。环境条件保持恒定：温度22°C ± 2°C，湿度55% ± 15%，光照/黑暗周期为12 h/12 h（08:00至20:00），除非另有说明。
    5. 实验开始前，每日对大鼠进行抓取操作，使其适应研究人员接触，以减少实验阶段的额外应激。
  2. 隔离联合慢性不可预知性轻度应激
    1. 将MOD组与CON组同时安置于不同房间。MOD组大鼠单笼饲养，CON组大鼠合笼饲养。其余所有条件保持一致。
    2. 实施为期28天的应激方案25。为防止适应性产生并确保应激的不可预测性，每天随机施加一种应激刺激，避免连续两天使用相同的应激方式。
    3. 在不同日期随机施加以下九种应激刺激之一26,27：24小时禁水、24小时禁食、潮湿垫料、笼体倾斜、光照/黑暗周期颠倒、4 °C低温暴露、45 °C高温暴露、1分钟尾夹、或160 rpm振荡15分钟。具体设计见表1。
    4. 在施加应激刺激期间，除光照/黑暗周期颠倒外，MOD组大鼠禁止摄食和饮水，直至应激结束；CON组无需限制饮食与饮水。
  3. 应激方法
    1. 实验开始时，对除对照组外的所有大鼠施加抑郁样刺激，并结合28天的隔离饲养。这些大鼠需单笼饲养。与抑郁样刺激相关的具体条件参见表2。
    2. 尾夹法操作：取MOD组大鼠，用标准回形针在其尾根部1–2 cm处夹住尾巴，持续夹持1分钟（n = 12），记录夹持时间。
    3. 禁水法：移除MOD组大鼠笼内的饮水瓶，停止供水并持续记录24小时。
      注：需记录禁水开始时间，以便准确计算结束时间；观察该期间大鼠的行为表现，包括活动情况、食欲及精神状态等。
    4. 禁食法：移除MOD组大鼠的食物，停止喂食并持续记录24小时。
      注：记录禁食开始时间，以便准确计算结束时间；确保大鼠在此期间充分饮水以维持水合状态；观察该期间大鼠的行为表现，包括活动情况、精神状态等。
    5. 4 °C低温刺激：将MOD组大鼠放入盛有冷水的桶中，记录5分钟。确保测试过程中水温保持恒定。实验结束后，用吹风机将大鼠吹干，并放回原笼。
      注：使用温度计监测水温，当水温上升时加入冰水或冰块以维持4 °C；定期更换水以保证水质清洁和温度恒定。游泳时，除头部外，大鼠的四肢和躯干应完全浸入冷水中。水深必须超过大鼠体长，防止其因接触桶底而跳出水面。
    6. 45 °C高温应激：将MOD组大鼠放入恒温培养箱中，记录5分钟，确保测试期间温度稳定。
    7. 光照/黑暗周期颠倒：用黑色布料包裹笼具1小时，模拟白天黑暗环境；随后在夜间持续光照12小时，模拟白昼。连续记录大鼠行为、摄食与饮水量以及睡眠模式24小时。
    8. 潮湿垫料实验：向装有100 g垫料的笼具中加入200 mL水。将MOD组大鼠置于潮湿笼内，记录其在湿垫料应激下的行为表现，包括活动情况、食欲、饮水量等。观察是否存在异常行为或不适反应，例如皮肤和毛发状况是否因潮湿垫料受到影响，并及时记录以供后续分析，持续24小时。测试结束后，用吹风机将大鼠吹干，并转移至铺有新鲜木屑的新笼中。
    9. 笼体倾斜法：将MOD组大鼠置于靠墙倾斜45°的笼具中，记录24小时。利用笼架结构调节角度，并固定笼具位置。
      注：准确记录起止时间，观察笼体倾斜期间大鼠的行为表现，包括活动情况、食欲和精神状态；确保倾斜角度设置正确且保持稳定，以保障实验的准确性和可重复性。
    10. 高速振荡：将MOD组大鼠置于设定为160 rpm的机械振荡器中，记录15分钟。随后采用行为学检测方法评估模型建立是否成功。
    11. 施加应激刺激后，将MOD组笼具从CUMS处理室移回常规饲养室。在为期4周的应激暴露期间，CON组始终保留在饲养室内的原笼中。
  4. 实验注意事项
    1. 在CUMS处理室完成应激刺激后，将MOD组笼具转移回常规饲养室。
    2. CUMS建模期间的动物监测
      1. 尾夹过程中，大鼠可能因刺激而挣扎。在此期间需持续监控夹具状态，若夹具脱落，应暂停计时，重新夹紧后再继续计时满1分钟。
      2. 禁止同时施加禁水和潮湿垫料两种应激刺激。
        注：避免同时实施潮湿垫料与禁水处理，有助于维持实验完整性，减少混杂变量，并促进动物福利。
      3. 大鼠体温及环境室温可能导致冷水游泳过程中水温升高，因此需通过添加冰水或冰块调节，以维持水温恒定。
      4. 除昼夜节律颠倒外，在施加应激刺激期间应每30分钟观察一次大鼠状态，重点关注异常应激迹象，如颤抖、嗜睡或不动等。若观察到此类症状，尤其是4 °C冷水游泳或潮湿垫料处理中可能出现的低体温风险，应立即终止应激并移出大鼠。
        注：当实验动物出现健康问题，如感染、严重创伤、攻击性行为、运动异常等情况时，应将其从实验中剔除。剔除标准通常围绕保护动物健康与安全，同时确保实验结果的可靠性。
      5. 每日检查每只大鼠是否存在伤口或其他生理或行为异常。若发现异常，应咨询实验室兽医，判断是否需将其排除出实验。
      6. 每3天称量每只大鼠体重一次。若某只大鼠体重较喂养前基础体重下降超过20%，则必须将其剔除出实验。

2. 行为学实验

  1. 首先，除对照组外，对所有大鼠施加抑郁刺激并结合隔离饲养，持续28天。将大鼠单独饲养在各自的笼具中。参考 表2 有关抑郁刺激条件的具体信息。
  2. 在旷场实验中，将一个黑色箱子均分为25个面积相等的方形区域，在箱内安装视频追踪分析系统。将大鼠置于中央方格，记录其5分钟内的水平和垂直活动情况。
    注意：箱子的尺寸为 500 mm × 500 mm × 300 mm。将使用视频追踪系统收集活动数据，以评估啮齿类动物在暴露于新环境时与焦虑相关的行为。
  3. 随后，统计大鼠使用全部四只爪子穿过的方格数量，以量化其水平活动。记录直立和理毛行为的次数，作为垂直活动的指标。每次测试结束后，使用75%酒精清洁箱体，以去除残留的大鼠气味，供后续测试使用。
  4. 接下来，通过蔗糖偏好实验评估快感缺失。在笼盖上放置两个瓶子：A瓶装纯水，B瓶装1%蔗糖溶液。让动物自由摄取。 随意摄取 确保大鼠能够同时接触两种溶液。在第0、7、14、21和28天，分别记录大鼠饮用前后的瓶重，以计算60分钟内的蔗糖偏好率。计算公式如下：
    蔗糖消耗量 = Sucrose preference formula, ratio of sucrose to total intake, mathematical expression, research data analysis. × 100%
  5. 为评估空间记忆与学习能力，采用莫里斯水迷宫实验。将水池均分为四个象限，依次编号为一至四象限。在第三象限水下放置一个位于水面以下1 cm处的隐蔽平台。
  6. 向水池中加入牛奶以增加水的不透明度，并在整个实验过程中维持水温约为 23 °C。
  7. 将每只大鼠分别放置于迷宫的不同象限，使其有120秒的时间寻找隐藏平台。大鼠必须依赖空间记忆和学习能力来记住平台的位置。一旦学会平台的位置，它们便能直接游向平台。使用Morris水迷宫视频追踪系统记录潜伏期时间。
  8. 将大鼠置于水池中的固定位置。若受试动物在120秒内未能找到隐藏平台，则记录潜伏期为120秒。
  9. 最后，移除隐藏平台，将大鼠重新放入水中，记录120秒内穿越区域的次数。

3. 统计分析

  1. 为评估生化参数的显著性差异，采用单因素方差分析（ANOVA）并随后进行邓肯（Duncan）事后检验。数据以均值 ± 标准误（SE）表示，并将 p以 p 值小于 0.05 为具有统计学显著性。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在CUMS诱导的大鼠抑郁模型中行为学测试的结果
为验证CUMS造模方法在诱导抑郁样行为方面的有效性，进行了操作验证。雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠根据步骤1.2.3所述，被随机分配至MOD组或CON组，持续4周。随后处死大鼠，完整分离其海马组织，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）28检测5-羟色胺（5-HT）水平，该神经递质与抑郁症的病理生理机制密切相关10。

在CUMS诱导前，各测试组在开放场实验（OFT）评分、蔗糖偏好或莫里斯水迷宫（MWM）分析中均未观察到显著差异。

建立CUMS模型后，单因素方差分析（ANOVA）结果显示CUMS对大鼠焦虑行为具有显著影响。具体而言，在开放旷场实验（OFT）中，各组之间表现出显著差异。MOD组的垂直和水平得分均低于CON组（**P < 0.01；图1A、B...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

抑郁症是一种以情绪低落、快感缺乏和精力减退等症状为特征的精神障碍30。在抑郁症研究领域，建立可靠的动物模型对于推动治疗干预的发展至关重要。在众多动物模型中，CUMS模型因其高度的可靠性、有效性以及与人类抑郁症特征的高度一致性而尤为突出31。该模型非常适合模拟在多种环境下长期累积的低强度应激源所产生的综合效应。在本研究中，我们通过步骤1.2.3及表2中列出的多种应激源，建立了CUMS诱导的大鼠抑郁模型。该应激方案的多个方面对模型的成功至关重要。首先，所有MOD组的大鼠必须单独饲养，而CON组大鼠则无需如此。其次，CUMS应激方案应精心设计，以保持不可预测性。具体而言，每周应从九种可能的应激源中随机选择七种施加于大鼠。这些应激源的多样性和不可预测性是确保模型有效性的关键因素32,33。最后，应尽量减少同一应激源的重复使用，以防止大鼠产生适应性反应，从而影响实验结果的可靠性。此外，应激源的设置在整个...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢中国内蒙古医科大学蒙古医学院提供的仪器设备和实验室条件。本研究得到了国家自然科学基金委员会（资助号：81760762）、中国内蒙古医科大学项目（资助号：YKD2022MS074）、中国内蒙古自治区高等教育科研项目（资助号：NJZY22661）以及内蒙古自治区中蒙医药重点实验室开放基金项目（资助号：MYX2023-K07）的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 离心管服务生物技术有限公司EP-150-M
1000 µL 移液管服务生物技术有限公司IC021198160223
10 µL型移液器吸头服务生物技术有限公司IC012395160823
10 µL型移液器吸头服务生物技术有限公司TP-10
1250 µL型移液器吸头服务生物技术有限公司TP-1250
2 mL 离心管服务生物技术有限公司EP-200-M
200 µL型移液器吸头服务生物技术有限公司TP-200
200 µL型移液器吸头服务生物技术有限公司IC021029160323
300 µL 多通道移液器服务生物技术有限公司IC091006161022
50 µL 移液器服务生物技术有限公司DS35110
自动洗板机rayto Life Sciences Co., LtdRT-3100
台式高速冷冻离心机dalong construction Co., LtdD3024R
电子天平梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司ME203E/02
电热鼓风干燥箱实验室实验仪器设备有限公司GEL-70
酶标检测仪BioTeK有限公司时期
高速组织研磨器服务生物技术有限公司KZ-<图片替代文本"公式 2" src="/files/ftp_upload/65889/65889eq02.jpg" 样式="margin: auto;"/>- F
水平冷冻柜Mellow Group Co., LtdBCD-318AT
实验室超纯水机济南艾肯环保科技有限公司  AK-RO-C2
莫里斯水迷宫视频轨迹分析系统 Tai Meng Tech Co., LtdWMT-200
大鼠5-HT ELISA试剂盒中国联科生物技术有限公司96T/48T
SPF级Sprague Dawley（SD）大鼠SPF（北京）生物技术有限公司 SCXK(京)2019-0010
Sprague Dawley大鼠中国北京生物科技有限公司 SCXK (京) 2019-0010
立式冷藏展示柜Xingx Group Co., LtdLSC-316C
视频追踪系统泰萌科技有限公司ZH-ZFT
涡旋混合器Servicebio technology Co., LtdMV-100

参考文献

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