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方法文章

从成年小鼠脊髓中分离纯化的星形胶质细胞和小胶质细胞 体外 检测与转录组学研究

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DOI：

10.3791/65893

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2023年10月20日

 ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, The George Washington University School of Medicine

本文内容

摘要

本方案概述了从成年小鼠脊髓中分离纯化星形胶质细胞和小胶质细胞的方法，可用于后续的RNA分析和细胞培养等应用。方案包括详细的细胞解离方法及操作步骤，旨在提高分离细胞的质量和得率。

摘要

星形胶质细胞和小胶质细胞在中枢神经系统的发育、损伤反应以及神经退行性疾病中发挥关键作用。这些高度动态的细胞对环境变化具有快速响应能力，并在形态学、转录谱和功能方面表现出显著的异质性。尽管我们对胶质细胞在健康与疾病状态下的功能已有显著深入的理解，但仍需要在损伤或伤害背景下开展体外（in vitro）的细胞特异性分析，以全面表征不同的细胞群体。相较于细胞系或新生动物，从成年小鼠中分离细胞具有多项优势，因其可实现对特定病理条件下及特定时间点的细胞进行分析。此外，聚焦于脊髓特异性分离并排除脑组织的参与，有助于针对脊髓病理学的研究，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎、脊髓损伤和肌萎缩侧索硬化症等疾病。本方案提供了一种高效的方法，用于从成年小鼠脊髓中分离星形胶质细胞和小胶质细胞，便于立即或后续开展功能、分子或蛋白质组学等下游分析应用。

引言

星形胶质细胞和小胶质细胞是多功能的胶质细胞，在中枢神经系统（CNS）中发挥着至关重要的作用，包括调控神经元功能、参与CNS发育、维持血脑屏障以及参与其他关键过程1,2,3,4。除了在维持稳态中的作用外，这些胶质细胞还在损伤与修复机制中发挥关键作用。小胶质细胞在受到刺激或损伤后，以其吞噬、炎症反应和迁移能力而著称5,6,7。星形胶质细胞在疾病中的反应同样多样，包括参与炎症反应、形成胶质瘢痕以及破坏血脑屏障8,9。尽管我们对小胶质细胞和星形胶质细胞在中枢神经系统中损害性与修复性作用的理解不断加深，但它们在结构和功能上的固有异质性仍要求具备强有力的工具，以在不同背景下对这些细胞进行深入研究。

深入了解小胶质细胞和星形胶质细胞在健康与疾病中的作用需要采用综合方法 体内 和 体外 研究。 体内 技术利用了中枢神经系统内胶质细胞与神经元之间复杂的相互作用，同时 体外 在评估单个细胞在特定刺激下的功能或反应时，这些方法学具有重要价值。每种方法均具有独特的优势； 体外 研究对于理解这些细胞类型在不受邻近细胞直接或间接输入影响下的特定功能至关重要。此外， 体外 利用永生化细胞系的检测具有一些优势，包括能够无限增殖、成本效益高以及易于维护。然而，需要注意的是，与细胞系相比，原代细胞更能模拟正常的生理反应。这种生理相关性在功能检测和转录组学分析中至关重要。

从成年小鼠脊髓中获取原代细胞面临的主要挑战之一在于样本的数量和活性。成年脊髓体积小于脑组织，且含有大量髓鞘，这带来了独特的技术难题。尽管已有多种已发表的方案详细描述了如何从新生动物或成年小鼠脑组织中分离出纯净且具有活性的胶质细胞10,11,12,13，但这些方法可能并不适用于研究特异性发生于脊髓的疾病与损伤。在本方案中，我们提供了一套完整的操作流程，可高效地从成年小鼠脊髓中分离出纯净且具有活性的小胶质细胞和星形胶质细胞，从而支持后续的细胞培养及转录组学分析。该方案已成功应用于10周龄至5月龄的成年小鼠，证明其在多种研究背景下均具有实用性，包括条件性基因敲除小鼠模型、药物反应、发育研究以及与年龄相关的模型研究。

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方案

所有动物护理和实验程序均在乔治华盛顿大学医学院与健康科学学院动物护理与使用委员会（美国华盛顿特区；IACUC#2021-004）批准后进行。本研究使用了10周龄至5个月大的雄性和雌性C57BL/6J野生型（WT）小鼠，这些小鼠来自商业供应商（见材料表），并饲养于乔治华盛顿大学。实验方案流程概览见图1。

1. 脊髓的制备

  1. 使用Avertin（12.5 mg/mL的2,2,2-三溴乙醇和2.5%的2-甲基-2-丁醇溶于无菌水）对动物进行麻醉（参见材料表）。通过夹捏小鼠脚趾和尾部确认其无反应。
  2. 用冰冷的1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）进行心脏灌注，以清除外周血单个核细胞。
    1. 将动物置于浅盘上，做侧向切口以暴露胸膜腔。将连接至蠕动泵（参见材料表）的23 G灌注针插入左心室并启动泵。当冰冷的DPBS流经心脏时，在右心房处做一个小切口。
      ​注意：此步骤推荐较快的灌注速度，以提高细胞活力。应在1分钟内完成血液冲洗。肝脏变清表明灌注成功。
  3. 使用大剪刀将动物断头，并取出脊柱14。将其浸入盛有冰冷1× DPBS（含Ca2+/Mg2+/0.2%葡萄糖）的培养皿中，置于冰上进行组织清洗。
  4. 从此步骤开始，确保所有操作均在无菌环境中进行。 采用液压挤出法14分离完整的脊髓。使用18 G针头和装有冰冷1× DPBS（含Ca2+/Mg2+/0.2%葡萄糖）的10 mL注射器。将脊髓转移至放置在冰袋上的培养皿中，培养皿内应含有足量的冰冷1× DPBS（含Ca2+/Mg2+/0.2%葡萄糖），以完全浸没整个组织。
  5. 在超净台内的显微镜下小心去除 脑膜。将脊髓转移至另一个置于冰袋上的空培养皿中，使用10号手术刀片将整个脊髓切成2–3 mm长的节段。

2. 酶法细胞解离

  1. 根据商品化成人脑组织解离试剂盒的说明书，加入试剂盒中的酶混合液1和酶混合液2（参见材料表）。轻轻晃动培养皿数次，确保脊髓组织被均匀覆盖，然后在37 °C下孵育30分钟。每5分钟轻轻晃动一次培养皿，以防止组织结块并促进试剂均匀分布。
  2. 从培养箱中取出培养皿，加入350 µL含0.46 mg/mL DNA酶I的最低必需培养基（MEM）（参见材料表），通过轻轻晃动混合。
  3. 加入1 mL冷的DMEM/0.5%胎牛血清（FBS），轻轻晃动混匀。立即转移全部内容物至一个5 mL离心管中。

3. 机械法细胞解离

  1. 使用 P1000 移液器轻轻吹打组织三次，确保每次均将组织块吸至移液器中，以进一步解离组织。然后，使用带塞的 9" 玻璃巴斯德移液器再轻轻吹打五次，注意过程中避免产生气泡。
  2. 将 5 mL 离心管直立放置，静置 30 秒使组织沉降至管底。待组织沉淀后，用 P1000 移液器吸取上清液，并通过 30 µm 滤膜转移至 15 mL 锥形管中。
  3. 向含有残留组织的同一 5 mL 离心管中加入 1 mL 冷 DMEM/0.5% FBS。使用巴斯德移液器轻轻吹打三次。
  4. 静置 30 秒使组织沉降至管底，然后将上清液通过 30 µm 滤膜滤入之前所用的同一 15 mL 管中。重复步骤 3.3 和步骤 3.4 一次。
  5. 将过滤后的细胞悬液在室温（RT）下以 300 × g 离心 10 分钟。使用真空抽吸装置小心移除并弃去上清液。

4. 髓鞘去除

  1. 使用成人脑组织解离试剂盒（Adult Brain Dissociation Kit）中提供的去碎片溶液（debris removal solution, DRS），按照生产商的说明书去除髓鞘。去除碎片后，向细胞沉淀中加入 5 mL 冷的 DMEM/0.5% FBS，轻轻翻转离心管三次。将细胞悬液在 300 x g 室温（RT）下孵育10分钟。
    注意：如果细胞将用于 体外 研究期间若需继续培养，应使用预热的DMEM/0.5% FBS替代。
  2. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL DPBS/0.5% FBS 中（RNA 研究用预冷的溶液，进行 体外 检测）。使用台盼蓝对细胞进行计数并评估其活力。
    注意：可合并来自多个动物的细胞悬液以提高细胞浓度。
  3. 用DPBS/0.5% FBS洗涤细胞，定容至5 mL。将悬液在300 x g 室温孵育10分钟，用移液器弃去上清液。

5. 小胶质细胞和星形胶质细胞的分离

  1. 根据制造商的说明书，使用抗-CD11b或抗-ACSA-2磁珠对细胞进行标记（参见材料表）。
  2. 按照制造商的说明，使用MS柱通过正向选择法对细胞进行分选（参见材料表）。分选后，将分选得到的细胞在300 × g 条件下离心10分钟，并弃去上清液。

6. 细胞接种 体外 检测方法

注意：如果细胞不进行铺板，且将立即用于RNA分析，则继续进行第8步。

  1. 用1 mL温热的DMEM/0.5% FBS重悬细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数并评估其活力（见材料表）。
  2. 将细胞浓度调整至每50 µL含75,000个细胞。向24孔板中每个经多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上各加入50 µL细胞悬液11。
  3. 在37 °C孵育2小时，使细胞贴附于盖玻片上。
  4. 小心地向每孔中加入450 µL温热的DMEM/5% FBS/青霉素-链霉素（Pen-Strep，见材料表）。
  5. 3天后，更换一半培养基，每孔加入250 µL温热的DMEM/5% FBS/Pen-Strep。后续维持培养时，每隔4–5天完全更换一次培养基，每孔加入500 µL温热的DMEM/5% FBS/Pen-Strep。

7. 免疫组织化学

注意：最好在培养基至少更换一次后的3天或更长时间进行免疫组织化学分析。这可以确保清除碎片，并使细胞完全贴附于盖玻片上。

  1. 移除培养基，用抗小鼠单克隆抗体 O4 (1:100)（见材料表）在温热的 DMEM/5% FBS/10% 正常山羊血清（NGS）中室温（RT）或 37 °C 下标记细胞 15 分钟。
    注意：如果细胞不进行 O4 标记，则跳过此步骤，直接进入步骤 7.3。
  2. 将盖玻片轻轻浸入温热的 DMEM/5% FBS 中漂洗三次。加入羊抗小鼠 594 IgM (1:300)（见材料表），溶于温热的 DMEM/5% FBS/10% NGS 中，在室温避光孵育 15 分钟。再用温热的 DMEM/5% FBS 轻轻漂洗三次。
  3. 用冷的 5% 乙酸/甲醇在 4 °C 下固定细胞 15 分钟。用 1× PBS 洗涤三次，然后在含 1% Triton-X100/10% NGS 的 1× DPBS 中加入适当的抗体进行标记：抗兔 GFAP (1:500)、抗小鼠 GFAP (1:500) 或抗兔 Iba1 (1:500)（见材料表），室温孵育 1 小时。
    注意：如果盖玻片已用 O4 染色，请保持避光。
  4. 用 PBS 轻轻漂洗三次。加入相应的二抗：抗小鼠 594 IgG (1:500) 或抗兔 488 IgG (1:500)（见材料表），室温避光孵育 30 分钟。
  5. 用 PBS 轻轻漂洗三次。用 DAPI (1:1000) 室温复染 1 分钟。再用 PBS 漂洗三次，加入封片剂（见材料表），将盖玻片封固于载玻片上。

8. RNA 提取

注意：理想情况下，应至少有 100,000 个细胞，以提取足量的 RNA 用于分析。如有必要，可合并 2-3 根脊髓的细胞。

  1. 使用市售的RNA提取试剂盒，按照制造商提供的方案提取RNA（参见材料表）。每次使用试剂盒中提供的RW1洗涤缓冲液进行洗涤时，将细胞在洗涤缓冲液中额外孵育2分钟。
  2. 根据制造商说明书，使用DNase I去除残留的基因组DNA（参见材料表）。在室温下用DNase孵育15分钟，然后用RW1缓冲液洗涤。
  3. 为提高RNA得率，在洗脱前将样品在无RNase的水中室温孵育10分钟。使用生物分析仪15（参见材料表）评估RNA的完整性和浓度。

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结果

本方案中所述方法可从成年小鼠脊髓中分离出高纯度且具有活性的微胶质细胞和星形胶质细胞，适用于多种后续实验应用，包括 体外 功能或组织学检测以及RNA分析。

成功的分离 体外 研究将导致细胞在数天内持续增殖。与来自新生动物的细胞相比，成年动物来源的细胞增殖速度较慢，且在最初几天内可能出现一些细胞碎片。至第4天 体外 （体外培养天数，DIV），此时细胞应基本无碎片，大多数细胞已贴附于培养瓶底部。星形胶质细胞将开始形成较长的突起，而小胶质细胞则呈现椭圆形，带有较短的纺锤状突起。图2。到第7天体外培养时，星形胶质细胞应形成相互连接的融合层，而小胶质细胞应表现出更少且更短的突起（图3).

可通过使用GFAP和O4对ACSA2分选的细胞进行双重标记，以评估星形胶质细胞培养物中的少突胶质细胞污染；同时使用Iba1和GFAP对CD11b分选的细胞进行双重标记，以评估小胶质细...

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讨论

分离出纯净且具有活性的原代细胞对于研究特定细胞类型的结构和功能至关重要。在成年小鼠中，尤其是在脊髓组织中，这一任务面临重大挑战，因为现有的实验方案通常并未针对成年脊髓组织进行优化10,17。本实验方案提供了一种高效且经济的方法，适用于多种下游应用，包括细胞培养、流式细胞术、组织学分析以及转录组学研究。

脊髓组织制备的速度对于确保细胞活性和得率至关重要。尽管在心脏灌注过程中有效清除红细胞十分必要，但自心脏灌注完成至酶解离开始之间的时间间隔会显著影响所分离细胞的数量。我们观察到，若在心脏灌注后超过10分钟才开始组织解离，会导致细胞活性下降。此外，酶解离时间少于30分钟则效果不佳，会残留未完全消化的组织碎片，从而降低细胞得率。

尽管完全消除机械解离（如吹打或切碎）对细胞活力无显著影响，但由于存在未完全消化的组织碎片，所分离的细胞数量较少。将机械方法与酶解离相结合被证明是细胞分离最有效的方法。然而需要注意的是，组织解离...

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致谢

感谢乔治华盛顿大学基因组学核心实验室的Castle Raley进行RNA分析，以及Q2 Lab Solutions提供RNA测序分析。本研究由美国国家神经疾病与卒中研究所 [资助号 F31NS117085] 和Vivian Gill研究基金支持，受赠人为Robert H. Miller博士。图1使用BioRender.com制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,2,2-三溴乙醇Sigma AldrichT48402
24孔组织培养板Avantor10861-558
2-甲基-2-丁醇，98%Thermo FisherA18304-0F
4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐InvitrogenD13061:1000
45%葡萄糖溶液Corning25-037-CI
5 mL带盖试管Eppendorf30122305
乙酸Sigma-AdlrichA6283
成年脑组织解离试剂盒Miltenyi103-107-677
Anti-ACSA2微珠试剂盒Miltenyi130-097-679
Anti-Iba1Wako019-1974
BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BA
C57BL/6J野生型（WT）小鼠 Jackson Laboratories
CD11b（小胶质细胞）MicroBeadsMiltenyi130-093-634
Celltrics 30 µm滤膜Sysmex Partec04-004-2326
计数室（血细胞计数板）Hausser Scientific Co3200
牛胰脱氧核糖核酸酶ISigma AldrichD4527-40KU
蒸馏水TMO15230001
DMEM/F12Thermo Fisher11320074
用于RNA纯化的DNaseQiagen79254
杜氏磷酸盐缓冲液Thermo Fisher14040117
胎牛血清Thermo FisherA5209401
GFAP抗体（小鼠）Santa Cruzsc-336731:500
GFAP抗体（兔）DakoZ03341:500
山羊抗小鼠594 IgGInvitrogena110321:500
山羊抗小鼠594 IgMInvitrogena210441:300
山羊抗兔488 IgGInvitrogena110081:500
Iba1抗体（兔）Wako019-19741:500
MACS分离器Miltenyi130-042-303
Masterflex C/L泵系统Thermo Fisher77122-22
MEMCorning15-015-CV
甲醇Sigma-Adlrich439193
封片剂Vector LaboratoriesH-1000-10
MS柱Miltenyi130-042-401
O4抗体R&DMAB1326
青霉素-链霉素Gibco15070063
带塞9"玻璃巴斯德吸管VWR14672-412
RNeasy Plus Micro试剂盒Qiagen74034
Royal-tek外科手术刀片编号10Fisher scientific22-079-683
小型静脉输液套管，23 G x 19 mmKawasumiD3K2-23G

参考文献

  1. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
  2. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  3. Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
  4. Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712(2019).
  5. Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852(2022).
  6. Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246(2022).
  7. Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
  8. Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
  9. Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205(2020).
  10. Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742(2020).
  11. Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
  12. Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175(2022).
  13. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147(2012).
  14. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226(2017).
  15. Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
  16. Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599(2022).
  17. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834(2020).
  18. Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147(2023).
  19. CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).

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