从成年小鼠脊髓中分离纯化的星形胶质细胞和小胶质细胞 体外 检测与转录组学研究

摘要

本方案概述了从成年小鼠脊髓中分离纯化星形胶质细胞和小胶质细胞的方法，可用于后续的RNA分析和细胞培养等应用。方案包括详细的细胞解离方法及操作步骤，旨在提高分离细胞的质量和得率。

摘要

星形胶质细胞和小胶质细胞在中枢神经系统的发育、损伤反应以及神经退行性疾病中发挥关键作用。这些高度动态的细胞对环境变化具有快速响应能力，并在形态学、转录谱和功能方面表现出显著的异质性。尽管我们对胶质细胞在健康与疾病状态下的功能已有显著深入的理解，但仍需要在损伤或伤害背景下开展体外（in vitro）的细胞特异性分析，以全面表征不同的细胞群体。相较于细胞系或新生动物，从成年小鼠中分离细胞具有多项优势，因其可实现对特定病理条件下及特定时间点的细胞进行分析。此外，聚焦于脊髓特异性分离并排除脑组织的参与，有助于针对脊髓病理学的研究，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎、脊髓损伤和肌萎缩侧索硬化症等疾病。本方案提供了一种高效的方法，用于从成年小鼠脊髓中分离星形胶质细胞和小胶质细胞，便于立即或后续开展功能、分子或蛋白质组学等下游分析应用。

引言

星形胶质细胞和小胶质细胞是多功能的胶质细胞，在中枢神经系统（CNS）中发挥着至关重要的作用，包括调控神经元功能、参与CNS发育、维持血脑屏障以及参与其他关键过程^1,2,3,4。除了在维持稳态中的作用外，这些胶质细胞还在损伤与修复机制中发挥关键作用。小胶质细胞在受到刺激或损伤后，以其吞噬、炎症反应和迁移能力而著称^5,6,7。星形胶质细胞在疾病中的反应同样多样，包括参与炎症反应、形成胶质瘢痕以及破坏血脑屏障^8,9。尽管我们对小胶质细胞和星形胶质细胞在中枢神经系统中损害性与修复性作用的理解不断加深，但它们在结构和功能上的固有异质性仍要求具备强有力的工具，以在不同背景下对这些细胞进行深入研究。

深入了解小胶质细胞和星形胶质细胞在健康与疾病中的作用需要采用综合方法 体内 和 体外 研究。 ....

方案

所有动物护理和实验程序均在乔治华盛顿大学医学院与健康科学学院动物护理与使用委员会（美国华盛顿特区；IACUC#2021-004）批准后进行。本研究使用了10周龄至5个月大的雄性和雌性C57BL/6J野生型（WT）小鼠，这些小鼠来自商业供应商（见材料表），并饲养于乔治华盛顿大学。实验方案流程概览见图1。

1. 脊髓的制备

1. 使用Avertin（12.5 mg/mL的2,2,2-三溴乙醇和2.5%的2-甲基-2-丁醇溶于无菌水）对动物进行麻醉（参见材料表）。通过夹捏小鼠脚趾和尾部确认其无反应。
2. 用冰冷的1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）进行心脏灌注，以清除外周血单个核细胞。
   1. 将动物置于浅盘上，做侧向切口以暴露胸膜腔。将连接至蠕动泵（参见材料表）的23 G灌注针插入左心室并启动泵。当冰冷的DPBS流经心脏时，在右心房处做一个小切口。
      ​注意：此步骤推荐较快的灌注速度，以提高细胞活力。应在1分钟内完成血液冲洗。肝脏变清表明灌注成功。
3. 使用大剪刀将动物断头，并取出脊柱¹⁴。将其浸入盛有冰冷1× DPBS（含C....

结果

本方案中所述方法可从成年小鼠脊髓中分离出高纯度且具有活性的微胶质细胞和星形胶质细胞，适用于多种后续实验应用，包括 体外 功能或组织学检测以及RNA分析。

成功的分离 体外 研究将导致细胞在数天内持续增殖。与来自新生动物的细胞相比，成年动物来源的细胞增殖速度较慢，且在最初几天内可能出现一些细胞碎片。至第4天 体外 （体外培养天数，DIV），此时细胞应基本无碎片，大多数细胞已贴附于培养瓶底部。星形胶质细胞将开始形成较长的突起，而小胶质细胞则呈现椭圆形，带有较短的纺锤状突起。图2。到第7天体外培养时，星形胶质细胞应形成相互连接的融合层，而小胶质细胞应表现出更少且更短的突起（图3).

可通过使用GFAP和O4对ACSA2分选的细胞进行双重标记，以评估星形胶质细胞培养物中的少突胶质细胞污染；同时使用Iba1和GFAP对CD11b分选的细胞进行双重标记，以评估小胶质细.......

讨论

分离出纯净且具有活性的原代细胞对于研究特定细胞类型的结构和功能至关重要。在成年小鼠中，尤其是在脊髓组织中，这一任务面临重大挑战，因为现有的实验方案通常并未针对成年脊髓组织进行优化^10,17。本实验方案提供了一种高效且经济的方法，适用于多种下游应用，包括细胞培养、流式细胞术、组织学分析以及转录组学研究。

脊髓组织制备的速度对于确保细胞活性和得率至关重要。尽管在心脏灌注过程中有效清除红细胞十分必要，但自心脏灌注完成至酶解离开始之间的时间间隔会显著影响所分离细胞的数量。我们观察到，若在心脏灌注后超过10分钟才开始组织解离，会导致细胞活性下降。此外，酶解离时间少于30分钟则效果不佳，会残留未完全消化的组织碎片，从而降低细胞得率。

尽管完全消除机械解离（如吹打或切碎）对细胞活力无显著影响，但由于存在未完全消化的组织碎片，所分离的细胞数量较少。将机械方法与酶解离相结合被证明是细胞分离最有效的方法。然而需要注意的是，组织解离.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,2,2-三溴乙醇	Sigma Aldrich	T48402
24孔组织培养板	Avantor	10861-558
2-甲基-2-丁醇，98%	Thermo Fisher	A18304-0F
4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐	Invitrogen	D1306	1:1000
45%葡萄糖溶液	Corning	25-037-CI
5 mL带盖试管	Eppendorf	30122305
乙酸	Sigma-Adlrich	A6283
成年脑组织解离试剂盒	Miltenyi	103-107-677
Anti-ACSA2微珠试剂盒	Miltenyi	130-097-679
Anti-Iba1	Wako	019-1974
Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA
C57BL/6J野生型（WT）小鼠	Jackson Laboratories
CD11b（小胶质细胞）MicroBeads	Miltenyi	130-093-634
Celltrics 30 µm滤膜	Sysmex Partec	04-004-2326
计数室（血细胞计数板）	Hausser Scientific Co	3200
牛胰脱氧核糖核酸酶I	Sigma Aldrich	D4527-40KU
蒸馏水	TMO	15230001
DMEM/F12	Thermo Fisher	11320074
用于RNA纯化的DNase	Qiagen	79254
杜氏磷酸盐缓冲液	Thermo Fisher	14040117
胎牛血清	Thermo Fisher	A5209401
GFAP抗体（小鼠）	Santa Cruz	sc-33673	1:500
GFAP抗体（兔）	Dako	Z0334	1:500
山羊抗小鼠594 IgG	Invitrogen	a11032	1:500
山羊抗小鼠594 IgM	Invitrogen	a21044	1:300
山羊抗兔488 IgG	Invitrogen	a11008	1:500
Iba1抗体（兔）	Wako	019-1974	1:500
MACS分离器	Miltenyi	130-042-303
Masterflex C/L泵系统	Thermo Fisher	77122-22
MEM	Corning	15-015-CV
甲醇	Sigma-Adlrich	439193
封片剂	Vector Laboratories	H-1000-10
MS柱	Miltenyi	130-042-401
O4抗体	R&D	MAB1326
青霉素-链霉素	Gibco	15070063
带塞9"玻璃巴斯德吸管	VWR	14672-412
RNeasy Plus Micro试剂盒	Qiagen	74034
Royal-tek外科手术刀片编号10	Fisher scientific	22-079-683
小型静脉输液套管，23 G x 19 mm	Kawasumi	D3K2-23G