通过计算机模拟方法对表皮生长因子受体特异性单链可变区片段的结构分析

摘要

本抗体同源建模预测流程随后进行抗体-受体Pyrx分子对接及分子动力学模拟。这三种主要方法用于可视化准确的抗体-受体结合区域以及最终结构的结合稳定性。

摘要

单链可变区片段（scFv）抗体先前由通过 (Gly4-Ser)3 连接肽连接的轻链和重链可变区构成。该连接肽使用分子建模软件设计为环状结构。本文介绍了一种针对与表皮生长因子受体（EGFR）相互作用的完整 scFv 抗体进行in silico分析的实验方案。通过同源建模、使用 Pyrx 进行蛋白质-蛋白质分子对接，以及对相互作用的 scFv 抗体与 EGFR 进行分子动力学模拟来实现分析。首先，作者使用蛋白质结构建模程序和 Python 语言进行同源建模，构建了抗体 scFv 的结构模型。研究人员下载了 Pyrx 软件作为分子对接研究的平台。分子动力学模拟则通过建模软件运行。结果显示，当对分子动力学（MD）模拟结构进行能量最小化处理后，该蛋白模型的结合能最低，为 -5.4 kcal/mol。此外，本研究中的分子动力学模拟表明，对接后的 EGFR-scFv 抗体复合物在 20 至 75 纳秒期间保持稳定，此时结构的运动幅度急剧增加至 7.2 Å。综上所述，已成功完成in silico分析，分子对接与分子动力学模拟结果证实了所设计的 scFv 免疫治疗药物作为靶向 EGFR 的特异性治疗药物的有效性。

引言

蛋白质（配体和受体）的构象变化始终基于其结构依赖的功能而发生。研究蛋白质可能的结合沟槽并预测稳定的结合相互作用，是开发更适用于人体药物的先进方法。在同源建模基础上进行分子对接和分子动力学模拟，是一种直接且准确预测受体残基与构建的抗体之间稳定相互作用的方法，这些抗体被用作特异性的个体化药物^1,2。预测得到的模型结构能够揭示配体-受体结合位点的构象变化和重排情况，尤其是在抗体-受体界面区域。这些变化可能由多种因素引起，例如侧链旋转、整体结构转变或更复杂的修饰。同源建模的主要目的是区分蛋白质的三级结构与其一级结构^2,3。

一种称为表皮生长因子受体（EGFR）的酪氨酸激酶受体在癌细胞中发挥多种生物学作用，包括凋亡^4,5、分化^6,7、细胞周期进程^8,9、发育⁹....

方案

1. 单链可变区片段（scFv）蛋白的二级结构预测

1. 利用BLAST蛋白数据库（PDB）、KABAT编号系统及建模软件构建单链可变区片段（scFv）蛋白的三维结构。scFv由连接可变重链（VH）和可变轻链（VL）的连接肽（Gly4-Ser）组成。
2. 使用分子建模软件将连接肽构建为环状结构，并按照先前研究中所述方法进行所有操作^2,19,20。

2. 模板选择及scFv与EGFR的三维结构预测和同源建模

1. 选择 EGFR 结构的模板 1ivo（基于其高分辨率）。从 pdb 网站下载 1ivo.pdb 文件，如图 1B所示。
2. 按以下方式准备输入文件 1ivo.pdb。
   1. 在 1ivo.pdb 文件中，通过打开 pdb.org 网站并选择 1ivo 结构，在 pdb 网站的 1ivo 结构页面中查找“小分子”标题下的配体名称，以移除所有外部配体。
   2. 找到配体名称 NAG。打开从 pdb 网站下载的 1ivo.pdb 文件，并查找终止残基（....

结果

利用噬菌体展示技术，从小鼠B细胞杂交瘤细胞系C3A8中获得了抗EGFR的scFv基因^20,21。根据Chua等人的方法，分别构建了VH和VL结构的单链可变区片段（scFv）结构模型²²。随后，使用RasMol软件将这些模型以带状形式可视化。接着，利用分子建模软件，采用合成肽[Gly4Ser]3将分别建模的VH和VL结构连接起来。配体与受体的相互作用会引发局部结构变化，从而改变称为可变末端的结合位点。抗体蛋白结构中存在的互补决定区（CDR）可自然形成沟槽状结合结构，用于表位结合^3,23。抗原结合会导致CDR发生构象改变，使残基183适应理想形状，并促进残基具备合适的理化性质。相较于比较抗体结合态与非结合态分子的晶体结构，对结合过程进行动态分析被认为更有利于理解其潜在的别构三维机制²³。

讨论

EGFR 是乳腺癌的主要靶向受体。EGFR 的过表达导致全球乳腺癌病例增加。同时，单链可变区片段（scFv）等特异性抗体能够通过血液循环快速移动，并在体内具有较快的清除速率。抗体是一种明智的选择，也是一种有效的免疫治疗药物³⁷。因此，基于结构的药物设计必须筛选出能够特异性作用于靶受体（EGFR）的抑制性药物，例如 scFv 抗体。本研究基于in silico药物设计方法，旨在实验验证 scFv 抗体与 EGFR 蛋白-蛋白对接结构的稳定性，将其作为基于结构的药物设计策略的一部分。本研究采用分子动力学（MD）模拟方法，评估该对接结构作为乳腺癌抑制剂药物的稳定性和准确性。先前研究中提到的分子生物学实验分析²¹表明，scFv 抗体能够以高亲和力和高特异性与 EGFR 结合。

该方法被认为是一种验证受体与抗体对接结构之间结合相互作用稳定性的有效途径，已在多项研究中被提及^38,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Autodock 软件	计算结构生物学中心		AutoDock (scripps.edu)
Desmond Maestro 19.4 软件	Schrodinger		www.schrodinger.com
下载 Discovery Studio 2021	达索系统		https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download.
Modeler 版本 9.24[17]	加州大学		https://salilab.org/modeller/9.24/release.html
三维结构图示数据库（pdbsum）	欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息学研究所（EMBL-EBI）		www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/
PyMOL 软件	Schrodinger		PyMOL | pymol.org
Pyrx 软件	Sourceforge		下载 PyRx - 虚拟筛选工具 (sourceforge.net)
Windows (64位) 系统下的 Python 脚本 3.7.9 命令行环境	Python		Python 发行版 Python 3.7.9 | Python.org
SPDBV 软件	Expasy		http://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html