调幅电变形法评估生物细胞的力学疲劳

摘要

本文介绍了一种采用振幅调制电变形方法对人红细胞进行机械疲劳测试的实验方案。该通用方法可用于测量悬浮状态下生物细胞在周期性形变过程中形态学和生物力学特性的系统性变化。

摘要

红细胞（RBC）以其显著的变形能力而著称。在通过微循环时，它们会反复经历显著的形变。生理老化红细胞的变形能力会降低。现有的测量细胞变形能力的技术难以用于测量疲劳，即细胞膜在循环载荷作用下逐渐发生的退化。本文提出一种利用基于幅移键控（ASK）调制的电致变形技术，在微流控通道中评估红细胞在循环剪切应力下机械退化的实验方案。简言之，通过信号发生器向微流控通道内的叉指电极施加射频范围内的低电压交流电，使悬浮的红细胞响应电场并表现出正向介电泳（DEP）效应，从而被驱动至电极边缘。随后，由于作用于细胞两半部分的电力，细胞被拉伸，产生单轴拉伸，即电致变形。通过调节激励波形的幅值，可方便地调控剪切应力水平及相应的形变程度，从而实现对红细胞在小形变和大形变条件下非线性变形能力的高通量定量分析。采用ASK策略对激励波形进行调制，可实现具有可编程加载速率和频率的循环电致变形，为红细胞疲劳特性的表征提供了便捷手段。本研究建立的ASK调制电致变形方法首次实现了对红细胞在循环载荷下疲劳效应的直接测量。该方法可作为通用生物力学测试工具，用于分析其他细胞类型及疾病状态下细胞的变形能力与疲劳特性，并可与调控细胞微环境（如氧张力及生物化学信号）的策略相结合。

引言

红细胞（RBC）是人体中最可变形的细胞¹。其变形能力与其携氧功能直接相关。红细胞变形能力降低已被发现与多种红细胞疾病的发病机制相关²。变形能力的测量有助于我们更好地理解与红细胞相关的疾病³。正常红细胞的寿命可在70至140天之间变化⁴。因此，测量其变形能力如何随着衰老过程而下降非常重要，例如，由于循环剪切应力导致的疲劳行为³。

高通量测量红细胞（RBC）变形能力具有挑战性，因为施加在单个细胞上的力处于皮牛顿量级（~10^-12 N）。在过去十年中，已开发出多种技术用于测量细胞变形能力⁵。在单细胞水平上对红细胞进行变形测量可通过微管吸吮法和光镊技术实现，而群体分析则采用渗透梯度变形指数测定法（ektacytometry）。变形指数测定分析可提供大量数据，有助于诊断血液系统疾病^6,7。红细胞的变形能力也可通过胶体探针原子力显微镜结合粘弹性理论进行分析。该方法通过计算分析，综合考虑时间依赖性和稳态响应，估算红细胞的弹性模量。单个红细胞的变形能力还可利用单细胞微腔阵列法进行测量。该方法通过膜和胞质荧光标记物对每个细胞进行分析，为红细胞变形能力以及复杂红细胞群体中细胞特征分布提供信息，从而有助于检测血液系统疾病⁸。

疲劳是导致工程材料和生物材料性能退化的一个关键因素。疲劳测试能够对承受循环载荷的结构的完整性与耐久性进行定量分析。长期以来，由于缺乏一种通用、易于实施、高通量且定量的方法来实现细胞膜的周期性形变，生物细胞疲劳的研究一直受到限制。通过在微流控环境中应用电信号调制与电致形变技术，这一难题得以解决。本文采用幅度键控（ASK）这一数字调制方式，具体通过开关键控（OOK）调制实现。所谓“键控”，是指通过信道传输数字信号，其运行需依赖正弦波载波信号⁹。开与关的时间可设置为相等。在开键控期间，红细胞在暴露于非均匀电场产生的外部电致形变力（F_dep）时进入形变状态¹⁰；在关键控期间，红细胞则处于松弛状态。我们观察到红细胞的疲劳现象，即随着加载周期的增加，其延展能力逐渐下降。红细胞因疲劳导致的变形性丧失，可为血液循环过程中细胞膜累积损伤提供重要线索，有助于进一步探究细胞疲劳与疾病状态之间的关联。

本文提供了通过ASK调制电致变形技术在微流控装置中实施红细胞疲劳测试的逐步操作流程，以及系统设置，包括微流控装置、力学加载和显微成像，用于表征红细胞机械变形能力的逐步退化过程。

方案

去标识化的人全血通过商业途径获得。涉及血液样本的操作在生物安全二级实验室中进行，并遵循佛罗里达大西洋大学机构生物安全委员会批准的实验方案。

1. 微流控装置的制备

1. 将用于微流控通道设计的 SU-8 母版硅片用胶带固定在 14 cm 塑料培养皿内侧，并用 N₂ 气体清洁。
2. 在纸杯中称取 60 g 聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底和 6 g PDMS 固化剂，用木刮刀混合两组分，直至混合物呈乳白色。
3. 将 PDMS 混合物倒入含有硅片的塑料培养皿中。将培养皿放入带有三通旋塞的真空干燥器中，旋转旋塞阀门使真空与干燥器腔体连通，以去除 PDMS 中的气泡。
4. 通过调节旋塞阀门，使干燥器腔体与外界环境连通，约每 5 分钟重新引入一次空气。重复此过程，直至通道结构中的所有气泡均被去除。
5. 将培养皿置于 70 ˚C 烤箱中加热 4 小时。时间结束后取出培养皿，使其冷却至室温，然后放置在切割垫上。
6. 使用手术刀切下硅片上方的 PDMS 部分。将切下的 PDMS 夹在两层实验室包裹膜之间。微通道凹陷与半透明膜之间形成的间隙有助于识别微流控通道的位置及其相应的进样口和出样口。
7. 使用剃刀片从大块 PDMS 中切出单个通道。使用与两种尺寸相对应的活检打孔器，分别打出 3 mm 的进样孔和 1.5 mm 的出样孔（图 1A）。
8. 将打孔后的通道以通道面朝上的方向放置在洁净的载玻片上。将一块尺寸为 20 mm × 15 mm、带有薄膜氧化铟锡（ITO）叉指电极的玻璃基底也放置在同一载玻片上，电极面朝上。
9. 小心地将带有 PDMS 和基底的载玻片放入等离子清洗仪中。关闭气体阀门，打开泵开关，等待 2 分钟，使传感器读数达到 600 – 800 mTorr。
10. 打开电源开关并等待 30 秒。将射频（RF）功率旋钮从低调至高，再等待 1 分钟。
11. 然后按相反顺序操作：将射频旋钮调回低档，关闭电源开关，关闭泵开关，并打开气体阀门。
12. 在等离子清洗仪腔体打开后立即取出，提起并旋转 PDMS，使其通道面朝下（180˚），将通道面放置在 ITO 基底上方。键合过程即开始。
13. 使用镊子轻轻按压 PDMS 的四个角约 3 秒。避免按压通道本身。
    注意：当两个经处理的表面发生物理接触时，键合过程会自发进行。
14. 将预润湿介质装入带有 23 G 针头的 1 mL 注射器中。将针头垂直插入进样孔，缓慢释放介质以润湿通道。操作应缓慢，避免引入气泡。孵育至少 3 分钟。
15. 使用 10 µL 移液器吸头移除预润湿介质。通过将介电电泳（DEP）介质注入通道，用 DEP 介质清洗通道 3 次。始终保持通道处于湿润状态。

2. 测试夹具

注意：测试夹具使用 3D CAD 软件设计，包括一个底座单元和一个顶部单元（图 1B）。随后，使用三轴数控铣床进行加工，标准公差约为 ± 0.005 英寸。使用电子卡尺（未示出）检查测试夹具的尺寸。体外生物力学测试无需夹具无菌。

1. 将导线预先焊接到两组弹簧活塞连接器的焊杯端。
2. 将弹簧活塞连接器插入上部单元，并滴加一滴环氧胶实现永久固定。

3. 电变形工作缓冲液的制备

1. 配制 DEP 介质时，使用天平称取 12.75 g 蔗糖和 0.45 g 葡萄糖。
2. 将两种粉末溶于一个容器中，加入 150 mL 去离子水（DI 水）和 3.5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）。
3. 使用低量程电导率仪测量电导率，并确保其值为 0.04 S/m（图 2）。
   注意：可使用不同的电导率值，这可能会改变最终介电泳力（DEP 力）的符号和大小¹¹。然而，电致变形需要正向介电泳力。
4. 使用渗透压计确认渗透压处于血浆正常范围，即 275 至 295 mOsm/kg 水（图 3）。4 ˚C 下保存。DEP 介质现已配制完成。
5. 在 15 mL 离心管中，将 0.5 g 牛血清白蛋白（BSA）溶于 10 mL DEP 介质中，充分混匀。装置的预冲介质现已配制完成。

4. 细胞悬液的制备

1. 取20 µL全血，加入1 mL PBS，以268 × g 离心3分钟，洗涤血液。弃去上清液。
2. 将红细胞重悬于1 mL PBS中，轻轻吹打混匀。以268 × g 离心3分钟洗涤红细胞，弃去上清液。
3. 使用10 µL微量移液器吸取5 µL红细胞沉淀，充分排入1 mL DEP培养基中。以268 × g 离心3分钟洗涤细胞。
4. 弃去上清液，将红细胞重悬于1 mL DEP培养基中，轻轻吹打混匀。
5. 以268 × g 离心3分钟洗涤红细胞，弃去上清液。将2 µL红细胞沉淀移入500 µL DEP培养基中。此时细胞悬液的浓度范围为1 - 6.2 × 10⁴ 个细胞/µL¹²，可使用标准细胞计数板进行确认。

5. 电致变形装置与疲劳测试

1. 将微流控装置放入测试夹具的底部。将夹具的上部与装置对齐，并使用两组尼龙螺丝和螺母将两部分组装在一起（图4）。
2. 将测试夹具放置在显微镜载物台上。在显微镜下定位一组目标电极。
3. 将与所定位电极组相对应的一对电极导线连接至函数发生器的输出端（图4）。
4. 从微流控通道的3 mm进样口移除5 µL介电泳介质。使用10 µL移液枪头缓慢将5 µL细胞悬液加载至进样口。
5. 静置1分钟使细胞沉降。如有必要，向进样口添加额外的介电泳介质以推动细胞进入通道。
6. 在20倍放大倍数下观察通道。使用414/46 nm带通滤光片以增强成像对比度。
7. 按下正弦按钮，设置一个频率为3 MHz、幅值为2 V_RMS的正弦波。按下调制按钮以启用调制功能。通过按下类型选项将波形模式更改为ASK。
8. 将调制频率设置为250 mHz，对应4秒的加载-卸载周期（图5A）。开启函数发生器的输出。
9. 每隔10分钟以每秒30帧（fps）的速度录制一段1分钟的视频。

6. 红细胞变形特性的表征

1. 使用视频编辑应用程序，通过按 Ctrl+O 打开上一步骤中记录的 .avi 文件。利用时间轴选择感兴趣的帧，并通过按键盘上的 Home 键然后按 End 键，将选区的起始帧和结束帧设置为相同。
2. 导出图像帧。选择输出格式为 JPEG，然后按 OK。
3. 打开 ImageJ 应用程序并加载上一步保存的图像。首先按 分析 > 设置测量值，并确保勾选 面积、周长 和 拟合椭圆 的复选框，然后按 OK。
4. 接下来，通过选择 图像 > 类型 > 8 位 将图像转换为灰度图像。
5. 然后使用 图像 > 调整 > 阈值 将图像转换为二值图像。在“阈值”对话框中，根据需要调整两个滑块。点击 应用，然后关闭“阈值”对话框。
6. 选择 分析 > 工具 > ROI 管理器。在 ROI 管理器中，勾选标有 显示全部 的复选框。请勿关闭此窗口。
7. 选择 魔棒（描迹）工具，在图像中选择一个合适的细胞，然后按键盘上的 T 键。所选细胞将被编号。可再次选择新的细胞。选择所有需要测量的合适细胞。合适的细胞是指与其他细胞分离的细胞。在单个视野中，这些细胞的数量可能在 50 到 200 个之间。
8. 返回 ROI 管理器窗口并点击 测量。这将打开“结果”窗口。标有“主轴”和“次轴”的列分别为拟合椭圆的长轴和短轴长度（单位：像素）。选择 文件 > 另存为，将测量结果以 CSV 格式文件导出。
9. 使用任何合适的计算分析软件，计算主轴与次轴的商值。

结果

当将细胞悬液注入微流控通道时，可观察到细胞分布相对均匀。在函数发生器输出信号（例如简单的正弦波或幅移键控ASK的开启键控相位）作用下，薄膜叉指电极产生非均匀的交流电场。悬浮细胞自发响应这种电刺激，表现出正介电泳行为，即向电场强度较高的电极边缘移动。因此，细胞沿电极边缘排列，并因电致变形而被拉伸。在开启键控相位下，红细胞因电致变形而被拉伸；在关闭键控相位下，红细胞则松弛恢复（图5B）。在本实验方案中，保持细胞的离散性至关重要。按照本方案所述的稀释倍数，正常红细胞悬液的浓度范围为1 - 6.2 × 10⁴ 个细胞/µL。在此浓度范围内，我们能够在实现高通量细胞测量的同时，最大限度地减少因正介电泳效应导致的细胞聚集。

在进行1小时的疲劳测试期间追踪单个红细胞时，我们观察到细胞变形能力逐渐下降（图5C）。变形性通过拟合单个红细胞的椭圆的长轴与短轴之比来量化，该分析使用开源成像软件完成（图6）。将感兴...

讨论

通过使用ASK OOK调制的介电泳力诱导正弦波，可对红细胞（RBCs）进行长时间的机械疲劳测试。在本实验方案中，我们将体外疲劳测试时间限制为1小时，以避免可能对细胞变形能力产生不利的代谢影响。可利用ASK调制的电极变形技术编程设定全面的疲劳测试条件。加载频率、振幅和加载速率等参数均可进行编程设置。可通过将加载频率设定为不同数值，来确定疲劳对加载频率的依赖性，以及循环加载与静态加载之间的差异¹³。

通过使用不同的电压水平，可以轻松调节拉伸程度，以适应小形变或大形变。然而，当采用高电压水平引起大形变时，需注意电致形变会导致红细胞呈现火焰状（图6，步骤3）。此时，若使用椭圆模型拟合细胞形状，会截去细胞的尖端部分，从而引入误差。在此情况下，特别是在利用电致形变提取细胞膜剪切黏弹性参数时，可采用两种策略：（i）使用真实细胞形状的计算模型，相比简单的解析椭圆模型可提供更准确的结果；（ii）采用较低的电压水平拉伸细胞，使细胞形状能够被椭圆良好拟合。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
天平	ViBRA	HT-224R
带通滤光片	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD 带Luer-Lok™接头的一次性注射器，1 mL	费舍科学（Fisher Scientific）	14-823-30
带推杆系统的活检穿孔器，1.5 mm	费舍科学（Fisher Scientific）	12-460-403
带推杆系统的活检穿孔器，3 mm	费舍科学（Fisher Scientific）	12-460-407	直径1.5 mm和3 mm
钝头针，23号	BSTEAN	X001308N97
牛血清白蛋白	RMBIO	BSA-BSH
离心机	SCILOGEX	911015119999
50 mL锥形管	费舍科学（Fisher Scientific）	05-539-13
葡萄糖	费舍科学（Fisher Scientific）	MDX01455	MilliporeSigma™
EC低电导率仪	ecoTestr	358/03
Eppendorf   带 snap-cap 的微量离心管	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft		绘图
函数发生器	SIGLENT	SDG830
玻璃/ITO电极基底	OSSILA	S161
ImageJ	美国国立卫生研究院（NIH）		https://imagej.nih.gov/ij/
倒置显微镜	OLYMPUS	IX81 - SN9E07015
实验室烘箱	QUINCY LAB (QL)	MODEL 30GCE	数字型号
Matlab	MathWorks		绘图
微渗透压计 - 型号 3300	Advanced Instruments Inc.	S/N: 03050397P
Parafilm实验室封口膜	费舍科学（Fisher Scientific）	13-374-12
培养皿	FALCON	SKU=351006	ICSI/活检皿 50*9 mm
磷酸盐缓冲液（PBS）	LONZA	04-479Q
等离子清洗机	Harrick plasma PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		CAD软件
蔗糖	费舍科学（Fisher Scientific）	50-188-2419
真空干燥器	SPBEL-ART	F42400-2121
木制刮勺	费舍科学（Fisher Scientific）	NC0304136	木质压舌板 NS 6"