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活体单神经元分辨率下新生小鼠感觉皮层自发活动的可视化

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DOI：

10.3791/65899

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2023年11月21日

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Kagoshima University, 2Laboratory of Multi-Dimensional Imaging, International Research Center for Medical Sciences (IRCMS), Kumamoto University, 3Graduate School of Medical Sciences, Kumamoto University, 4Cedars-Sinai Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

发育过程中，新皮层的初级感觉区表现出独特的自发性活动。本文介绍了如何在新生小鼠中可视化单个神经元活动及初级感觉区，以分析特定脑区的同步活动 体内.

摘要

哺乳动物的大脑在整个产前和产后时期，在细胞和神经环路水平均经历动态的发育变化。在发现众多参与这些发育过程的基因之后，目前研究已知神经元活动也在很大程度上调控这些过程。在发育中的大脑皮层中，神经元表现出同步化的活动模式，且每种主要感觉区域均具有特化的活动特征。这些模式与成熟皮层中的活动模式显著不同，突显了其在调控区域特异性发育过程中的作用。发育过程中神经元活动的异常可导致多种脑部疾病。这些发现强调了研究神经元发育中活动模式潜在调控机制的必要性。本文总结了一系列用于在新生小鼠中可视化主要感觉区域及神经元活动的实验方案，利用双光子显微镜在活体（in vivo）条件下对皮层亚区中单个神经元的活动进行成像，并分析与皮层亚区相关的活动相关性。我们展示了体感皮层单个桶状结构内呈现斑块状同步活动的代表性结果。此外，我们还讨论了该实验方案的多种潜在应用及其部分局限性。

引言

大脑皮层包含多个具有不同功能的感觉区域。这些区域接收来自相应感觉器官的输入信号，这些信号主要通过脊髓或脑干传递，并经由丘脑中继1,2。值得注意的是，在发育早期阶段，每个初级感觉区域中的神经元表现出独特而同步的活动，这些活动起源于感觉器官或低级神经中枢，但与成熟皮层中观察到的活动存在本质差异3。

例如，在新生啮齿类动物中，初级视觉区（V1）表现出波浪状的活动，这种活动起源于视网膜（视网膜波），并沿整个视觉通路传播，同时保持视网膜拓扑结构4。初级听觉区（A1）表现出同步活动，其组织成带状亚区，对应于成熟大脑中的等频率带，活动起源于耳蜗的内毛细胞5,6。初级躯体感觉区（S1）中的桶状皮层表现出类似拼图的活动模式，其中各个桶状结构内的第4层神经元（即对单根触须有反应的神经元）被同步激活7。尽管有研究提出该活动可能起源于三叉神经节，但其确切来源仍不清楚7。因此，新生期的活动模式在每个初级感觉区内部以及各区内的亚区均具有特异性。同时可视化初级感觉区的神经元活动与结构，有助于探究这些活动模式对感觉系统发育的贡献。

本文中，我们总结了一系列实验方案：（1）利用表达红色荧光蛋白的丘脑皮层轴突-红色荧光蛋白（TCA-RFP）小鼠，通过GCaMP稀疏标记来可视化单个神经元活动以及初级感觉区域7，（2）利用双光子显微镜对新生小鼠的单细胞水平活动进行成像 体内，以及（3）分析S1桶状皮层内的活动相关性。代表性结果展示了出生后第6天（P6）小鼠单个桶状结构内呈镶嵌样同步活动。尽管存在一些局限性，该技术可用于慢性成像、跨多个感觉区域的宽场成像以及多种操控实验。对发育过程中神经元活动的多维度分析将加深我们对脑环路形成机制的理解。

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方案

所有实验均按照熊本大学和遗传学国立研究所的动物实验指南进行，并经动物实验委员会批准。

1. 在子宫内 电穿孔（IUE）

  1. 将ICR背景的TCA-RFP雄性小鼠与野生型ICR雌性小鼠交配。次日清晨观察阴道栓以确认交配成功。两周后观察腹部以确认妊娠。
  2. 配制含有5 ng/µL TRE-nCre、1 µg/µL CAG-loxP-stop-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE以及0.02%台盼蓝的质粒溶液，溶剂为ddH2O，用于通过Supernova系统稀疏标记GCaMP表达的神经元8。
  3. 配制镇痛剂溶液，含0.5 mg/mL卡洛芬和0.01 mg/mL丁丙诺啡。避光保存，并置于室温条件下。
  4. 在胚胎第14天（E14）进行子宫内电穿孔（IUE），操作步骤如下。IUE方法基本参照既往文献报道9,10,11。
    1. 用70%乙醇或戊二醛溶液擦拭实验台面。所有手术器械经高压灭菌处理。佩戴口罩和实验服，以降低小鼠感染风险。
    2. 使用玻璃微电极拉制仪制备玻璃微移液管。用吸管将质粒混合溶液吸入玻璃微移液管中。
    3. 在E14时使用异氟烷（空气中浓度2.0%）对怀孕小鼠进行麻醉，并在手术过程中持续给予异氟烷（空气中浓度1.2%）维持麻醉。通过夹捏脚趾检查确认麻醉深度。使用眼用软膏防止角膜干燥。
    4. 使用碘伏和70%乙醇交替消毒腹部区域至少三次。覆盖无菌手术巾，沿腹中线切开皮肤，暴露子宫并将其移至手术巾上。
    5. 在整个操作过程中（直至步骤1.4.8关闭腹腔），反复滴加温热生理盐水以防止子宫干燥或降温。
    6. 使用微移液管和吸管，逐个向胚胎侧脑室单侧注射质粒溶液。
    7. 使用镊状电极夹住胚胎头部，通过电穿孔仪施加五次方波电脉冲（40 V，50 ms），脉冲间隔为1秒。
    8. 将子宫放回腹腔。向腹腔内注入约3 mL温热生理盐水。缝合腹膜和腹部皮肤。在颈部背部皮下注射镇痛剂溶液，剂量为10 μL/g体重（卡洛芬5 μg/g体重，丁丙诺啡0.1 μg/g体重）。
  5. 将小鼠置于加热垫（37 °C）上的恢复笼中，使其从麻醉中恢复。将小鼠俯卧放置，以防舌头或唾液阻塞气道。单独饲养并持续监测，直至其恢复正常活动能力，然后将其放回饲养笼中。
  6. 出生后进行基因型鉴定，以检测RFP等位基因，并对未携带该等位基因的仔鼠实施安乐死。建议执行此步骤，特别是在出生后第二周进行成像时，此时TCA-RFP信号较弱，难以在步骤2.2.7中准确判断。

2. 颅窗手术

  1. 在手术前一天，配制含有 125 mM NaCl、5 mM KCl、10 mM 葡萄糖、10 mM HEPES、2 mM CaCl2 和 2 mM MgSO4 的皮层缓冲液（ddH2O 中），并用 1 M NaOH 将 pH 值调节至 7.412。使用真空过滤器对缓冲液进行灭菌。
    注意：该缓冲液可在 4 °C 下保存最多 3 个月。每只幼鼠所需体积为 5–10 mL。
  2. 在出生后第 3–12 天（P3–12）进行以下步骤。也可参见此前已发表的关于该操作的文献报告13,14。
    1. 将 50 mg 琼脂糖与 5 mL 皮层缓冲液混合，加热至完全溶解。取部分溶液转移至 1.5 mL 离心管中，并保持在 42 °C。
    2. 取部分皮层缓冲液置于 50 mL 锥形管中，室温保存。另取部分生理盐水置于容器（如 50 mL 锥形管盖）中，室温保存。
    3. 配制含有 0.01 mg/mL 布托啡诺的镇痛溶液。避光保存，室温放置。
    4. 通过高压灭菌对所有手术器械进行灭菌。用 70% 乙醇对荧光体视显微镜进行消毒。
    5. 使用异氟烷蒸发器以异氟烷（空气中 2.0%）诱导幼鼠麻醉。密切观察幼鼠状态，当其呼吸略微减慢时立即取出。
      注意：若麻醉时间过长，幼鼠呼吸可能暂停数秒。即使呼吸恢复，长时间麻醉仍可能降低幼鼠脑血流量，导致不可逆的脑损伤。
    6. 用碘伏和 70% 乙醇交替消毒幼鼠头部至少三次。将幼鼠置于荧光体视显微镜下的加热垫（35 °C）上。持续以异氟烷（空气中 1.5%–2.5%）维持麻醉状态。
    7. 通过颅骨观察荧光，筛选表达 TCA-RFP 和 GCaMP 的幼鼠。对未同时表达两种荧光蛋白的幼鼠实施安乐死。
    8. 尽可能广泛地小心剥离大脑半球上方的头皮，避免出血。用无菌生理盐水浸湿的棉签擦拭颅骨，去除结缔组织。
    9. 待颅骨干燥后，使用组织粘合剂将切开的头皮表面粘附于颅骨上。
    10. 将幼鼠转移至 37 °C 加热垫上，使其从麻醉中恢复。等待至少 15 分钟，使粘合剂充分固化。
      注意：可在下一步操作前暂停最多 1 小时。在此期间可根据需要以相同方式准备其他幼鼠。
    11. 以异氟烷对幼鼠再次麻醉。在麻醉状态下（空气中 1.5%–2.5% 异氟烷），将幼鼠置于 37 °C 加热垫上的荧光体视显微镜下。
      注意：若麻醉时间超过实验终点时间（60 分钟），需在异氟烷麻醉下通过断头法对幼鼠实施安乐死。
    12. 用无菌永久性标记笔在颅骨上标记 GCaMP 表达的位置。在该位置滴加皮层缓冲液。
    13. 将刀片一角插入颅骨，缓慢推进以削除颅骨并形成开窗。用镊子夹取碎裂的颅骨并移除。
    14. 通过观察开窗处的血管判断颅骨开窗是否成功。若发生出血，立即使用移液器以皮层缓冲液快速冲洗。重复冲洗直至出血完全停止。
    15. 在颅骨开窗处滴加一滴皮层缓冲液，并将无菌的直径 3 mm 圆形盖玻片覆盖于开窗上。用无纺布擦去多余缓冲液，等待盖玻片周围区域干燥。
    16. 使用移液器将温热的琼脂糖溶液沿盖玻片边缘滴加。由于过多琼脂糖可能减弱荧光信号，可从上方轻压盖玻片，将盖玻片下方多余溶液挤出并去除。
    17. 用镊子去除盖玻片表面或远离边缘的琼脂糖，仅保留围绕盖玻片外周的琼脂糖。
    18. 等待琼脂糖完全固化。若琼脂糖收缩导致盖玻片下方出现空隙，从侧面补充琼脂糖溶液，确保完全覆盖盖玻片边缘。用无纺布吸除颅骨表面的液体。
    19. 在橡胶容器中混合丙烯酸树脂粉末与液体。用移液器吸取混合物，将其倾倒于盖玻片周围的琼脂糖上，形成树脂包埋。
      注意：由于树脂在粉末与液体混合后迅速固化，需在使用前反复混合。每次混合所需用量约为液体 500 µL，粉末 0.15 g。
    20. 用树脂将钛条固定于对侧大脑半球，保持钛条角度与盖玻片平行。用树脂固定整个颅骨表面。
    21. 在颈部背部皮下注射镇痛溶液，剂量为 10 μL/g 体重（布托啡诺剂量为 0.1 μg/g 体重）。将幼鼠放回 37 °C 加热垫以恢复麻醉。成像前需等待 >60 分钟，确保树脂完全固化。
      注意：成像前可暂停 1–5 小时。在此期间可对其他幼鼠进行相同手术操作。

3. 双光子钙成像

  1. 将带有钛板的双轴测角仪安装到显微镜下方具有XY定位功能的载物台上，并在载物台上设置加热垫（35 °C）。
  2. 启动扫描软件，设置以下参数：像素，512 x 512；双向扫描，开启；平均次数，无；成像区域，600 x 600 µm，使用20倍物镜。调整设置使扫描速率高于1 Hz。
  3. 将幼鼠置于加热垫上，用螺丝将头固定钛杆固定在钛板上。通过连接异氟烷（空气中浓度1.5-2.0%）的管路接口维持麻醉状态。
  4. 通过测角仪调节窗口的水平角度。打开背光照明，使用5倍物镜观察脑表面，并通过XY定位选择成像区域。
  5. 向颅窗滴加眼药水。切换至20倍水浸物镜，观察皮层表面，确认脑表面可见血流信号。
  6. 关闭背光照明，使用单光子模式扫描脑表面。提高激光功率，使玻璃和脑表面的绿色自发荧光可见。
  7. 将异氟烷浓度降低至1.0%-1.5%。遮盖显微镜以避免光线泄漏。将扫描软件切换至双光子模式。
  8. 调整激光功率和探测器增益，使其适合扫描GCaMP和RFP信号。找到可见TCA-RFP信号的深度，确保该深度位于P6时期脑表面下方约300 µm处，即第4层。选择含有大量表达GCaMP神经元的区域作为成像区域。
  9. 开始对GCaMP和RFP信号进行延时成像。若无法进行双通道同步扫描，可在正式成像前分别采集GCaMP和TCA-RFP图像。
  10. 停止异氟烷供给以减轻麻醉深度，观察约20分钟内的自发活动。使用红外相机监测成像期间幼鼠的运动情况。一旦观察到任何表明痛苦的反应，立即恢复异氟烷麻醉（空气中浓度2%）。
  11. 待幼鼠停止运动后，从步骤3.9开始重复成像。根据需要更换成像区域。
  12. 使用过量异氟烷处死幼鼠，经心脏灌注生理盐水和4%多聚甲醛固定脑组织，随后在4% PFA中过夜后固定，以制备切向脑片并进行免疫组织化学分析。或者，也可使用过量麻醉剂处死幼鼠后进行断头处理。
  13. 若母鼠无其他幼鼠哺育，使用过量麻醉剂处死母鼠，随后进行颈椎脱臼处理。

4. 分析

  1. 启动 MATLAB 并运行 EZcalcium 工具箱15 打开图形用户界面（GUI）初始图形用户界面'.
  2. 校正由于小鼠运动或其他原因导致的图像帧漂移。
    1. 点击 运动校正 在初始图形用户界面中打开 运动校正图形用户界面. 点击“添加文件...用于加载成像数据的 TIF 文件。
    2. 将设置按如下方式设定： 非刚性运动校正; 上采样因子，50; 最大偏移量，15; 初始批次大小，200; Bin Width, 200. 点击“运行运动校正以执行校正。运动校正后的成像数据将自动保存。
      注意：应根据成像数据的特性调整参数设置。若因非线性帧畸变或皮层在深度方向上的运动导致部分帧的漂移未被校正，请在 ImageJ Fiji 中打开未经校正的原始成像数据，移除相关帧，然后重新执行步骤 4.2。
  3. 检测神经元并绘制感兴趣区域（ROIs）。
    1. 点击 自动ROI检测 在初始图形用户界面中打开 ROI 检测图形用户界面. 点击 添加文件... 用于加载经过运动校正的成像数据。
    2. 设置参数如下： 初始化，贪婪法；搜索方法，椭圆；去卷积，约束性FOOPSI-SPGL1；自回归，衰减；估计的ROI数量，60（建议为目视检测数量的两倍以上）；估计的ROI宽度，17（~20 µm）；合并阈值，0.95；模糊因子，0.95；空间下采样，1；时间下采样，1；时间迭代次数，5.
      注意：应根据成像数据的特性调整设置。
    3. 点击 运行 ROI 检测 以执行检测。ROI 数据将自动保存。
    4. 点击 ROI 优化 在初始图形用户界面中打开 ROI 优化图形用户界面. 点击 加载数据 加载 ROI 数据。选择活动频率较低的 ROI。<1 Hz），位于颅骨下方，或包含其他神经元的神经突。点击 排除 ROI 以排除这些 ROI 参与分析。
    5. 选择 数据导出格式 到 XLSX 并点击 导出数据 获取包含原始 dF/F 值的 Excel 文件。dF/F 采用公式（1），其中 F 为每帧中像素的平均荧光强度，F0 为基线信号强度，Fb 为背景荧光。
      显微分析用荧光强度比率方程，\(dF/F=((F-F0)/(F0-Fb))\)。     (1)
  4. 计算各ROI之间dF/F的皮尔逊相关系数，并生成相关系数矩阵。仅使用麻醉作用减弱且自发活动开始出现后（停止异氟烷约10分钟后）的dF/F数据。
  5. 使用 Fiji 从 TCA-RFP 图像中定义桶状结构的边界。将 ROI 分类至相应的桶状结构或隔膜区域。比较同一桶内以及不同桶之间的成对相关性。
  6. 通过随机打乱 ROI 与 Ca 之间的对应关系，生成 1,000 至 10,000 组替代数据2+ 计算每组替代数据中各个桶内的平均相关系数，并评估实际数据中相关性的统计显著性。
    注意：如果10,000次置换检验中有一次的结果高于真实值，则统计学显著性为0.0001。步骤4.5和4.6中描述的分析可用于多个动物的合并数据，如同其他研究中所采用的方法7,16.

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结果

图1 展示了使用本方案对P6幼鼠桶状皮层第4层神经元活动的代表性结果。绿色通道（GCaMP）和红色通道（TCA-RFP）的双光子图像经时间平均后显示如下 图1A由于TCA-RFP荧光远弱于GCaMP荧光，GCaMP信号渗入了红色通道图1A1A2). 在表达GCaMP的神经元上绘制了14个ROI（感兴趣区域）图1A4）。尽管RFP图像已足够清晰（图1A2），为了更精确地定义桶状结构的边界，采用来自z轴投影的图像 100 µm- 采用单光子共聚焦显微镜获取的较厚切向切片（图1B，C）。在停止异氟烷后十分钟开始的411秒成像窗口的ΔF/F如图所示 ...

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讨论

鉴于自发性活动起源于感觉器官或低级神经系统，并通过与成熟神经系统相当的通路传导至初级感觉区3，明确定义初级感觉区域以及成像神经元在该区域内的位置至关重要。在本方案中，我们通过使用可标记丘脑皮层轴突的转基因小鼠以及稀疏表达GCaMP的Supernova系统来满足这一需求8这些技术使得能够分析各个感觉区域以及区域内部亚区的活动模式，为研究感觉系统发育机制提供了手段。

尽管本方案总结了如何观察S1桶状区内的斑块状活动，但该方法同样适用于观察其他皮层区域的独特活动模式，如在V1区所示7。某些神经活动会在多个皮层之间同步或传播，这类现象主要通过单光子成像技术进行研究3,17,18,19。近年来建立...

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披露

作者声明无竞争性财务利益。

致谢

本工作得到了日本促进科学学会变革性研究领域（B）项目（22H05092、22H05094）和科学研究资助项目20K06876、AMED（资助编号21wm0525015）、武田科学振兴财团、内藤财团、加藤纪念生物科学振兴财团、光和生命科学财团以及NIG-JOINT（24A2021）（授予H.M.）；以及日本促进科学学会科学研究资助项目19K06887和22K06446、小玉纪念医疗研究基金、上原纪念财团、加藤纪念生物科学振兴财团和武田科学振兴财团（授予N.N-T.）的支持。我们感谢岩里琢次博士（Dr. Takuji Iwasato）提供TCA-RFP小鼠。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20× 物镜（水浸式）
250 mL 真空过滤/储存瓶系统Corning431096
4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液（4% PFA）Nacalai09154-85
丙烯酸树脂（UNIFAST II）GCN/A
琼脂糖SigmaA9793
吸管组件Drummond2-040-000
CaCl2•2H2ONacalai06731-05
电穿孔仪BEXGEB14
滴眼液（Scopisol）Senju PharmaceuticalN/A
荧光体视显微镜LeicaM165FC
葡萄糖Nacalai16806-25
加热垫Muromachi KikaiFHC-HPS
HEPESGibco15630-080
异氟烷PfizerN/A
KClNacalai28514-75
MgSO4•7H2OWako131-00405
微量移液器拉制仪NarishigePC-100
多光子激光器Spectra-PhysicsMai Tai eHP DeepSee
多光子显微镜ZeissLSM 7MP
NaClNacalai31320-05
无纺布（Kimwipe）Kimberly ClarkS-200
磷酸盐缓冲液（PBS）Nacalai27575-31
质粒：CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPREAddgenepK175
质粒：TRE-nCreAddgenepK031
精密校准微量移液器Drummond2-000-050
剃须刀片FeatherFA-10
Rimadyl（50 mg/mL 卡洛芬）Zoetis JPN/A
圆形盖玻片，直径 3 mm MatsunamiCS01078
生理盐水Otsuka035175315
戊巴比妥钠Nacalai26427-72
活体幼鼠成像平台（两个单轴平移台用于 XY 定位，双轴测角仪，基板，可调支柱用于 Z 定位）ThorLabsLT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFP 小鼠N/AN/AMizuno et al., 2018a
组织粘合剂（Vetbond）3M1469SB
钛棒Endo Scientific InstrumentN/A定制（Mizuno et al., 2018b）
钛棒固定板N/A定制（Mizuno et al., 2018b）
台盼蓝SigmaT8154
带铂电极板的镊子，直径 5 mmBEXCUY650P5
野生型 ICR 小鼠Nihon SLCSlc:ICR

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