活体单神经元分辨率下新生小鼠感觉皮层自发活动的可视化

摘要

发育过程中，新皮层的初级感觉区表现出独特的自发性活动。本文介绍了如何在新生小鼠中可视化单个神经元活动及初级感觉区，以分析特定脑区的同步活动 体内.

摘要

哺乳动物的大脑在整个产前和产后时期，在细胞和神经环路水平均经历动态的发育变化。在发现众多参与这些发育过程的基因之后，目前研究已知神经元活动也在很大程度上调控这些过程。在发育中的大脑皮层中，神经元表现出同步化的活动模式，且每种主要感觉区域均具有特化的活动特征。这些模式与成熟皮层中的活动模式显著不同，突显了其在调控区域特异性发育过程中的作用。发育过程中神经元活动的异常可导致多种脑部疾病。这些发现强调了研究神经元发育中活动模式潜在调控机制的必要性。本文总结了一系列用于在新生小鼠中可视化主要感觉区域及神经元活动的实验方案，利用双光子显微镜在活体（in vivo）条件下对皮层亚区中单个神经元的活动进行成像，并分析与皮层亚区相关的活动相关性。我们展示了体感皮层单个桶状结构内呈现斑块状同步活动的代表性结果。此外，我们还讨论了该实验方案的多种潜在应用及其部分局限性。

引言

大脑皮层包含多个具有不同功能的感觉区域。这些区域接收来自相应感觉器官的输入信号，这些信号主要通过脊髓或脑干传递，并经由丘脑中继^1,2。值得注意的是，在发育早期阶段，每个初级感觉区域中的神经元表现出独特而同步的活动，这些活动起源于感觉器官或低级神经中枢，但与成熟皮层中观察到的活动存在本质差异³。

例如，在新生啮齿类动物中，初级视觉区（V1）表现出波浪状的活动，这种活动起源于视网膜（视网膜波），并沿整个视觉通路传播，同时保持视网膜拓扑结构⁴。初级听觉区（A1）表现出同步活动，其组织成带状亚区，对应于成熟大脑中的等频率带，活动起源于耳蜗的内毛细胞^5,6。初级躯体感觉区（S1）中的桶状皮层表现出类似拼图的活动模式，其中各个桶状结构内的第4层神经元（即对单根触须有反应的神经元）被同步激活⁷。尽管有研究提出该活动可能起源于三叉神经节，但其确切来源仍不清楚⁷。因此，新生期的活动模式在每个初级感觉区内部以及各区内的亚区均具有特异性。同时可视化初级感觉区的神经元活动与结构，....

方案

所有实验均按照熊本大学和遗传学国立研究所的动物实验指南进行，并经动物实验委员会批准。

1. 在子宫内 电穿孔（IUE）

1. 将ICR背景的TCA-RFP雄性小鼠与野生型ICR雌性小鼠交配。次日清晨观察阴道栓以确认交配成功。两周后观察腹部以确认妊娠。
2. 配制含有5 ng/µL TRE-nCre、1 µg/µL CAG-loxP-stop-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE以及0.02%台盼蓝的质粒溶液，溶剂为ddH₂O，用于通过Supernova系统稀疏标记GCaMP表达的神经元⁸。
3. 配制镇痛剂溶液，含0.5 mg/mL卡洛芬和0.01 mg/mL丁丙诺啡。避光保存，并置于室温条件下。
4. 在胚胎第14天（E14）进行子宫内电穿孔（IUE），操作步骤如下。IUE方法基本参照既往文献报道^9,10,11。
   1. 用70%乙醇或戊二醛溶液擦拭实验台面。所有手术器械经高压灭菌处理。佩戴口罩和实验服，以降低小鼠感染风险。
   2. 使用玻璃微电极拉制仪制备玻璃微移....

结果

图1 展示了使用本方案对P6幼鼠桶状皮层第4层神经元活动的代表性结果。绿色通道（GCaMP）和红色通道（TCA-RFP）的双光子图像经时间平均后显示如下 图1A由于TCA-RFP荧光远弱于GCaMP荧光，GCaMP信号渗入了红色通道图1A1A2). 在表达GCaMP的神经元上绘制了14个ROI（感兴趣区域）图1A4）。尽管RFP图像已足够清晰（图1A2），为了更精确地定义桶状结构的边界，采用来自z轴投影的图像 100 µm- 采用单光子共聚焦显微镜获取的较厚切向切片（图1B，C）。在停止异氟烷后十分钟开始的411秒成像窗口的ΔF/F如图所示 .......

讨论

鉴于自发性活动起源于感觉器官或低级神经系统，并通过与成熟神经系统相当的通路传导至初级感觉区³，明确定义初级感觉区域以及成像神经元在该区域内的位置至关重要。在本方案中，我们通过使用可标记丘脑皮层轴突的转基因小鼠以及稀疏表达GCaMP的Supernova系统来满足这一需求⁸这些技术使得能够分析各个感觉区域以及区域内部亚区的活动模式，为研究感觉系统发育机制提供了手段。

尽管本方案总结了如何观察S1桶状区内的斑块状活动，但该方法同样适用于观察其他皮层区域的独特活动模式，如在V1区所示⁷。某些神经活动会在多个皮层之间同步或传播，这类现象主要通过单光子成像技术进行研究^3,17,18,19。近年来建立.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20× 物镜（水浸式）
250 mL 真空过滤/储存瓶系统	Corning	431096
4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液（4% PFA）	Nacalai	09154-85
丙烯酸树脂（UNIFAST II）	GC	N/A
琼脂糖	Sigma	A9793
吸管组件	Drummond	2-040-000
CaCl2•2H2O	Nacalai	06731-05
电穿孔仪	BEX	GEB14
滴眼液（Scopisol）	Senju Pharmaceutical	N/A
荧光体视显微镜	Leica	M165FC
葡萄糖	Nacalai	16806-25
加热垫	Muromachi Kikai	FHC-HPS
HEPES	Gibco	15630-080
异氟烷	Pfizer	N/A
KCl	Nacalai	28514-75
MgSO4•7H2O	Wako	131-00405
微量移液器拉制仪	Narishige	PC-100
多光子激光器	Spectra-Physics	Mai Tai eHP DeepSee
多光子显微镜	Zeiss	LSM 7MP
NaCl	Nacalai	31320-05
无纺布（Kimwipe）	Kimberly Clark	S-200
磷酸盐缓冲液（PBS）	Nacalai	27575-31
质粒：CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE	Addgene	pK175
质粒：TRE-nCre	Addgene	pK031
精密校准微量移液器	Drummond	2-000-050
剃须刀片	Feather	FA-10
Rimadyl（50 mg/mL 卡洛芬）	Zoetis JP	N/A
圆形盖玻片，直径 3 mm	Matsunami	CS01078
生理盐水	Otsuka	035175315
戊巴比妥钠	Nacalai	26427-72
活体幼鼠成像平台（两个单轴平移台用于 XY 定位，双轴测角仪，基板，可调支柱用于 Z 定位）	ThorLabs	LT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFP 小鼠	N/A	N/A	Mizuno et al., 2018a
组织粘合剂（Vetbond）	3M	1469SB
钛棒	Endo Scientific Instrument	N/A	定制（Mizuno et al., 2018b）
钛棒固定板		N/A	定制（Mizuno et al., 2018b）
台盼蓝	Sigma	T8154
带铂电极板的镊子，直径 5 mm	BEX	CUY650P5
野生型 ICR 小鼠	Nihon SLC	Slc:ICR