结扎诱导牙周炎小鼠模型的临床前研究优化

摘要

结扎诱导牙周炎小鼠模型是一种有效且日益流行的牙周病研究工具。详细指导旨在实现简化版模型，重点关注邻近齿槽骨破坏，包括实验室设计、3D打印工具制作及利用μCT分析进行骨骼量化。

摘要

小鼠结扎诱发牙周炎的实验模型在理解牙周病发病机制方面发挥了基础作用;然而，它尚未被充分用于转化和治疗应用。与人类疾病类似，小鼠结扎诱发的牙周炎通过一系列不同的微生物、炎症和骨免疫事件发展。结扎引起的牙槽骨破坏进展较短且易于量化，使其成为临床前研究中经济高效的疾病模型。

为克服经典结扎模型的技术挑战，策划了简化的结扎诱发牙周炎小鼠模型。简化的疾病模型并非在两颗相邻牙齿的整个周长内诱发疾病，而是仅聚焦于两颗后牙的近端区域炎症性骨破坏，而该区域也是常见牙周病在人类中引发的区域。由于采用三维（3D）打印工具进行绑扎，这种方法快速且高效，每只鼠标的操作时间约为5-10分钟。虽然结扎放置3天后检测到破骨细胞生成信号，但骨破坏在结扎后9天持续发生。

这里，通过突出研究设计中特定的重要要素（如度数计算、程序标准化、校准）、3D打印工具开发（如“小鼠牙科床”和“连接夹”）以及利用μCT分析进行齿槽骨定量，进一步阐述了简化的结扎模型协议。 Rank、Rankl和Opg的 牙龈基因表达，作为胚骨形成的主要调控三联体，被用作治疗有效性的间接证据。本文提出的方法将指导研究人员实施简化结扎诱发牙周炎模型，以测试临床前环境中创新的牙周治疗方法。

引言

牙周病是一种复杂的炎症过程，会导致牙龈、牙周韧带、牙骨质和牙槽骨等牙齿支持结构的破坏。要发生牙周骨质流失，除了牙龈屏障的破坏和细菌入侵外，还需要发生炎症细胞的招募，以及从先天主导的免疫反应转变为获得性主导的免疫反应¹。成骨细胞与破骨细胞之间的最终失衡将导致其破坏导致牙槽骨流^失。区分牙周病与可逆性龈炎（龈炎）诊断的标志性表型发现是牙槽骨的丧失。因此，支撑牙齿的齿槽骨数量是临床前阶段的关键治疗结果。

没有单一动物模型能复制开发不同治疗药物所需的所有生物学方面 ^3,4,5。结扎诱导的牙周炎小鼠模型在相对短的时间内（3-9^天）5实现了可量化的骨骼破坏，使其成为测试新型治疗干预以预防和调节牙周炎的成本效益高的模型。尽管在支持^II-III期人体临床试验6、^{7、8、9、10}方面取得成功，但小鼠结扎诱发牙周炎并未被广泛用作临床前模型。为克服经典结扎绳包围牙齿模型的技术挑战，建立了简化的结扎诱发牙周炎小鼠模型^11,12。经典模型的简单改造侧重于骨骼破坏部位，集中在牙齿之间而非周围。这种改良的好处多方面，包括缩短所需的时间：1）人员培训时间更短，2）实验程序的技术简便性，以及3）骨骼定量的可重复性。此外，研究发现在该简化模型下发展和表现出的若干微生物和免疫事件与当前对常见人类牙周病的理解（2,11,12,13）相符。最后，美国^2.14号此前报告的有效药物诱导骨流失预防进一步支持将简化结扎诱导牙周炎模型作为体内工具，评估新型牙周治疗的关键方面。

简化的结扎诱发牙周炎模型的一个创新方面是开发了3D打印工具，以更便捷地促进疾病诱导过程^11,12。虽然对部分人来说很直观，但研究人员报告称无法组装3D打印工具¹⁵，这可能进一步阻碍或延迟动物研究的启动。本研究扩展了我们之前方案研究¹¹中提供的信息，提供了详细信息，以便在实验室环境中成功实施简化的结扎诱发牙周炎模型。本当前方案中包含的细节是一系列复杂因素的一部分，可能导致科学发现结果不具备重现性 15,16,17。过去10年间，多项研究^{2、11、12、14、18}以及合作研究组^{13、19、20、21}所发现的模型使用和可靠的骨吸收数据支持了传播详细信息以促进科学界可重复性的重要性。

方案

该方案遵循动物研究：体内实验报告（ARRIVE）指南^22,23。本方案中描述的所有实验程序均获得北卡罗来纳大学教堂山分校IACUC的批准。

1. 实验设计

1. 样本大小计算
   注意：由于研究项目具有转化性质，这里的计算功率基于8至12周龄野生型C57Bl6小鼠的齿槽骨测量。
   1. 根据牙骨质-釉质交界处与齿槽骨嵴（CEJ-ABC）之间的线性测量进行骨骼分析。
      1. 健康小鼠的平均附着水平（或CEJ-ABC测量值）为0.2毫米，而在结扎后9天患牙周炎的小鼠则为该长度的两倍（CEJ-ABC距离0.4毫米）¹¹。结扎后9至18天，牙槽骨流失无显著^增加。
      2. 基于该效应量进行检验力计算，以确定揭示健康与疾病差异所需的小鼠数量（此处共计8-10只[图1A]）。
         注意：冪数计算时，采用双样本均值冪，达到0.8至0.95的幂，α = 0.05。群均值和标准差见 图1B。
   2. 要确定对骨质流失的治疗效果，可以进行不同的功率计算。由于实验组和对照组小鼠均患牙周炎，因此不将健康小鼠与患病小鼠进行比较，而是每组保留19至31只小鼠，以确保在使用简化结扎诱发牙周炎小鼠模型测试骨质流失调节时结果的可重复性（见代表性结果和 图1C）。
      注：功率计算方法是使用上述相同的检验方法计算的。组均值和标准差见 图1D。
2. 程序标准化与人员校准
   1. 在研究启动前对所有参与疾病诱导和定量的人员进行培训和校准（交叉校准和校内校正;r² ≥ 0.90）。
      注意：据估计，结扎和骨质流失量化的培训需要2-3个月（时间表见 表1）。其他必要的步骤以时间线形式见 表1。
   2. 在结扎放置过程中，请有两名受过培训的调查员在手术室协同工作。主要研究者（校内和校准间）仍然是操作员，负责放置连接线。
   3. 让第二名调查员担任程序助理，执行以下步骤：
      1. 记录鼠标重量。
      2. 把老鼠放进麻醉盒。
      3. 在将鼠标交给操作员放入“鼠标齿床”之前，先涂抹眼膏。
      4. 确保≥3个“绑带夹”已正确装填并准备使用。
         注意：为提高效率，最好配备≥3个“绑扎架”，方便操作员使用。建议采取紧急措施（即每鼠操作5-10分钟），增加每天实验次数，减少潜在的批量效应。
      5. 进行鼠鼠监测（手术前后）。
         注意：结扎诱发牙周炎是一种非侵入性、非手术性手术，类似于使用牙线治疗人类牙齿。结扎放置通常会引起小鼠非常轻微的不适（主要是由于两颗牙齿间细菌积累），但不应需要使用止痛药。由专业人员进行结扎后，预计不会有并发症。所有动物在扎扎后每2-3天进行一次监测。人道终结情况（如未能理发或进食、无法起身或行走、呼吸困难、坏死或感染伤口）应列入批准的动物方案，但如出现任何并发症，应咨询兽医人员以了解适当的处理。

2. 开发用于诱发小鼠结扎性牙周炎的印刷工具

注意：为了优化连接位置，开发了名为 “鼠标牙科床 ”和 “绑扎夹 ”的3D打印工具，由多个独立的3D打印部件组成，分别打印并手工组装。这些设备的蓝图规范此前已发布于¹¹ 号，经验丰富的研究者可利用其创建单个STL文件。本研究中的新设备是与北卡罗来纳大学教堂山分校BeAM设计中心合作开发的。材料可通过相应的核心设施获取，或使用 补充文件1中的STL文件进行3D打印。

1. 小鼠齿床
   1. 使用3.0毫米聚乳酸（PLA）丝材，使用标准打印质量的3D打印机打印小鼠牙科床（图2A）和结扎夹（图2B）。按照设计方向打印牙科床，其他部分则均匀平整地朝向打印床。通过启用支持放置设置来激活辅助材料选项。通过选择“接触打印板”选项，确保支撑材料先接触到打印平台。
      注意：使用 补充文件1 中的五个STL文件打印所有必需元素，包括分离管、带缺口的结扎、带缺口的鼠标牙科床、盖子和结扎套锁。请参阅 材料表 了解每个物品的尺寸（之前已呈现的蓝图规格¹⁰）。
   2. 打印完成后，使用钢丝剪、尖嘴钳或其他工具裁切模型上所有印刷的支撑材料部件。
      注意：操作过程中请佩戴安全护目镜。
2. 小鼠齿垫组件
   1. 准备小鼠齿床时，将所有部件如图所示摆放（图3A），并准备胶水（图3B）。
   2. 滴几滴胶水（见图3C），然后按图示（图3D）固定螺丝。同样，准备将胶水（图3E）转移到将要涂抹的区域。将打印管的槽（见图3F）滑入，倒钩端朝向鼠齿垫（此处是输送异氟醚软管连接的地方）。
   3. 用胶水固定头部稳定部件（见图3F）。
   4. 擦掉多余的胶水，并对所有插入的部件保持轻微压力以牢固固定（见图3F）。
3. 连接夹调整
   1. 为减少锁开机构时的不适，确保用15C手术刀柄（3号15C刀片）将外侧所有方形/锋利边缘（图4A）略微斜切，呈45°角。
   2. 为确保锁具机构与绑带夹紧密配合，使用15C手术刀将固定锁内圆角（图4B-F）对齐。
      注意：这样锁就能完全贴合绑带，只需做些微调。
      1. 使用3D打印裁剪工具或15C手术刀，去除上下边缘残留的“闪光”，即使大部分支撑物已移除，并以45°角度略微斜角边缘（类似第一步中对绑扎锁的斜角），以确保锁紧贴合。
         注意：不要去除太多材料，只去除足够让锁能无阻力滑动。
   3. 如果太细，应修剪每个尖端的长度，直到截面较厚（至少0.5毫米厚），确保尖端间留有足够间隙，避免绑扎时压到腭部。确保切割后尖端至少有3毫米长（图5A，标注为“CUT”）。
   4. 在固定器尖端，去除工具打印时“支撑”上的闪光板，确保尖端侧面平整（图5B，箭头）。
   5. 在每个尖端侧面以45°角切下一块“切片”，以便将结扎绳装载到上面，同时软化边缘以防止软组织受到创伤（见图5C，箭头指示）。
   6. 确保每个结绳套的尖端都有一个“V”形缺口，丝线结绳可以安放其中。如果在2.3.6步中因为初始打印的笔尖太细而被移除，请在打印时细化或复现。
      1. 如果看到这个“V”形缺口，将绑扎器放在一个平面上，两端都与桌面平行，轻轻将一把15C手术刀刃插入缺口底部，轻轻左右摇晃刀片，使刀刃边缘保持在“V”字底部，刀刃侧面接触“V”形顶壁。刀片位于缺口底部时，非常小心地将刀片倾斜向刀尖外表面，重复此动作以细化外缘“V”形缺口底部，这样缝线更容易引导到位。
         注意：这种摇晃动作在耗材中产生恰到好处的运动，使其移开并精细缺口，同时去除过多材料。
      2. 如果 看不到 这个“V”形缺口，将夹子放在平面上，两个尖端垂直于桌面。沿着结扎夹的两个尖端直视下方，将一把15C的手术刀刀片放在刀尖中间，然后一个有意识的动作，做一个浅切口，形成最终形成“V”形缺口的起点。
         注意：通常分别对每个刀尖进行此动作，比同时将刀刃放在两个刀尖的正确位置更为简单。
      3. 如有需要，重复步骤2.3.7.2，确保手术刀刃始终回到刀尖中间的同一位置。
         注意：如果刀刃没有被带回同一位置，会进行多次切割，导致线材层在这些区域开始分离，可能降低工具性能。
         注意：“V”形缺口的深度必须定期用绑好的丝线绑扎来测试，以判断结扎是否牢固或不断滑落（可能表明需要进一步细化）。夹具必须印刷时缺口朝下贴在打印平台上，且连接夹锁的方向是较宽的开口朝下接触打印板。同样，支撑材料可以设置为仅触碰构建平台。
4. 连接夹组装完成
   注意：改装完成后，组装绑带夹，检查以下内容：
   1. 当结绳被锁定时，确保锁将线头夹住（图 6A 中箭头指向的方向未见，但 图6B中可见）在锁的顶部或底部（如果可能，两者都行，但可能难以实现）。
      注意：这种摩擦力能确保结绳不会滑脱。
   2. 在将结绳穿入结绳夹的凹槽时，如果结绳一直从结绳尖端滑落，可以加深槽口或将其延伸到结绳尖端外侧，形成一个“轨道”，线会停留在其中。
   3. 从结夹正面观察时，检查两个结是否居中（图6C）和水平（ 图6D中的直线）;如果不行，那么一个沟槽比另一个更深。
   4. 检查结扎是否刚好在缺口内，且没有太深;否则，结扎器尖端接触软组织并造成创伤的风险增加。
   5. 使用牙科探针（图6E），确认当轻柔的力量施加于结节之间时，结绳会弹回原位而不滑动（这模拟了结扎时所承受的力量）。

3. 连接的放置

注意：无论是否添加人类牙周病原体，结扎物都可能置于小鼠牙齿^之间。对结扎剂微生物组成的时间依赖分析（未添加人类细菌）显示，牙周炎发展期间微生物群发生变化（菌群失调）¹²。因此不建议进行结扎置换，因为这可能会影响结果的复现性。是否将细菌种类与连接结合，取决于具体研究中所涉及的问题。由于预计结^扎量约为10-15%，结扎会双侧放置在单只小鼠体内。这种方法最大限度地减少了实验中小鼠的损失。

1. 使用吸入异氟醚麻醉小鼠后，将麻醉小鼠置于小鼠牙科床上，背部贴着床，鼻子靠近鼻锥。
   注意：小鼠应使用4%（体积/容量）异氟醚麻醉。异氟醚蒸发器和氧气通过0.2微米空气过滤器过滤。小鼠完全麻醉并放入小鼠牙齿床后，应保持鼻锥中1.5%-2.5%的流量。小鼠通过不自主的身体动作和呼吸速率（~每分钟55-65次呼吸）来监测。对于结扎性牙周炎诱发的小鼠，无需使用止痛药，因为这是一种非侵入性、非手术的操作，类似于给人类牙齿使用牙线。结扎的放置预计会给小鼠带来非常轻微的不适（主要是由于两颗牙齿间细菌积累），但不应需要使用镇痛药。由专业人员进行结扎后，预计不会有并发症。
2. 用橡皮筋固定老鼠的头部并张开嘴巴。
   注意：下颌门牙周围的带子也用来收回舌头，张力是被动的，用来张开下颌而不拉扯下颌。当光源以一定角度照射以防止阴影遮挡视野时，磨牙的可视化会更加容易。小鼠牙科床专为简化的结扎诱发牙周炎小鼠模型设计。小鼠鼻子与锥形体之间的距离是允许小鼠在实验过程中进行小动作的必要条件。鼠标的这种移动可以合理监控操作者使用绑带夹时的手部动作，并控制绑扎时所用的力量。每只鼠标的绑扎方式大约需要5-10分钟。动物实验应在通风良好的罩内进行
3. 要将连索固定在右侧，右手握住夹带，左手握探针。
   注意：如果结的结不在两端之间，而是更靠近一端，那么结绳可能更适合固定在特定一侧。例如，如果结靠近绑带夹的右端，那么该结可能更容易固定在右侧。
4. 轻轻将探针尖端放在腭侧第一和第二磨牙的邻近接触处下方。
   1. 让探针尖先接触牙齿，然后滑下并靠在牙龈上，以避免损伤软组织;正确定位后，将探险手柄保持水平角度。
   2. 注意探测器的哪一端用于放置于右侧，哪一端用于左侧。确保探针钩尖向上插入近端接触区，同时让柄的弯曲横跨对侧，以稳定头部免受放置时的反作用力。
5. 使用结扎夹水平角度，先将结扎夹置于第二和第三磨牙的近端接触上方，将结扎带边缘顶向脸颊以移动，然后将结扎夹移至第一和第二磨牙的近端接触处。
   注意：此步骤有助于确保口腔黏膜不会被夹在结扎处和牙齿之间，从而干扰牙齿的放置。
6. 一旦结扎绳固定在第一和第二磨牙的近端接触处，将结扎夹的手柄旋转至45°，并结合轻柔摇晃和滑动，将结扎带推入接触点。
7. 剪断多余的线：
   1. 用细针镊子夹住右侧结上多余的线，将线向左拉过牙齿，用稍微打开的剪刀将剪刀沿线滑下，直到距离结约1.5毫米再剪。
      注意：这有助于减少在减少多余部分时意外黏膜损伤的可能性。
   2. 对另一个结重复上述操作，方向反过来。
8. 按照3.3版本的步骤进行镜像。到3.7.2。当将结扎绳固定在口腔的另一侧时。
   注意：建议在牺牲时采集结扎物，因为不同实验条件可能改变菌群转移¹²。为便于采集，将小鼠放入小鼠齿床，切除结扎结之一，随后用镊子轻柔地在近端间移除。在采集结扎过程中使用小鼠牙科床，有助于小鼠的适当稳定性和对结扎部位的便捷性。

4. 骨破坏量化

1. μCT分析
   1. 打开软件，点击 “文件|”导入图片......
   2. 点击弹窗菜单中的 “浏览” ，进入包含 Dicom 文件的文件夹进行一次扫描，然后选择第一个文件。
   3. 点击 “检查 ”以查找并选择文件夹内属于同一扫描样本的其他文件。点击 确定。
   4. 图片加载开始后，点击 可视化 和 等值面。
   5. 将 图像阈 值改为 5000 ，表面 质量因子（%） 改为 55。
   6. 勾选标有 “启用图像平滑 ”和 “带有当前投资回报率的裁剪表面 ”的框，然后点击 “更新”。
   7. 通过右键点击底部的窗口/关卡（图7A）并点击编辑窗口/关卡属性来调整关卡属性。选择一个标准的骨密度值。遵循此方案，使用2000英尺，但根据样本的骨密度调整，并在所有测量中保持恒定。
   8. 操控飞机：
      1. 使用键盘快捷键I /J/K隐藏/显示 三种不同的飞机。
      2. 右键点击并移动光标进行放大和缩小。
      3. 按 Shift 键，然后左键点击平移。
      4. 点击 切片 来移动和旋转平面。
      5. 点击平面中心可以前后移动平面，或者将光标放在目标平面中心，然后用上下方向键逐片移动平面。
      6. 点击平面的边缘，绕着平面中心与该边平行的线旋转。
      7. 点击平面的角落以绕平面旋转。
   9. 将 z 轴（屏幕顶部的蓝色面板——z 切片）调整方向，使三颗牙齿的表面/形状同时（或尽可能接近）可见（图 7B）。
   10. 滚动浏览同一平面（屏幕Z切片顶部的蓝色窗格），使^{第一和第二磨牙}的牙根清晰可见（图7C）。尽量选择一个根部足够远的地方，这样周围的解剖结构都能清晰看到，同时也让管道看起来清晰且直线。
       注意：可能需要旋转平面以实现运河的垂直方向。
   11. 将x轴（z切片面板中的垂直绿色线）对齐于^{第一和第二磨牙}的颊根（尽量通过每根/管的中心部分对齐;否则，通过第一^磨牙的颊根和^第二磨牙的隔颚根对齐）（图7D）。
   12. 以x切片的方向为参照，判断y切片（x切片面板中的垂直蓝线）的对齐。
       1. 将Y切片对齐，使其垂直平行穿过x切片面板中第一颗臼齿的根部（见图7E）。旋转平面使根线垂直方向。注意蓝线穿过根部中间。
          注意：在骨质流失区域（本模型预期），齿槽脊可能存在缺陷;因此，必须估计牙根的中线，因为周围的骨头可能无法理想地定义牙槽的中部。
   13. 在Y切片面板中，测量牙骨釉质连接处（CEJ）到牙槽骨嵴（ABC）的距离，方法是将光标置于沟槽最深处的CEJ点并按 1，然后将光标放在ABC最近的点并按 2 ，如图7F所示。第一个^点用 蓝色箭头表示，第二个点用绿色箭头表示。
       1. 如果箭头直到两个点都选中后才显示，请将箭头悬停在目标区域上，然后按键盘上的数字键，因为单纯点击鼠标无法正常使用。
       2. 如果CEJ难以确定，使用上下方向键滚动浏览相邻切片以确认其位置。
       3. 如果“最近点”难以确定，测量ABC的多个点以确认测量变化极小或无变化。
          注意：要确认测量正确，必须看到x和z切片在目标根上相交，并可通过隐藏平面在三维视图中目视确认测量结果（见图7F）。
2. Rankl/Opg和Rankl/Rank的龈发育表达量化
   1. 如前所述采集牙龈组织⁹.
      注意：最佳的RNA提取结果是利用新鲜组织样本获得，RNA纯化必须尽快进行。
   2. 使用参考试剂盒和陶瓷珠通过打珠提取牙龈组织RNA。按照试剂盒上的说明，将样品保存在-80 °C，直到qRT-PCR分析。

结果

图 1A展示了WT雌雄小鼠基线（健康状态）及结扎后9天线性牙槽骨测量的代表性数据分析。度数计算显示，如果主要结果是通过μCT测量的线性骨水平，则需要总共10只小鼠（每组4-5只）来检测这些组间的差异（见图1B）。然而，临床前研究的幂计算要求两组小鼠均患牙周炎，但其中一组接受治疗干预（见图1C）。此类研究所需的小鼠数量较多，每组19-31只（见图1D）。临床前研究中所需动物数量较多主要原因有二：1）虽然两组均诱发疾病，但对一组实施实验干预，增加结果的方差并影响可重复性;2）

将齿槽骨测量数据与骨质破细胞生成主控三联体Rank-Rankl-Opg²的信号特征整合，可以为驱动骨骼调节的机制提供重要见解。为确认实验药物VX-765（casp...

讨论

本研究提供了对之前介绍的简化结扎诱发牙周炎小鼠模型方案的深入信息和详细的逐步指导，¹⁰。本文中包含的细节极大地影响可重复性，且得到了团队对该特定结扎诱发牙周炎小鼠模型11,12,13,18,19,21的经验支持。书中提供了研究设计、开发和组装3D打印工具的具体细节描述，以及量化骨骼破坏的分步指南。预计此处所述信息将促进并简化简化结扎诱导牙周炎小鼠模型的使用，作为未来治疗干预开发中具有成本效益的临床前模型。

第¹¹ 组开发3D打印材...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
刀锋	英特格拉	4-315C	15C刀片
陶瓷珠	VWR	10158-608	0.5 mL x 1.4 mm 陶瓷珠
胶水/树脂材料	大猩猩胶水公司	8401519
连字夹（带缺口）	北卡大学教堂山大学BeAM设计中心设施核心	不适用	118.01毫米 x 13毫米 x 13.74毫米
勒发夹锁	北卡大学教堂山大学BeAM设计中心设施核心	不适用	17.5毫米 x 14.57毫米 x 17.8毫米
Lulzbot mini v1.0 3D打印机	Lulzbot（法戈增材制造设备3D有限责任公司）	不适用	Aleph Objects，Lulzbot Mini v1.0 型号
MicroView 软件	视差创新	2.5.0-3139	用于骨骼测量的软件
鼠标牙科床（带缺口）	北卡大学教堂山大学BeAM设计中心设施核心	不适用	103.86毫米 x 196.85毫米 x 50.99毫米
鼠标牙科床顶	北卡大学教堂山大学BeAM设计中心设施核心	不适用	99.8毫米 x 77毫米 x 21.5毫米
聚乳酸（PLA）丝状物	逐字逐字	55259	3.0毫米PLA
Rapidpure RNA 组织套件	MP生物医学	112721050
手术刀柄	巴德-帕克	371030	15C手术刀柄
缝线丝	Roboz 外科器械	SUT-15-1
Taqman qPCR引物	赛莫飞舍尔	Rank（Mm00437135_ m1）、Rankl（Mm00441906_ m1）、Opg（Mm00435452_ m1）、Gapdh（Mm99999915_g 1）
VX-765	InvivoGen，美国圣地亚哥	#inh-VX765-1	用于宿主调节的Caspase-1抑制剂