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用于评估高氧对人类新生儿气道上皮细胞影响的转化型三维细胞培养模型

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DOI：

10.3791/65913

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2024年7月12日

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1Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Center for Pregnancy and Newborn Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Medicine, Section of Pulmonary, Critical Care & Sleep Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

本文内容

摘要

我们描述了一种利用新生气管气道上皮细胞（nTAEC）建立气液界面（ALI）培养模型的方案，并进行具有生理相关性的高氧暴露，以研究大气诱导的氧化应激对来自发育中新生儿气道表面上皮细胞的影响。

摘要

早产儿气道上皮持续暴露于环境应激因素中。在患有肺部疾病的新生儿中，其中一种应激因素包括氧气（O₂）2）高于环境大气的张力——称为高氧（hyperoxia）>21% O₂2). 高氧对气道的影响取决于多种因素，包括气道的发育阶段、高氧程度以及暴露持续时间，不同的暴露条件可能导致独特的表型。尽管已有大量研究关注高氧对新生儿肺泡化及气道高反应性的影响，但关于高氧对人类新生儿气道上皮细胞短期和长期潜在影响的研究仍十分有限。造成这一现状的主要原因是缺乏有效的 体外 用于研究人类新生儿气道上皮发育与功能的模型。本文描述了一种利用人类新生儿气管吸出物分离和扩增新生儿气道上皮细胞（nTAECs）的方法，并将这些细胞在气液界面（ALI）培养系统中进行培养。我们证明，nTAECs在ALI培养中可形成成熟的极化单层细胞，并发生黏液纤毛分化。此外，我们介绍了一种使用专用培养箱在ALI培养条件下对细胞单层施加中度高氧暴露的方法。同时，我们描述了一种通过荧光定量检测ALI培养中高氧暴露后细胞氧化应激水平的检测方法，结果证实中度高氧暴露可诱导细胞氧化应激，但不会引起显著的细胞膜损伤或凋亡。该模型有望用于模拟新生儿重症监护病房（NICU）中新生儿气道所经历的临床相关高氧暴露，并可用于研究O₂暴露的短期与长期影响。2 关于新生儿气道上皮编程的研究。利用该模型开展的研究可用于探索减轻发育中气道早期氧化损伤的方法，此类损伤与早产儿日后发生长期气道疾病相关。

引言

治疗性氧气（O₂）2是新生儿重症监护室（NICU）中最常用的治疗方法之一1因此，高氧暴露（>21% O₂2高氧（hyperoxia）是新生儿无论是否患有显著肺部疾病均常遇到的一种大气应激因素。肺组织对高氧的反应可能因暴露强度和/或持续时间的不同，以及肺部解剖位置、细胞类型和肺发育阶段的差异而有所变化。2,3,4,5,6新生儿高氧性肺损伤的大部分研究集中于高氧暴露对生后肺泡化过程的影响，以模拟支气管肺发育不良（BPD）——这是早产儿中最常见的慢性肺部疾病6,7,8,9,10,11BPD 严重程度根据呼吸支持的量进行分类，以及 O2 妊娠后36周所需9大多数患有支气管肺发育不良（BPD）的婴儿随着肺部持续发育，临床状况会随时间逐渐改善，大部分婴儿在出生后一岁前即可脱离呼吸支持 第一个生日12,13无论出生后支气管肺发育不良（BPD）的严重程度如何，早产儿远期均存在显著的并发症风险，包括学龄前喘息风险增加5倍、哮喘、儿童期反复呼吸道感染以及早发性慢性阻塞性肺疾病。12,14,15,16,17,18,19高氧对早产儿长期呼吸道疾病及肺部感染的影响已通过以下方法进行研究 体外 和 体内 动物模型20,21,22,23,24然而，大多数这些模型都聚焦于间充质组织、肺泡上皮和气道平滑肌的作用25,26,27,28.

气道表面上皮覆盖整个呼吸系统的通路，从气管延伸至终末细支气管，终止于肺泡水平之前29气道基底细胞是气道上皮中的主要干细胞，具有分化为所有成熟气道上皮细胞谱系的能力，包括纤毛细胞和分泌细胞（club细胞：非黏液分泌型，以及杯状细胞：黏液分泌型）29,30,31,32在新生儿高氧性肺损伤相关研究中，细胞培养实验主要采用成人来源的人或小鼠肿瘤细胞系33,34此外，大多数 体外 实验采用的是浸没式培养系统，该系统无法使细胞分化形成类似气道的黏液纤毛上皮 体内 人类气道上皮35因此，关于高氧暴露对人类新生儿发育中气道上皮细胞所致肺损伤的影响，目前仍存在知识空白。其中一个原因是缺乏可用于研究大气暴露对人类新生儿气道上皮影响的转化模型。生命早期的高氧性肺损伤可导致长期的气道疾病和感染风险增加，对早产儿出院后的健康产生深远影响。14,36,37在患有重度支气管肺发育不良且未存活的婴儿中，气道表面上皮存在明显异常，包括杯状细胞增生和纤毛发育紊乱，提示黏液纤毛清除功能异常以及上皮增厚导致气道管径减小38近十年来，人们对在气液界面（ALI）培养原代气道上皮细胞以研究出生后气道上皮发育的兴趣日益增加39,40,41,42然而，新生儿气道上皮细胞的气液界面模型尚未被应用于大气氧化还原扰动模型（如高氧暴露）的研究中。

采用一种先前已发表的方法39我们利用从NICU中插管新生儿获得的新生儿气管吸出物样本，成功分离并扩增了原代新生儿气管气道上皮细胞（nTAECs）。如先前所述，我们采用Rho、Smad、糖原合成酶激酶（GSK3）和雷帕霉素哺乳动物靶蛋白（mTOR）信号通路的抑制剂，以提高这些细胞的扩增能力并延缓其衰老39,42，可实现nTAECs的高效扩增及后续传代。本方案描述了利用nTAECs建立三维气液界面（ALI）培养体系，并对nTAEC单层细胞进行高氧暴露的方法。在ALI培养的前7天（ALI第0至7天）使用Rho和Smad抑制剂，此后在ALI分化的剩余时间内从分化培养基中去除这些抑制剂。ALI培养的气道上皮细胞单层的顶面持续暴露于环境中43，可用于大气扰动研究，并高度模拟暴露于高氧环境下的发育中新生儿气道的病理生物学过程 体内. O的浓度2 在以往针对新生小鼠高氧性肺损伤的细胞培养研究中（无论使用永生化细胞或原代细胞），所采用的氧浓度差异显著（范围从40%至95%），暴露时间亦不相同（范围从15分钟至10天）36,44,45,46,47在本研究中，将ALI细胞单层暴露于60% O₂环境中2 从ALI第7天到第14天（在去除分化培养基中的Rho/Smad抑制剂后）持续7天。高氧暴露是在黏液纤毛分化的早期至中期（ALI第7天至第14天）进行的，而非在完全分化的成熟上皮阶段，因此模拟了 在体 早产儿气道上皮发育。这种暴露策略可最大限度地降低急性O2 毒性（高浓度O预期会出现）2）同时仍在生理相关范围内诱导氧化应激，类似于早产人类新生儿从相对低氧的宫内环境向高氧外界环境过渡的关键阶段。

方案

新生儿气管吸出物样本仅在获得家长知情同意后采集，且用于采集、运输和储存的方案已获俄克拉荷马大学健康科学中心机构审查委员会（IRB 14377）批准。

1. nTAEC 的分离、传代及气液界面培养的准备工作

  1. 培养基制备
    1. 含抑制剂的支气管上皮气道培养基（BLEAM-I）：通过向500 mL（1瓶，4 °C保存）支气管上皮气道培养基（BLEAM）中添加以下成分制备：1.25 mL HLL添加剂（500 µg/mL人血清白蛋白，0.6 µM亚油酸，0.6 µg/mL卵磷脂），15 mL L-谷氨酰胺（6 mM），2 mL Extract P（0.4%，牛垂体提取物），5 mL TM1（1 µM肾上腺素，5 µg/mL转铁蛋白，10 nM三碘甲腺原氨酸，0.1 µg/mL氢化可的松，5 ng/mL表皮生长因子（EGF），5 ng/mL胰岛素），1 mL抗生素溶液（Normocin，0.1 mg/mL）。为防止原代细胞衰老并提高扩增效率，按先前所述39加入以下生长因子抑制剂：Y-27632（Rho相关蛋白激酶或ROCK抑制剂），终浓度为5 µM；A83-01（抑制Smad信号通路），终浓度为1 µM；CHIR 99021（糖原合成酶激酶-3或GSK3抑制剂），终浓度为0.4 µM；雷帕霉素（雷帕霉素分子靶点或mTOR抑制剂），终浓度为5 nM。使用0.22 µm孔径滤器过滤培养基。培养基成分列表见表1。
    2. 人支气管/气管上皮细胞（HBTEC）气液界面（ALI）培养基：将一瓶HBTEC培养基在37 °C解冻，加入1 mL抗生素溶液（Normocin，0.1 mg/mL），混匀后使用0.22 µm孔径滤器过滤。
    3. 含抑制剂的HBTEC培养基（HBTEC-I）：按上述方法制备HBTEC培养基。在过滤前加入以下抑制剂：Y-27632，终浓度为5 µM；A83-01，终浓度为0.5 µM。使用0.22 µm孔径滤器过滤。
      注意：BLEAM-I、HBTEC和HBTEC-I培养基应于4 °C避光（用铝箔包裹）保存，标注日期和标签，仅在使用前将所需分装量预热（有效期为30天）。
    4. HEPES/FBS：向500 mL HEPES缓冲盐溶液中加入88 mL FBS（终浓度为15%），混匀后使用0.22 µm孔径滤器过滤，并于4 °C保存，标注日期和标签。
      注意：使用前至少30分钟，将BLEAM、HEPES-FBS和胰蛋白酶-EDTA预热至37 °C。
  2. 使用804G条件培养基包被培养瓶和气液界面（ALI）细胞培养小室
    1. 按先前所述方法39制备804G细胞（大鼠膀胱上皮细胞系）基质条件培养基。
    2. 在37 °C、5% CO2培养箱中，使用804G条件培养基包被细胞培养瓶和细胞培养小室，至少孵育4小时。不同规格培养瓶和细胞培养小室所需包被液体积见表2。

2. nTAECs 的分离与扩增及后续气液界面培养的准备

  1. 在对插管新生儿进行常规气管插管吸痰时，采集新鲜的气管吸出物（约1 mL），并收集至痰液收集器中。若吸出物体积不足以进入痰液收集器，可用1–3 mL无菌生理盐水冲洗吸痰导管。
  2. 将样本标记，并置于冰上装入生物危害袋中保存。
    注意：样品可在冰上4 °C保存最多24小时。然而，新鲜样品的得率更高。
  3. 将样本从新生儿重症监护室运送至实验室。 用804G条件培养基包被T25培养瓶，并在气管吸出物运送至实验室的同时做好接种样本的准备。
  4. 从生物危害袋中取出黏液捕集器，用70%乙醇彻底清洁其外表面，以避免任何污染。在无菌细胞培养罩内小心打开黏液捕集器的盖子。
  5. 用无菌 PBS 将气管吸出物样本稀释至 5 mL（以稀释黏液），并将全部内容物转移至 50 mL 锥形管中。
  6. 将离心管在 250 x g，20 °C–23 °C 下孵育 5 分钟，弃去上清液（包括黏液）。
    注意：除非另有说明，所有离心步骤均在250 x g、20 °C–23 °C条件下进行，持续5分钟。
  7. 将沉淀重悬于5 mL BLEAM-I中。
  8. 从培养箱中取出T25培养瓶，在接种样品前弃去804G条件培养基。
  9. 将样品接种至T25培养瓶中，置于37 °C、5% CO₂培养箱内培养2 （这将被称为传代0或P0）。
  10. 接种后24小时用BLEAM-I更换培养基，以洗去未贴壁的细胞，之后每48小时更换一次。
    注意：处理气管吸出物样本并在BLEAM-I培养基中孵育后，约在接种后7-10天出现立方状细胞。接种后约3周，细胞生长密集，需进行胰蛋白酶消化以进行后续传代、扩增和冻存。早期传代（P1 - P2）细胞应置于冻存管中（2.5 × 10⁶）6 每冻存管含500 µL冻存液，保存约相应数量的细胞，置于液氮中长期保存。
  11. 从液氮中快速解冻冻存细胞，在37 °C水浴中复苏后，将细胞悬液转移至含有BLEAM-I的适当大小的无菌离心管中。
  12. 使用台盼蓝染色法并结合自动或手动细胞计数仪，按照先前所述方法对细胞进行计数，以确定总细胞数和活细胞数。48用适量的BLEAM-I稀释细胞悬液，使最终浓度为2.1 × 106 T75培养瓶中15 mL细胞悬液的细胞
    注意：对于 T25 培养瓶，0.7 x 106 通常使用5 mL细胞悬液中的细胞进行接种。
  13. 将15 mL细胞悬液转移至T75培养瓶中，于37 °C、5% CO₂条件下培养过夜2.
  14. 次日早晨，更换为新鲜的BLEAM-I培养基，之后每2天更换一次新鲜的BLEAM-I培养基。当细胞生长至约80%–90%融合度时，即可进行胰蛋白酶消化，用于气液界面（ALI）培养。
  15. 向细胞单层加入5 mL胰蛋白酶-EDTA（T75）。
    注意：请使用新鲜的胰蛋白酶，避免使用多次加热的胰蛋白酶。
  16. 在培养箱中于 37 °C 孵育烧瓶 5 分钟。然后轻拍烧瓶侧面 8 至 10 次，以使细胞脱落。在显微镜下观察，确认胰蛋白酶消化后细胞已脱落。如果 >50%的细胞仍贴壁于培养瓶中，用PBS洗涤2次，缩短胰蛋白酶消化时间为2-3分钟，重复消化步骤。
  17. 用15 mL HEPES-FBS终止反应，吹打混匀4–5次。将细胞转移至适当大小的无菌离心管中，在250 x g条件下离心 g 离心5分钟以收集细胞。
  18. 离心后，小心吸除上清液。用1 mL BLEAM-I重悬细胞沉淀，轻柔吹打5至10次使其充分溶解。
  19. 计数细胞以确定总细胞数和活细胞数。用适当体积的BLEAM-I稀释细胞悬液，使最终浓度为1 x 105 每100 µl细胞悬液中的活细胞数

3. nTAECs 的气液界面培养

注意：细胞培养小室应使用804G条件培养基包被，并在下一步操作前于37 °C、5% CO2条件下孵育至少4小时（见步骤1.2）。

  1. 从培养箱中取出含有细胞培养小室的24孔细胞培养板，弃去804G条件培养基。
  2. 向每个气液界面（ALI）孔的基底侧（下室）加入1 mL BLEAM-I培养基，向ALI细胞培养小室的顶侧腔室（上室）加入100 µL细胞悬液（1 × 105 个细胞），并在37 °C、5% CO2条件下培养细胞。此阶段定义为ALI第-2天。
  3. 次日，更换基底侧（1 mL）和顶侧（100 µL）腔室中的培养基为新鲜BLEAM-I培养基。更换顶侧腔室培养基时，注意不要扰动细胞单层。此阶段定义为ALI第-1天。
  4. 次日，移除基底侧和顶侧腔室中的培养基。
    注：在浸没培养条件下，细胞在细胞培养膜上形成融合单层约需2天。此时可建立气液界面培养。
  5. 向基底侧腔室加入1 mL HBTEC-I培养基，顶侧腔室则不加培养基，使其暴露于空气中。此阶段定义为ALI第0天。
  6. 从ALI第0天至第6天，每48小时更换一次基底侧腔室中的HBTEC-I培养基（1 mL）。从ALI第7天起，更换为常规HBTEC培养基（不含抑制剂），并持续培养至预定收获时间点。
    注：在ALI培养的前7天内，基底侧腔室的培养基可能渗漏至顶侧腔室。需每天小心吸除该渗漏液体，以维持细胞层的健康并促进其分化。
  7. 在不同时间点收获细胞、细胞培养小室及基底侧培养基，用于分子生物学技术、检测与分析。
    1. 本实验方案中，在ALI第0、7和28天收获细胞，进行上皮细胞分化标志物的qPCR基因表达分析（按试剂盒标准操作流程）。在ALI第0、7、14和28天收获细胞培养小室，用于屏障功能检测（方法见下文）。
    2. 在ALI第0和28天，使用甲醛固定的细胞培养小室，以上皮细胞分化标志物进行免疫荧光染色（采用先前发表的实验方案）49。在ALI第14天，收获基底侧培养基用于乳酸脱氢酶（LDH）释放检测（按试剂盒标准操作流程），收获细胞裂解液用于氧化应激标志物的qPCR分析及caspase-3和cleaved caspase-3抗体的免疫印迹分析（按试剂盒标准操作流程），并收获细胞培养小室用于氧化应激检测（方法见下文）。

4. 在 ALI 分化期间检测屏障功能

  1. 测量跨上皮电阻（TEER）
    注意：在气液界面（ALI）分化过程中，使用上皮细胞伏特/欧姆计（EVOM）测量跨上皮电阻，以评估细胞层的完整性50。
    1. 在测量测试滤膜的电阻值之前，使用经804G条件化培养基包被但无细胞的细胞培养插件（即无细胞）测量背景电阻值（单位：欧姆，Ω）
    2. 从测试滤膜的电阻值中减去背景电阻值，并将差值乘以细胞生长表面积，以计算每个测试滤膜的TEER值。
      TEER = (ΩT - ΩB) X C
      TEER = 跨上皮电阻（Ω·cm2）
      ΩT = 测试滤膜电阻值（Ω）
      ΩB = 背景电阻值（Ω）
      C = 细胞生长表面积（cm2）
      注意：用于TEER测量的细胞培养插件随后用10%缓冲福尔马林固定，并立即用于免疫荧光染色和荧光显微镜观察（方法见下文），或在4 °C下保存以备后续染色使用。
  2. 异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC-葡聚糖）上皮通透性检测
    注意：在气液界面（ALI）分化过程中，采用两种不同分子量的FITC-葡聚糖（10 kD和20 kD）进行上皮通透性检测。
    1. 配制FITC-葡聚糖工作液（1 mg/mL）：称取5 mg FITC，溶于1 mL DMSO中（终浓度为5 mg/mL）。将该5 mg/mL储备液用预热至37 °C的HBTEC培养基稀释至1 mg/mL。避光保存。
    2. 将含细胞的测试滤膜转移至新的12孔板中，并在基底外侧加入1 mL HBTEC培养基。
    3. 吸除顶端室中的培养基（如有），加入250 µL FITC-葡聚糖工作液。室温避光孵育60分钟。
    4. 通过将含FITC-葡聚糖工作液的测试滤膜从12孔板中取出，终止FITC-葡聚糖检测。
    5. 从12孔板中收集基底外侧培养基至1.5 mL微量离心管中，并涡旋混匀。
    6. 将每管中的100 µL等分试样以三复孔形式转移至96孔透明底黑色聚苯乙烯微孔板中。另取一些孔加入100 µL HBTEC培养基作为阴性对照，用于测定背景荧光。
    7. 使用分光光度计测定荧光强度，激发波长为490 nm，发射波长为520 nm。
    8. 从测试滤膜的荧光值中减去平均背景荧光值，得到校正后的荧光值，并以ALI第0天的校正荧光值为基准，将结果表示为百分比（针对FITC-葡聚糖10 kD和20 kD分别计算）。

5. 使用TriGas培养箱进行高氧暴露

  1. 在气液界面培养第7天，根据实验和取材需求，确定需置于高氧环境中的细胞培养小室数量。
  2. 将三气培养箱的O2浓度设定为60% O2。通常需要约30–45分钟，O2浓度才能达到60%。
  3. 当O2浓度稳定在60%后，将分配至高氧组的24孔细胞培养板及其细胞培养小室放入培养箱内，并关闭培养箱门。
    注意：此步骤应尽可能迅速完成，以防止培养箱内O2浓度显著下降。
  4. 对暴露于高氧环境的细胞培养小室更换培养基，换液时间表应与对照组（暴露于21% O2）保持一致。每天检查细胞培养小室是否有培养基渗漏，并轻轻抽吸进入细胞培养腔室的渗漏液体。
  5. 持续进行7天高氧暴露（气液界面培养第7天至第14天）。高氧暴露结束后，在气液界面培养第14天收获细胞或利用细胞培养小室进行相关检测。

6. 氧化应激检测以评估高氧暴露的影响

注意：我们使用 CM-H2DCFDA 检测试剂盒，在 O2 暴露后的 ALI 第 14 天测定细胞培养小室中荧光强度，作为氧化应激的指标。H2DCFDA 是 2′,7′-二氯荧光素（DCF）的化学还原和乙酰化形式，是一种可穿透活细胞的活性氧（ROS）指示剂。CM-H2DCFDA 是 H2DCFDA 的巯基反应性氯甲基衍生物，可促进与细胞内组分的进一步共价结合，从而延长染料在细胞内的滞留时间。这些分子本身无荧光，只有当细胞内酯酶去除乙酰基团并在细胞内发生氧化反应后才产生荧光51。细胞内氧化反应完成后，所产生的荧光强度增加可通过荧光显微镜进行检测，作为细胞氧化应激的替代性指标52。该试剂对光和空气敏感，因此需尽可能避光保存并保持密闭。

  1. CM-H2DCFDA 检测试剂溶液的制备： 每瓶含有 50 µg 粉末状试剂染料。为配制 1 mM 储存液，向瓶中加入 80 µL 无菌 DMSO，用移液器充分混匀，并轻轻涡旋。为在细胞培养小室中达到染料终浓度 1 µM，每 100 µL PBS 中加入 0.1 µL 的 1 mM 储存液（例如，为 6 个细胞培养小室配制，向 600 µL PBS 中加入 0.6 µL 储存液）。
    注意：染料的终浓度可在 1–5 µM 之间调整。需根据每种培养条件优化剂量。
  2. 向高氧暴露组和常氧暴露组的每个细胞培养小室中各加入 100 µL 的 1 µM 染料溶液。每个处理组至少设一个阴性对照（仅加入 100 µL 不含染料的 PBS）。在 37 °C 避光孵育 30 分钟，用 PBS 洗涤一次。
  3. 载玻片制备：吸除多余 PBS。小心夹住细胞培养小室，用刀片缓慢切下细胞培养膜。在载玻片上滴加 1–2 滴封片液。用平头镊子夹住膜的一角，将细胞面朝下放置于封片液上，盖上盖玻片。去除多余封片液，在室温避光条件下静置晾干 15 分钟。载玻片现已可进行成像。
    注意：载玻片制备及荧光显微镜观察应尽快完成，因荧光强度在 2–3 小时内会显著减弱。
  4. 荧光显微镜观察：使用荧光显微镜，选择 Cy2（花青素-2）通道采集图像。每个细胞培养小室采集三个独立、无重叠区域的图像。
  5. 氧化应激的荧光检测
    注意：使用荧光显微镜图像，通过 ImageJ 软件（https://imagej.nih.gov/ij/）及以下所述流程测定校正后的总细胞荧光强度（CTCF）。CTCF 可作为高氧暴露后细胞培养小室中氧化应激的指标，通过 ImageJ 软件消除背景荧光后进行测定。
    1. 在 ImageJ 中打开显微图像，使用矩形工具选择感兴趣区域。右键单击并选择 添加到 ROI（感兴趣区域）管理器，以保存该选择区域（α）。在所有图像中使用相同的选定区域。
    2. 在 分析 > 设定测量值 中选择测量参数，在设置选项卡中勾选 面积、积分密度和平均灰度值。
    3. 对每张图像，从 ROI 管理器中调用相同的选定区域，选择 分析 > 测量。积分密度值代表所选区域的总荧光强度（Ft）。记录弹出窗口中的测量值。
    4. 为校正每张图像的背景荧光（Fb），使用矩形工具选择一个非荧光区域的小范围区域。对该区域执行 分析 > 测量。平均强度值即为 Fb。记录弹出窗口中的测量值。
    5. 通过将背景读数的平均荧光强度乘以 ROI 的总面积，再从 ROI 的积分密度值中减去该乘积，计算 CTCF。对两组处理组（对照组和高氧组）的所有图像重复此流程。
      CTCF = Ft  - (Fb × α)
      CTCF = 校正后的总细胞荧光强度（A.U.）
      Ft = 总荧光强度
      Fb = 背景荧光强度
      α = 选定区域

结果

为了分离新生儿气管上皮细胞（nTAECs），我们从新生儿重症监护病房（NICU）中接受插管的新生儿收集气管吸出物，并将样本置于冰上运送至实验室进行后续处理（图1A）。将气管吸出物样本接种于气道上皮细胞生长培养基（含Rho/Smad、GSK3和mTOR抑制剂的BLEAM-I）后，7–10天内出现立方状细胞。至第14天，细胞融合度达到50%–60%；接种约21天后，细胞生长密集，需用胰蛋白酶消化以进行后续传代和扩增。这些细胞经连续传代（最多至P3代）后，于液氮中冷冻保存以长期储存。实验所用细胞（≤第3代）随后被复苏用于气液界面（ALI）培养。

当nTAECs在T75培养瓶中于浸没条件下达到约80%-90%融合度时，将其转移至气液界面（ALI）条件下进行培养。我们在ALI培养第0天对nTAEC单层细胞进行了免疫荧光染色，检测基底细胞特异性标志物——细胞角蛋白5（KRT5）53和肿瘤蛋白p63（TP63）54 (图1B)。在ALI第0天，几乎所有细胞均呈KRT5和TP63阳性，提示细胞具有气道基底细胞表型且分化程度极低。建立ALI培养后，使用EVOM仪器测量跨上皮电阻（TEER）(图1C)，结果显示在ALI培养早期阶段（第0至第7天），随着nTAECs开始形成成熟的极化单层细胞，TEER迅速升高，随后在第7天至第28天趋于稳定 (图1D)。此外，采用两种不同分子量的异硫氰酸荧光素标记葡聚糖（FITC-dextran，分别为10 kD和20 kD）评估ALI分化过程中的旁细胞通透性，结果显示随时间推移，荧光信号总体呈逐渐下降趋势 (图1E)。该结果与ALI分化过程中成熟细胞单层的形成一致，表明其对溶质的通透性逐渐降低。

在气液界面（ALI）培养过程中，基底细胞分化为成熟的上皮细胞谱系，包括纤毛细胞、非黏液分泌型的克拉拉细胞（club cells）以及黏液分泌型的杯状细胞39。在ALI培养第0天，对成熟上皮细胞特异性标志物的基因表达分析显示，叉头框蛋白J155（FOXJ1，纤毛细胞标志物）、uteroglobin56（SCGB1A1，克拉拉细胞标志物）和黏蛋白5AC57（MUC5AC，杯状细胞标志物；图2A）的表达极低或几乎无表达，而在后续时间点（ALI第7天和第28天）表达逐渐增加，表明在ALI培养过程中这些细胞向成熟的气道上皮亚型分化。此外，我们在ALI第28天利用成熟上皮细胞特异性标志物进行了免疫荧光染色，并对上皮细胞分化情况进行了定量分析，结果显示乙酰化微管蛋白58（TUBA4A）阳性纤毛细胞约占22%，SCGB1A1阳性克拉拉细胞约占13%，MUC5AC阳性杯状细胞约占3%，其余主要为KRT5阳性基底细胞（约51%）以及其他稀有细胞类型（图2B）。

在气液界面培养的前7天（气液界面培养第0至第7天）使用Rho和Smad抑制剂，随后在气液界面培养的剩余时间内从分化培养基中去除。 (图3A)细胞单层在气液界面培养期间，其顶面暴露于空气中，从而可进行大气扰动研究。细胞单层的高氧暴露实验采用60% O₂进行。2 连续7天从ALI第7天至第14天，使用TriGas培养箱进行培养。对照组置于另一培养箱中，在常氧条件（21% O₂）下维持培养。2)暴露。鉴于未来计划研究长期影响（完成O后1-2周）2 暴露）的O2 暴露对气道上皮发育和再生的影响，必须确保 O2 暴露并未急性导致严重的细胞毒性或细胞膜损伤，不足以显著破坏气液界面（ALI）细胞单层的完整性。为评估细胞膜损伤情况，我们在ALI第14天检测了基底侧培养基中的乳酸脱氢酶（LDH）释放量，结果显示高氧暴露组与常氧对照组之间无显著差异。 (图3B). 为进一步评估O是否具有细胞毒性作用2 足以诱导nTAECs发生凋亡，我们进行了总caspase-3和裂解型caspase-3的免疫印迹检测59 在气液界面第14天，从高氧暴露组和常氧暴露组收集的细胞裂解液中 (图3C)总caspase-3表达水平在两组之间相当，且未检测到裂解型caspase-3的表达，提示7天的60% O₂暴露2 暴露处理在第14天的气液界面培养nTAECs中未诱导细胞凋亡。此外，设置阳性对照组，将nTAECs在淹没条件下过夜孵育，加入浓度递增的星形孢菌素（0.5 µM、1 µM和2 µM），该试剂是一种细胞毒性剂和凋亡诱导剂。通过免疫印迹检测总caspase-3和裂解型caspase-3的表达，证实了细胞凋亡的成功诱导。为检测60% O₂诱导的氧化应激2 暴露后，在气液界面培养14天的nTAEC细胞单层上进行了细胞氧化应激检测，并通过荧光强度测定进行分析 (图3D)高氧暴露导致细胞荧光强度显著增加（通过校正后的总细胞荧光强度，即CTCF计算），与常氧空气暴露的细胞相比，提示细胞氧化应激水平升高。抗氧化基因的表达分析显示，60% O₂2 导致第14天ALI时这些抗氧化基因上调，其中过氧化氢酶、SOD1、SOD2和GPX3显著上调 (图3E).

nTAECs 分离与培养流程、TEER 及 FITC-葡聚糖检测结果、免疫荧光。
图 1：新生儿气管上皮细胞（nTAECs）成功从新生儿气管吸出物中分离，并在气液界面（ALI）条件下培养。（A）通过气管吸出术从插管新生儿中获取的 nTAECs 在浸没条件下传代，随后进行 ALI 培养。（B）在 ALI 培养第 0 天收获细胞，使用气道基底细胞标志物 KRT5（红色）和 TP63（红色）进行免疫荧光染色。细胞核用 DAPI 染成蓝色。比例尺 = 50 µm。（C）使用上皮细胞伏特/欧姆计（EVOM）测量细胞培养小室中的跨上皮电阻（TEER）。（D）在 ALI 分化过程中测量 TEER。数据以均值表示（n=2 名供体，每名供体每个时间点 5–10 个孔）。误差线表示标准误（SEM）。（E）在 ALI 分化过程中进行异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-葡聚糖）跨上皮通透性检测，使用两种不同分子量的 FITC-葡聚糖（10 kD 和 20 kD）。将 FITC-葡聚糖溶液（10 kD 或 20 kD）加入顶端室，细胞培养小室在室温下孵育 60 分钟。使用 96 孔板分光光度法测定基底外侧室培养基中的荧光强度。从测试值中减去背景荧光（HBTEC 培养基）以获得校正后的荧光值（以第 0 天数值的百分比表示）。数据以均值表示（每种分子量的 FITC-葡聚糖，n=2 名供体，每名供体每个时间点 3 个孔）。误差线表示标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。

基因表达分析：ALI培养中的分化标志物；柱状图和细胞染色结果。
图2：新生儿气管上皮细胞（nTAECs）在气液界面（ALI）培养过程中发生黏液纤毛分化。（A）在ALI培养第0、7和28天收集细胞，通过qPCR检测上皮细胞特异性标志物的表达：基底细胞标志物细胞角蛋白5（KRT5）、纤毛细胞标志物叉头框蛋白J1（FOXJ1）、俱乐部细胞标志物泌泌素（SCGB1A1）以及杯状细胞标志物黏蛋白5AC（MUC5AC）。采用δCt法计算各基因的相对表达水平，内参基因为GAPDH。数据以均值表示（n = 3名供体，每名供体每个时间点3个孔）。误差线表示标准误（SEM）。统计分析采用双因素方差分析（two-way ANOVA）结合Tukey事后检验，*p=0.0114，***p=0.0005，***p<0.0001。（B）在ALI培养第28天对基底细胞（KRT5，红色）、纤毛细胞（乙酰化微管蛋白或TUBA4A，绿色）、俱乐部细胞（SCGB1A1，红色）和杯状细胞（MUC5AC，绿色）进行免疫荧光染色，以量化上皮细胞分化情况。细胞核用DAPI染成蓝色。阳性细胞百分比（%）数据以均值表示（n=2名供体，每名供体2个细胞培养插件，每张切片采集6–8个无重叠的图像，每张切片计数不少于3000个细胞）。误差线表示标准误（SEM）。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

ALI 氧化应激研究：nTAECs 暴露于 60% O₂，caspase-3 分析，LDH/氧化应激检测。
图 3：高氧暴露在新生小鼠气管上皮细胞（nTAECs）中诱导细胞氧化应激，但未引起显著的细胞膜损伤或细胞凋亡。 （A）使用 Trigas 培养箱对 nTAECs 进行高氧暴露的实验时间线。在 ALI 第 7 天从分化培养基中去除抑制剂后开始氧气暴露，并持续 7 天（ALI 第 7 天至第 14 天）。（B）在 ALI 第 14 天收集基底外侧培养基，进行乳酸脱氢酶（LDH）释放检测，以评估常氧（对照组）与 60% O2（高氧）暴露组之间的细胞膜损伤情况。数据以单个数据点（校正吸光度）表示，线条表示各组的总体均值，n=3 个供体分别用黑色圆圈、方块和三角形表示，每个供体包含四个孔。采用非配对 t 检验进行统计分析，p=0.6184。（C）在 ALI 第 14 天收集细胞，通过免疫印迹检测细胞凋亡标志物（caspase-3 和切割型 caspase-3），比较常氧组与 O2 暴露组 nTAECs 的反应差异。本实验的阳性对照通过将 nTAECs 在静置培养条件下分别与星形孢菌素（Stau 0.5 µM、1 µM 和 2 µM）或溶剂对照（Veh Ctrl）共孵育过夜建立。随后收集细胞，使用总 caspase-3 和切割型 caspase-3 抗体进行免疫印迹检测。以 α-tubulin 作为内参基因进行密度测定。数据表示为均值（来自 n=2–3 个供体，每个供体一至两个孔）。误差线表示标准误（SEM）。采用非配对 t 检验比较常氧组与 60% O2 组总 caspase-3 表达水平，p=0.4。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）比较 Veh Ctrl 组与 Stau 暴露组中总 caspase-3 和切割型 caspase-3 的表达水平，*p<0.05，***p<0.0005。（D）在 ALI 第 14 天使用 CM-H2DCFDA 检测法评估细胞氧化应激水平，收集常氧组和 O2 暴露组的细胞培养小室。图中显示了常氧（对照）和 60% O2（高氧）暴露细胞培养小室的代表性荧光显微图像。通过计算校正总细胞荧光（CTCF）来比较常氧组与 60% O2 暴露组 nTAECs 的细胞氧化应激水平。CTCF 数据以单个数据点表示，线条表示各组的总体均值，每组包含来自 2 个独立供体的 6–7 张图像（黑色圆圈和方块），每个供体两个孔。采用非配对 t 检验进行统计分析，*p<0.05。比例尺 = 50 µm。（E）在 ALI 第 14 天收集常氧组和高氧暴露组的细胞，进行 qPCR 分析，检测包括过氧化氢酶（catalase）、超氧化物歧化酶 1 和 2（SOD1 和 SOD2）、谷胱甘肽过氧化物酶 1、2 和 3（GPX1、GPX2 和 GPX3）在内的氧化应激相关基因表达。采用 δCt 法计算各基因的相对表达倍数变化，以 18s rRNA 作为内源性对照。数据表示为均值（来自 n=3 个供体，每个供体两个孔）。误差线表示标准误（SEM）。采用非配对 t 检验进行统计分析，*p<0.05，**p=0.006。 请点击此处查看该图的放大版本。

培养基组分添加量终浓度
BLEAM-I
BLEAM 培养基500 mL
HLL 添加剂1.25 mL500 µg/mL 人血清白蛋白
0.6 µM 亚油酸；0.6 µg/mL 卵磷脂
L-谷氨酰胺15 mL6 mM
Extract P2 mL0.4% 牛垂体提取物
TM15 mL1 µM 肾上腺素；5 µg/mL 转铁蛋白
10 nM 三碘甲腺原氨酸；0.1 µg/mL 氢化可的松
5 ng/mL 表皮生长因子 (EGF)
5 ng/mL 胰岛素
Normocin1 mL0.1 mg/mL
Y-27632根据批号可能有所变化5 µM
A83-01根据批号可能有所变化1 µM
CHIR 99021根据批号可能有所变化0.4 µM
Rapamycin根据批号可能有所变化5 nM
HBTEC
HBTEC 培养基500 mL
Normocin1 mL0.1 mg/mL
HBTEC-I
HBTEC 培养基500 mL
Normocin1 mL0.1 mg/mL
Y-27632根据批号可能有所变化5 µM
A83-01根据批号可能有所变化0.5 µM

表1：支气管上皮气道培养基（含抑制剂，BLEAM-I）、人支气管/气管上皮细胞气液界面培养基（含抑制剂，HBTEC-I）及HBTEC培养基的组分。

细胞培养瓶/细胞培养小室804G 细胞条件培养基（mL）
T25 培养瓶3 mL
T75 培养瓶5 mL
24 孔细胞培养小室（0.4 µm 孔径，0.33 cm2 表面积）400 µL

表2：培养瓶和细胞培养插件所需的804G细胞来源基质条件培养基的体积。

讨论

本文所述方案详细介绍了从NICU中接受插管的新生儿收集和处理新生儿气管吸出物样本的方法，并利用既往 established 的方法从这些样本中分离和扩增活的新生儿气道上皮细胞（nTAECs）39。此外，我们还描述了一种将nTAECs在气液界面（ALI）条件下培养的方法，并通过跨上皮电阻（TEER）测定、FITC-葡聚糖通透性实验、免疫荧光染色以及对细胞类型特异性标志物（即基底细胞、纤毛细胞、club细胞和杯状细胞）的qPCR分析，随时间动态表征其分化为极化黏膜纤毛气道上皮的过程。本方案的创新之处在于对发育中的nTAEC单层细胞施加中度高氧（60% O2）以实现大气氧化还原状态的扰动。我们已证实，7天的60% O2暴露可在nTAECs中诱导细胞氧化应激。进一步结果显示，该O2暴露策略不会急性引起显著的细胞凋亡或细胞膜损伤，从而允许在完成O2暴露后继续维持nTAECs的ALI培养。因此，该模型有望用于研究O2暴露对新生儿气道上皮编程的短期和长期影响。

与传统的浸没式培养相比，在气液界面（ALI）条件下培养鼻部气道上皮细胞（nTAECs）具有一定的优势，因其可促进极化气道上皮单层的形成，并有助于紧密连接的建立以及黏液纤毛分化60,61。既往针对nTAECs的研究表明，在ALI培养的早期阶段（ALI第0至7天），细胞经历假复层化过程（表现为多层结构而非单层细胞），最终在第二周结束时形成成熟的假复层上皮42,62。紧密连接的形成在ALI培养早期也遵循类似的发展轨迹，伴随跨上皮电阻（TEER）迅速升高，随后趋于平稳63，该现象已在nTAECs模型中得到证实。此外，在ALI条件下培养的气道上皮细胞增强了紧密连接复合物组分claudin-1的表达及其顶端侧定位，从而增强紧密连接的封闭功能，促进成熟细胞单层的形成63。这与细胞旁通透性的降低相关，本模型通过FITC-葡聚糖实验检测单层通透性，结果显示通透性总体呈下降趋势。我们通过免疫染色对ALI培养第28天的nTAECs进行分析，明确了其黏液纤毛分化的模式，检测了纤毛细胞（TUBA4A）、Club细胞（SCGB1A1）和杯状细胞（MUC5AC）特异性标志物的表达。此外，我们在ALI培养的时间进程中检测了纤毛细胞（FOXJ1）、Club细胞（SCGB1A1）和杯状细胞（MUC5AC）特异性标志物的基因表达水平。其他研究团队已证实，转录因子FOXJ1对运动纤毛的形成至关重要，而TUBA4A则存在于初级纤毛和运动纤毛中64,65。在本模型中，nTAECs在ALI分化过程中FOXJ1的基因表达模式大致与既往研究中报道的气道上皮培养中运动纤毛出现的时间相吻合64,66。

Teape 等人最近的一项研究评估了高氧暴露对 ALI 培养条件下蛋白组和代谢组的影响67。然而，这些细胞来源于成年供体。既往关于呼吸道合胞病毒（RSV）62,68,69,70的研究以及近期的 COVID-19 大流行71突显了年龄相关差异在气道上皮反应与功能中的重要性。Zhao 等人采用类似的方法分离了新生儿和成人气道上皮细胞，并显示在 ALI 分化 21 天后，新生儿与成人气道上皮细胞在细胞组成上无显著差异62。然而，两者对 RSV 感染的反应存在明显差异，新生儿细胞表现出更多的 RSV 感染细胞及更严重的上皮损伤，相较于成年细胞。总体而言，Zhao 等人所使用的培养条件在 nTAECs 中诱导出比我们更强的分化效果，纤毛细胞（41% 对 22%）和杯状细胞（10% 对 3%）数量更高。这些差异可能归因于使用了不同的生长培养基。他们的研究组使用 PneumaCult-ALI 培养基（而非 HBTEC-ALI 培养基），该培养基已被证明可诱导出更多数量的纤毛细胞和杯状细胞，从而实现更强的分化效果72。在此模型中，纤毛细胞、克拉拉细胞和杯状细胞的细胞类型特异性标志物基因表达在 ALI 培养第 0 至 7 天迅速上升，随后在 ALI 第 28 天左右有所下降。可能的原因是分化过程在 ALI 第 14 天后趋于平台期，这一点已在先前关于 nTAECs 的研究中得到证实42。

我们已描述了中度高氧（60% O₂）的应用2)暴露7天，我们认为这比使用极高浓度氧更接近模拟早产新生儿在新生儿重症监护室（NICU）中的实际经历2 水平（> 80% O2)67 急性O的风险2 毒性增强1,5。事实上，95% O2 新生肺组织暴露可诱导细胞凋亡，其机制与caspase激活有关73然而，这种暴露策略仅适用于少数入住新生儿重症监护病房（NICU）的婴儿，这些婴儿由于氧2-诱导的急性肺损伤，发展为伴有慢性支气管病变的重度支气管肺发育不良（急性肺损伤模型）37在当今合理使用 O 的时代2 治疗期间，大多数早产儿不会暴露于如此高浓度的氧气2；然而，他们仍面临未来发生气道疾病的风险（发育扰动模型）。在这类群体中，生命早期氧化还原失衡所致的损伤可能最初无明显表现，但随后在幼儿期或更晚阶段以慢性气道疾病的形式显现。37. 我们利用细胞氧化应激检测的数据表明，中度高氧暴露（60% O₂）可导致2)显著增加了nTAEC细胞单层中的氧化应激水平。乳酸脱氢酶（LDH）释放和细胞caspase-3活化的分析表明，我们采用的高氧暴露策略并未引起显著的细胞死亡。本文所述方法及模型系统有望用于揭示O2生命早期对敏感分子机制的影响作为前早产儿日后发生肺部疾病的关联因素。

在胎儿期，气道上皮细胞浸没于肺液中，并处于相对缺氧的宫内环境26。新生儿气道上皮细胞更新迅速并经历分化，形成肺部与外界之间的重要屏障。当新生儿过渡到出生后生命阶段时，气道上皮细胞暴露于相对高氧的出生后环境中。对于早产儿和临床病情危重新生儿而言，这一转变更为急剧，因为他们通常需要接受治疗性氧气（O2）作为常规治疗的一部分40,74，使其出生后发生氧化损伤的风险显著增高1。尽管已有大量动物模型研究充分表征了高氧对出生后肺泡化过程的影响75，但高氧暴露对发育中气道上皮细胞的作用仍相对缺乏研究38。在气液界面（ALI）培养过程中，采用来源于人类新生儿的气道上皮细胞并施加符合生理实际的高氧暴露条件，增强了本模型的转化医学价值。此外，在细胞活跃分化及单层结构形成的早期至中期阶段施加高氧刺激，而非作用于已完全分化的成熟气道上皮67，可能更真实地模拟了极早产新生儿（< 28周孕龄）的临床情况——这些婴儿出生时肺发育尚处于较早阶段（管状期至囊泡期），而非肺泡期7。

我们的模型在应用于人类发育和疾病研究时存在一些必须考虑的局限性。我们采用了条件性重编程技术处理原代新生儿气道上皮细胞，该方法此前已在nTAECs的气液界面（ALI）模型中发表39使用生长因子抑制剂（Rho/Smad/GSK3/mTOR）可实现这些细胞的快速增殖和后续传代。我们曾尝试在无抑制剂的培养基中对nTAECs进行浸没培养和气液界面（ALI）培养；然而，细胞扩增和传代速度显著减慢，且在第二周结束时，ALI条件下的细胞单层出现渗漏现象（数据未显示）。另一研究团队在培养原代新生儿气道上皮细胞时也采用了相同的抑制剂42 通过单细胞RNA测序分析，我们发现这些抑制剂的存在并未导致氧化应激、上皮-间质转化或细胞衰老相关基因的显著差异表达。尽管如此，我们在模型设计中仍考虑了这一局限性，决定在去除分化培养基中的Rho与Smad抑制剂后，再进行高氧暴露处理。在本研究中，我们仅测试了中度高氧条件（60% O₂）。2) 对nTAECs的影响。然而，未来的研究计划采用梯度高氧暴露（40%、60%和95% O₂）2）并比较nTAECs中的反应。尽管本模型因使用来自NICU收治的新生儿细胞而具有转化应用价值，但这仍是一个 体外 细胞培养模型，因此利用该模型获得的重要发现需通过互补方法进行验证 体内 动物模型

总之，我们已详细描述了建立一个 体外 利用从NICU中插管新生儿的气管吸出物分离得到的新生儿气道上皮细胞构建的3D气液界面（ALI）培养模型。我们已使用该模型研究中度高氧暴露的影响，这是早产儿在NICU中常见的环境损伤因素。高氧暴露在细胞单层中诱导了细胞氧化应激，但未引起显著的细胞膜损伤或细胞死亡，从而允许继续进行ALI培养以研究O₂暴露的长期效应2 暴露对新生儿气道上皮发育和功能的影响。未来应用这些方法可能有助于揭示早产儿中常见的高氧诱导肺部疾病长期发展所涉及的早期发病机制。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由长老会健康基金会（Presbyterian Health Foundation, PHF）和俄克拉荷马共享临床与转化资源（Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources，资助号U54GM104938，来自NIGMS的机构发展奖（IDeA））资助，资助对象为AG。我们感谢马萨诸塞州波士顿哈佛医学院麻省总医院的Paul LeRou博士和Xingbin Ai博士，他们提供了部分实验所用的新生儿供体细胞。图示由BioRender软件绘制。统计分析使用GraphPad Prism软件完成。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% 缓冲福尔马林Fisher Scientific23-426796
1× PBS（磷酸盐缓冲盐水）溶液，pH 7.4Gibco10010049
A 83-01Tocris29-391-0
ALI Transwell 小室，6.5 mmCorning3470
乙酰化微管蛋白抗体，小鼠单克隆SigmaT7451
α-微管蛋白抗体Abcamab7291
细胞角蛋白 5 抗体Abcamab53121
支气管上皮气道培养基（BLEAM）LifeLine Cell TechnologyLL-0023
CHIR 99021Tocris44-231-0
裂解型 Caspase-3 抗体Cell signaling9664T
SCGB1A1 或克拉拉细胞蛋白（CC16）人源，兔多克隆抗体BioVendor R&DRD181022220-01
CM-H2DCFDA（通用氧化应激指示剂）Thermo ScientificC6827
Corning 细胞培养处理 T25 培养瓶Corning430639
Corning U 型细胞培养 T75 培养瓶Corning430641U
CyQUANT LDH 细胞毒性检测试剂盒Thermo ScientificC20300
DAPI 溶液（1 mg/mL）Fisher ScientificEN62248
二甲基亚砜 [DMSO] Hybri-MaxSigmaD2650
蒸馏水Gibco15230162
EVOM TEER 测量操作手册World Precision InstrumentEVM-MT-03-01
FBS（胎牛血清）Gibco10082147
异硫氰酸荧光素葡聚糖（平均分子量 10,000）Fisher ScientificF0918100MG
异硫氰酸荧光素–葡聚糖（平均分子量 20,00）SigmaFD20-100MG
山羊抗小鼠 IgG(H+L)，人源吸附-HRPSouthern Biotech1031-05
山羊抗小鼠 IgG2b 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记InvitrogenA-21141
山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 546 标记InvitrogenA-11035
山羊抗兔 IgG(H+L)，小鼠/人源吸附-HRPSouthern Biotech4050-05
HBTEC 气液界面（ALI）分化培养基LifeLine Cell TechnologyLM-0050
HEPESLonzaCC-5024
Heracell VIOS 160i 三气 CO2 培养箱，165 LThermo Scientific51030411
高容量 cDNA 反转录试剂盒Thermo Scientific4368814
HLL 补充剂LifeLine Cell TechnologyLS-1001
ImageJNIHN/Aimagej.nih.gov/ij/
Invivogen Normocin - 抗微生物试剂Fisher ScientificNC9273499
L-谷氨酰胺LifeLine Cell TechnologyLS-1013
正常山羊血清GibcoPCN5000
NormocinInvivogenant-nr-05
p63 抗体Santa Cruz Biotechnologysc-25268
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36930
PureLink RNA 小量提取试剂盒Thermo Scientific12183025
RAPAMYCINThermo ScientificAAJ62473MC
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Scientific4444964
TaqMan 基因表达检测试剂盒：18S rRNAThermo ScientificHs99999901_s1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：CATThermo ScientificHs00156308_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：FOXJ1Thermo ScientificHs00230964_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：GAPDHThermo ScientificHs02786624_g1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：GPX1Thermo ScientificHs00829989_gH
TaqMan 基因表达检测试剂盒：GPX2Thermo ScientificHs01591589_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：GPX3Thermo ScientificHs01078668_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：KRT5Thermo ScientificHs00361185_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：MUC5ACThermo ScientificHs01365616_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：SCGB1A1Thermo ScientificHs00171092_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：SOD1Thermo ScientificHs00533490_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：SOD2Thermo ScientificHs00167309_m1
Thermo Scientific Nalgene 快速过滤无菌一次性滤器（PES 膜，0.22 μm 孔径，500 mL）Thermo Scientific5660020
TM-1 复合补充剂LifeLine Cell TechnologyLS-1055
总 Caspase-3 抗体Cell signaling14220S
Triton X-100Sigma9036-19-5
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红Gibco25300062
Y-27632 2 HClTocris12-541-0

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