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方法文章

用于评估高氧对人类新生儿气道上皮细胞影响的转化型三维细胞培养模型

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DOI：

10.3791/65913

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2024年7月12日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Center for Pregnancy and Newborn Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Medicine, Section of Pulmonary, Critical Care & Sleep Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

本文内容

摘要

我们描述了一种利用新生气管气道上皮细胞（nTAEC）建立气液界面（ALI）培养模型的方案，并进行具有生理相关性的高氧暴露，以研究大气诱导的氧化应激对来自发育中新生儿气道表面上皮细胞的影响。

摘要

早产儿气道上皮持续暴露于环境应激因素中。在患有肺部疾病的新生儿中，其中一种应激因素包括氧气（O₂）2）高于环境大气的张力——称为高氧（hyperoxia）>21% O₂2). 高氧对气道的影响取决于多种因素，包括气道的发育阶段、高氧程度以及暴露持续时间，不同的暴露条件可能导致独特的表型。尽管已有大量研究关注高氧对新生儿肺泡化及气道高反应性的影响，但关于高氧对人类新生儿气道上皮细胞短期和长期潜在影响的研究仍十分有限。造成这一现状的主要原因是缺乏有效的 体外 用于研究人类新生儿气道上皮发育与功能的模型。本文描述了一种利用人类新生儿气管吸出物分离和扩增新生儿气道上皮细胞（nTAECs）的方法，并将这些细胞在气液界面（ALI）培养系统中进行培养。我们证明，nTAECs在ALI培养中可形成成熟的极化单层细胞，并发生黏液纤毛分化。此外，我们介绍了一种使用专用培养箱在ALI培养条件下对细胞单层施加中度高氧暴露的方法。同时，我们描述了一种通过荧光定量检测ALI培养中高氧暴露后细胞氧化应激水平的检测方法，结果证实中度高氧暴露可诱导细胞氧化应激，但不会引起显著的细胞膜损伤或凋亡。该模型有望用于模拟新生儿重症监护病房（NICU）中新生儿气道所经历的临床相关高氧暴露，并可用于研究O₂暴露的短期与长期影响。2 关于新生儿气道上皮编程的研究。利用该模型开展的研究可用于探索减轻发育中气道早期氧化损伤的方法，此类损伤与早产儿日后发生长期气道疾病相关。

引言

治疗性氧气（O₂）2是新生儿重症监护室（NICU）中最常用的治疗方法之一1因此，高氧暴露（>21% O₂2高氧（hyperoxia）是新生儿无论是否患有显著肺部疾病均常遇到的一种大气应激因素。肺组织对高氧的反应可能因暴露强度和/或持续时间的不同，以及肺部解剖位置、细胞类型和肺发育阶段的差异而有所变化。2,3,4,5,6新生儿高氧性肺损伤的大部分研究集中于高氧暴露对生后肺泡化过程的影响，以模拟支气管肺发育不良（BPD）——这是早产儿中最常见的慢性肺部疾病6,7,8,9,10,11BPD 严重程度根据呼吸支持的量进行分类，以及 O2 妊娠后36周所需9大多数患有支气管肺发育不良（BPD）的婴儿随着肺部持续发育，临床状况会随时间逐渐改善，大部分婴儿在出生后一岁前即可脱离呼吸支持 第一个生日12,13无论出生后支气管肺发育不良（BPD）的严重程度如何，早产儿远期均存在显著的并发症风险，包括学龄前喘息风险增加5倍、哮喘、儿童期反复呼吸道感染以及早发性慢性阻塞性肺疾病。12,14,15,16,17,18,19高氧对早产儿长期呼吸道疾病及肺部感染的影响已通过以下方法进行研究 体外 和 体内 动物模型20,21,22,23,24然而，大多数这些模型都聚焦于间充质组织、肺泡上皮和气道平滑肌的作用25,26,27,28.

气道表面上皮覆盖整个呼吸系统的通路，从气管延伸至终末细支气管，终止于肺泡水平之前29气道基底细胞是气道上皮中的主要干细胞，具有分化为所有成熟气道上皮细胞谱系的能力，包括纤毛细胞和分泌细胞（club细胞：非黏液分泌型，以及杯状细胞：黏液分泌型）29,30,31,32在新生儿高氧性肺损伤相关研究中，细胞培养实验主要采用成人来源的人或小鼠肿瘤细胞系33,34此外，大多数 体外 实验采用的是浸没式培养系统，该系统无法使细胞分化形成类似气道的黏液纤毛上皮 体内 人类气道上皮35因此，关于高氧暴露对人类新生儿发育中气道上皮细胞所致肺损伤的影响，目前仍存在知识空白。其中一个原因是缺乏可用于研究大气暴露对人类新生儿气道上皮影响的转化模型。生命早期的高氧性肺损伤可导致长期的气道疾病和感染风险增加，对早产儿出院后的健康产生深远影响。14,36,37在患有重度支气管肺发育不良且未存活的婴儿中，气道表面上皮存在明显异常，包括杯状细胞增生和纤毛发育紊乱，提示黏液纤毛清除功能异常以及上皮增厚导致气道管径减小38近十年来，人们对在气液界面（ALI）培养原代气道上皮细胞以研究出生后气道上皮发育的兴趣日益增加39,40,41,42然而，新生儿气道上皮细胞的气液界面模型尚未被应用于大气氧化还原扰动模型（如高氧暴露）的研究中。

采用一种先前已发表的方法39我们利用从NICU中插管新生儿获得的新生儿气管吸出物样本，成功分离并扩增了原代新生儿气管气道上皮细胞（nTAECs）。如先前所述，我们采用Rho、Smad、糖原合成酶激酶（GSK3）和雷帕霉素哺乳动物靶蛋白（mTOR）信号通路的抑制剂，以提高这些细胞的扩增能力并延缓其衰老39,42，可实现nTAECs的高效扩增及后续传代。本方案描述了利用nTAECs建立三维气液界面（ALI）培养体系，并对nTAEC单层细胞进行高氧暴露的方法。在ALI培养的前7天（ALI第0至7天）使用Rho和Smad抑制剂，此后在ALI分化的剩余时间内从分化培养基中去除这些抑制剂。ALI培养的气道上皮细胞单层的顶面持续暴露于环境中43，可用于大气扰动研究，并高度模拟暴露于高氧环境下的发育中新生儿气道的病理生物学过程 体内. O的浓度2 在以往针对新生小鼠高氧性肺损伤的细胞培养研究中（无论使用永生化细胞或原代细胞），所采用的氧浓度差异显著（范围从40%至95%），暴露时间亦不相同（范围从15分钟至10天）36,44,45,46,47在本研究中，将ALI细胞单层暴露于60% O₂环境中2 从ALI第7天到第14天（在去除分化培养基中的Rho/Smad抑制剂后）持续7天。高氧暴露是在黏液纤毛分化的早期至中期（ALI第7天至第14天）进行的，而非在完全分化的成熟上皮阶段，因此模拟了 在体 早产儿气道上皮发育。这种暴露策略可最大限度地降低急性O2 毒性（高浓度O预期会出现）2）同时仍在生理相关范围内诱导氧化应激，类似于早产人类新生儿从相对低氧的宫内环境向高氧外界环境过渡的关键阶段。

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方案

新生儿气管吸出物样本仅在获得家长知情同意后采集，且用于采集、运输和储存的方案已获俄克拉荷马大学健康科学中心机构审查委员会（IRB 14377）批准。

1. nTAEC 的分离、传代及气液界面培养的准备工作

  1. 培养基制备
    1. 含抑制剂的支气管上皮气道培养基（BLEAM-I）：通过向500 mL（1瓶，4 °C保存）支气管上皮气道培养基（BLEAM）中添加以下成分制备：1.25 mL HLL添加剂（500 µg/mL人血清白蛋白，0.6 µM亚油酸，0.6 µg/mL卵磷脂），15 mL L-谷氨酰胺（6 mM），2 mL Extract P（0.4%，牛垂体提取物），5 mL TM1（1 µM肾上腺素，5 µg/mL转铁蛋白，10 nM三碘甲腺原氨酸，0.1 µg/mL氢化可的松，5 ng/mL表皮生长因子（EGF），5 ng/mL胰岛素），1 mL抗生素溶液（Normocin，0.1 mg/mL）。为防止原代细胞衰老并提高扩增效率，按先前所述39加入以下生长因子抑制剂：Y-27632（Rho相关蛋白激酶或ROCK抑制剂），终浓度为5 µM；A83-01（抑制Smad信号通路），终浓度为1 µM；CHIR 99021（糖原合成酶激酶-3或GSK3抑制剂），终浓度为0.4 µM；雷帕霉素（雷帕霉素分子靶点或mTOR抑制剂），终浓度为5 nM。使用0.22 µm孔径滤器过滤培养基。培养基成分列表见表1。
    2. 人支气管/气管上皮细胞（HBTEC）气液界面（ALI）培养基：将一瓶HBTEC培养基在37 °C解冻，加入1 mL抗生素溶液（Normocin，0.1 mg/mL），混匀后使用0.22 µm孔径滤器过滤。
    3. 含抑制剂的HBTEC培养基（HBTEC-I）：按上述方法制备HBTEC培养基。在过滤前加入以下抑制剂：Y-27632，终浓度为5 µM；A83-01，终浓度为0.5 µM。使用0.22 µm孔径滤器过滤。
      注意：BLEAM-I、HBTEC和HBTEC-I培养基应于4 °C避光（用铝箔包裹）保存，标注日期和标签，仅在使用前将所需分装量预热（有效期为30天）。
    4. HEPES/FBS：向500 mL HEPES缓冲盐溶液中加入88 mL FBS（终浓度为15%），混匀后使用0.22 µm孔径滤器过滤，并于4 °C保存，标注日期和标签。
      注意：使用前至少30分钟，将BLEAM、HEPES-FBS和胰蛋白酶-EDTA预热至37 °C。
  2. 使用804G条件培养基包被培养瓶和气液界面（ALI）细胞培养小室
    1. 按先前所述方法39制备804G细胞（大鼠膀胱上皮细胞系）基质条件培养基。
    2. 在37 °C、5% CO2培养箱中，使用804G条件培养基包被细胞培养瓶和细胞培养小室，至少孵育4小时。不同规格培养瓶和细胞培养小室所需包被液体积见表2。

2. nTAECs 的分离与扩增及后续气液界面培养的准备

  1. 在对插管新生儿进行常规气管插管吸痰时，采集新鲜的气管吸出物（约1 mL），并收集至痰液收集器中。若吸出物体积不足以进入痰液收集器，可用1–3 mL无菌生理盐水冲洗吸痰导管。
  2. 将样本标记，并置于冰上装入生物危害袋中保存。
    注意：样品可在冰上4 °C保存最多24小时。然而，新鲜样品的得率更高。
  3. 将样本从新生儿重症监护室运送至实验室。 用804G条件培养基包被T25培养瓶，并在气管吸出物运送至实验室的同时做好接种样本的准备。
  4. 从生物危害袋中取出黏液捕集器，用70%乙醇彻底清洁其外表面，以避免任何污染。在无菌细胞培养罩内小心打开黏液捕集器的盖子。
  5. 用无菌 PBS 将气管吸出物样本稀释至 5 mL（以稀释黏液），并将全部内容物转移至 50 mL 锥形管中。
  6. 将离心管在 250 x g，20 °C–23 °C 下孵育 5 分钟，弃去上清液（包括黏液）。
    注意：除非另有说明，所有离心步骤均在250 x g、20 °C–23 °C条件下进行，持续5分钟。
  7. 将沉淀重悬于5 mL BLEAM-I中。
  8. 从培养箱中取出T25培养瓶，在接种样品前弃去804G条件培养基。
  9. 将样品接种至T25培养瓶中，置于37 °C、5% CO₂培养箱内培养2 （这将被称为传代0或P0）。
  10. 接种后24小时用BLEAM-I更换培养基，以洗去未贴壁的细胞，之后每48小时更换一次。
    注意：处理气管吸出物样本并在BLEAM-I培养基中孵育后，约在接种后7-10天出现立方状细胞。接种后约3周，细胞生长密集，需进行胰蛋白酶消化以进行后续传代、扩增和冻存。早期传代（P1 - P2）细胞应置于冻存管中（2.5 × 10⁶）6 每冻存管含500 µL冻存液，保存约相应数量的细胞，置于液氮中长期保存。
  11. 从液氮中快速解冻冻存细胞，在37 °C水浴中复苏后，将细胞悬液转移至含有BLEAM-I的适当大小的无菌离心管中。
  12. 使用台盼蓝染色法并结合自动或手动细胞计数仪，按照先前所述方法对细胞进行计数，以确定总细胞数和活细胞数。48用适量的BLEAM-I稀释细胞悬液，使最终浓度为2.1 × 106 T75培养瓶中15 mL细胞悬液的细胞
    注意：对于 T25 培养瓶，0.7 x 106 通常使用5 mL细胞悬液中的细胞进行接种。
  13. 将15 mL细胞悬液转移至T75培养瓶中，于37 °C、5% CO₂条件下培养过夜2.
  14. 次日早晨，更换为新鲜的BLEAM-I培养基，之后每2天更换一次新鲜的BLEAM-I培养基。当细胞生长至约80%–90%融合度时，即可进行胰蛋白酶消化，用于气液界面（ALI）培养。
  15. 向细胞单层加入5 mL胰蛋白酶-EDTA（T75）。
    注意：请使用新鲜的胰蛋白酶，避免使用多次加热的胰蛋白酶。
  16. 在培养箱中于 37 °C 孵育烧瓶 5 分钟。然后轻拍烧瓶侧面 8 至 10 次，以使细胞脱落。在显微镜下观察，确认胰蛋白酶消化后细胞已脱落。如果 >50%的细胞仍贴壁于培养瓶中，用PBS洗涤2次，缩短胰蛋白酶消化时间为2-3分钟，重复消化步骤。
  17. 用15 mL HEPES-FBS终止反应，吹打混匀4–5次。将细胞转移至适当大小的无菌离心管中，在250 x g条件下离心 g 离心5分钟以收集细胞。
  18. 离心后，小心吸除上清液。用1 mL BLEAM-I重悬细胞沉淀，轻柔吹打5至10次使其充分溶解。
  19. 计数细胞以确定总细胞数和活细胞数。用适当体积的BLEAM-I稀释细胞悬液，使最终浓度为1 x 105 每100 µl细胞悬液中的活细胞数

3. nTAECs 的气液界面培养

注意：细胞培养小室应使用804G条件培养基包被，并在下一步操作前于37 °C、5% CO2条件下孵育至少4小时（见步骤1.2）。

  1. 从培养箱中取出含有细胞培养小室的24孔细胞培养板，弃去804G条件培养基。
  2. 向每个气液界面（ALI）孔的基底侧（下室）加入1 mL BLEAM-I培养基，向ALI细胞培养小室的顶侧腔室（上室）加入100 µL细胞悬液（1 × 105 个细胞），并在37 °C、5% CO2条件下培养细胞。此阶段定义为ALI第-2天。
  3. 次日，更换基底侧（1 mL）和顶侧（100 µL）腔室中的培养基为新鲜BLEAM-I培养基。更换顶侧腔室培养基时，注意不要扰动细胞单层。此阶段定义为ALI第-1天。
  4. 次日，移除基底侧和顶侧腔室中的培养基。
    注：在浸没培养条件下，细胞在细胞培养膜上形成融合单层约需2天。此时可建立气液界面培养。
  5. 向基底侧腔室加入1 mL HBTEC-I培养基，顶侧腔室则不加培养基，使其暴露于空气中。此阶段定义为ALI第0天。
  6. 从ALI第0天至第6天，每48小时更换一次基底侧腔室中的HBTEC-I培养基（1 mL）。从ALI第7天起，更换为常规HBTEC培养基（不含抑制剂），并持续培养至预定收获时间点。
    注：在ALI培养的前7天内，基底侧腔室的培养基可能渗漏至顶侧腔室。需每天小心吸除该渗漏液体，以维持细胞层的健康并促进其分化。
  7. 在不同时间点收获细胞、细胞培养小室及基底侧培养基，用于分子生物学技术、检测与分析。
    1. 本实验方案中，在ALI第0、7和28天收获细胞，进行上皮细胞分化标志物的qPCR基因表达分析（按试剂盒标准操作流程）。在ALI第0、7、14和28天收获细胞培养小室，用于屏障功能检测（方法见下文）。
    2. 在ALI第0和28天，使用甲醛固定的细胞培养小室，以上皮细胞分化标志物进行免疫荧光染色（采用先前发表的实验方案）49。在ALI第14天，收获基底侧培养基用于乳酸脱氢酶（LDH）释放检测（按试剂盒标准操作流程），收获细胞裂解液用于氧化应激标志物的qPCR分析及caspase-3和cleaved caspase-3抗体的免疫印迹分析（按试剂盒标准操作流程），并收获细胞培养小室用于氧化应激检测（方法见下文）。

4. 在 ALI 分化期间检测屏障功能

  1. 测量跨上皮电阻（TEER）
    注意：在气液界面（ALI）分化过程中，使用上皮细胞伏特/欧姆计（EVOM）测量跨上皮电阻，以评估细胞层的完整性50。
    1. 在测量测试滤膜的电阻值之前，使用经804G条件化培养基包被但无细胞的细胞培养插件（即无细胞）测量背景电阻值（单位：欧姆，Ω）
    2. 从测试滤膜的电阻值中减去背景电阻值，并将差值乘以细胞生长表面积，以计算每个测试滤膜的TEER值。
      TEER = (ΩT - ΩB) X C
      TEER = 跨上皮电阻（Ω·cm2）
      ΩT = 测试滤膜电阻值（Ω）
      ΩB = 背景电阻值（Ω）
      C = 细胞生长表面积（cm2）
      注意：用于TEER测量的细胞培养插件随后用10%缓冲福尔马林固定，并立即用于免疫荧光染色和荧光显微镜观察（方法见下文），或在4 °C下保存以备后续染色使用。
  2. 异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC-葡聚糖）上皮通透性检测
    注意：在气液界面（ALI）分化过程中，采用两种不同分子量的FITC-葡聚糖（10 kD和20 kD）进行上皮通透性检测。
    1. 配制FITC-葡聚糖工作液（1 mg/mL）：称取5 mg FITC，溶于1 mL DMSO中（终浓度为5 mg/mL）。将该5 mg/mL储备液用预热至37 °C的HBTEC培养基稀释至1 mg/mL。避光保存。
    2. 将含细胞的测试滤膜转移至新的12孔板中，并在基底外侧加入1 mL HBTEC培养基。
    3. 吸除顶端室中的培养基（如有），加入250 µL FITC-葡聚糖工作液。室温避光孵育60分钟。
    4. 通过将含FITC-葡聚糖工作液的测试滤膜从12孔板中取出，终止FITC-葡聚糖检测。
    5. 从12孔板中收集基底外侧培养基至1.5 mL微量离心管中，并涡旋混匀。
    6. 将每管中的100 µL等分试样以三复孔形式转移至96孔透明底黑色聚苯乙烯微孔板中。另取一些孔加入100 µL HBTEC培养基作为阴性对照，用于测定背景荧光。
    7. 使用分光光度计测定荧光强度，激发波长为490 nm，发射波长为520 nm。
    8. 从测试滤膜的荧光值中减去平均背景荧光值，得到校正后的荧光值，并以ALI第0天的校正荧光值为基准，将结果表示为百分比（针对FITC-葡聚糖10 kD和20 kD分别计算）。

5. 使用TriGas培养箱进行高氧暴露

  1. 在气液界面培养第7天，根据实验和取材需求，确定需置于高氧环境中的细胞培养小室数量。
  2. 将三气培养箱的O2浓度设定为60% O2。通常需要约30–45分钟，O2浓度才能达到60%。
  3. 当O2浓度稳定在60%后，将分配至高氧组的24孔细胞培养板及其细胞培养小室放入培养箱内，并关闭培养箱门。
    注意：此步骤应尽可能迅速完成，以防止培养箱内O2浓度显著下降。
  4. 对暴露于高氧环境的细胞培养小室更换培养基，换液时间表应与对照组（暴露于21% O2）保持一致。每天检查细胞培养小室是否有培养基渗漏，并轻轻抽吸进入细胞培养腔室的渗漏液体。
  5. 持续进行7天高氧暴露（气液界面培养第7天至第14天）。高氧暴露结束后，在气液界面培养第14天收获细胞或利用细胞培养小室进行相关检测。

6. 氧化应激检测以评估高氧暴露的影响

注意：我们使用 CM-H2DCFDA 检测试剂盒，在 O2 暴露后的 ALI 第 14 天测定细胞培养小室中荧光强度，作为氧化应激的指标。H2DCFDA 是 2′,7′-二氯荧光素（DCF）的化学还原和乙酰化形式，是一种可穿透活细胞的活性氧（ROS）指示剂。CM-H2DCFDA 是 H2DCFDA 的巯基反应性氯甲基衍生物，可促进与细胞内组分的进一步共价结合，从而延长染料在细胞内的滞留时间。这些分子本身无荧光，只有当细胞内酯酶去除乙酰基团并在细胞内发生氧化反应后才产生荧光51。细胞内氧化反应完成后，所产生的荧光强度增加可通过荧光显微镜进行检测，作为细胞氧化应激的替代性指标52。该试剂对光和空气敏感，因此需尽可能避光保存并保持密闭。

  1. CM-H2DCFDA 检测试剂溶液的制备： 每瓶含有 50 µg 粉末状试剂染料。为配制 1 mM 储存液，向瓶中加入 80 µL 无菌 DMSO，用移液器充分混匀，并轻轻涡旋。为在细胞培养小室中达到染料终浓度 1 µM，每 100 µL PBS 中加入 0.1 µL 的 1 mM 储存液（例如，为 6 个细胞培养小室配制，向 600 µL PBS 中加入 0.6 µL 储存液）。
    注意：染料的终浓度可在 1–5 µM 之间调整。需根据每种培养条件优化剂量。
  2. 向高氧暴露组和常氧暴露组的每个细胞培养小室中各加入 100 µL 的 1 µM 染料溶液。每个处理组至少设一个阴性对照（仅加入 100 µL 不含染料的 PBS）。在 37 °C 避光孵育 30 分钟，用 PBS 洗涤一次。
  3. 载玻片制备：吸除多余 PBS。小心夹住细胞培养小室，用刀片缓慢切下细胞培养膜。在载玻片上滴加 1–2 滴封片液。用平头镊子夹住膜的一角，将细胞面朝下放置于封片液上，盖上盖玻片。去除多余封片液，在室温避光条件下静置晾干 15 分钟。载玻片现已可进行成像。
    注意：载玻片制备及荧光显微镜观察应尽快完成，因荧光强度在 2–3 小时内会显著减弱。
  4. 荧光显微镜观察：使用荧光显微镜，选择 Cy2（花青素-2）通道采集图像。每个细胞培养小室采集三个独立、无重叠区域的图像。
  5. 氧化应激的荧光检测
    注意：使用荧光显微镜图像，通过 ImageJ 软件（https://imagej.nih.gov/ij/）及以下所述流程测定校正后的总细胞荧光强度（CTCF）。CTCF 可作为高氧暴露后细胞培养小室中氧化应激的指标，通过 ImageJ 软件消除背景荧光后进行测定。
    1. 在 ImageJ 中打开显微图像，使用矩形工具选择感兴趣区域。右键单击并选择 添加到 ROI（感兴趣区域）管理器，以保存该选择区域（α）。在所有图像中使用相同的选定区域。
    2. 在 分析 > 设定测量值 中选择测量参数，在设置选项卡中勾选 面积、积分密度和平均灰度值。
    3. 对每张图像，从 ROI 管理器中调用相同的选定区域，选择 分析 > 测量。积分密度值代表所选区域的总荧光强度（Ft）。记录弹出窗口中的测量值。
    4. 为校正每张图像的背景荧光（Fb），使用矩形工具选择一个非荧光区域的小范围区域。对该区域执行 分析 > 测量。平均强度值即为 Fb。记录弹出窗口中的测量值。
    5. 通过将背景读数的平均荧光强度乘以 ROI 的总面积，再从 ROI 的积分密度值中减去该乘积，计算 CTCF。对两组处理组（对照组和高氧组）的所有图像重复此流程。
      CTCF = Ft  - (Fb × α)
      CTCF = 校正后的总细胞荧光强度（A.U.）
      Ft = 总荧光强度
      Fb = 背景荧光强度
      α = 选定区域

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结果

为了分离新生儿气管上皮细胞（nTAECs），我们从新生儿重症监护病房（NICU）中接受插管的新生儿收集气管吸出物，并将样本置于冰上运送至实验室进行后续处理（图1A）。将气管吸出物样本接种于气道上皮细胞生长培养基（含Rho/Smad、GSK3和mTOR抑制剂的BLEAM-I）后，7–10天内出现立方状细胞。至第14天，细胞融合度达到50%–60%；接种约21天后，细胞生长密集，需用胰蛋白酶消化以进行后续传代和扩增。这些细胞经连续传代（最多至P3代）后，于液氮中冷冻保存以长期储存。实验所用细胞（≤第3代）随后被复苏用于气液界面（ALI）培养。

当nTAECs在T75培养瓶中于浸没条件下达到约80%-90%融合度时，将其转移至气液界面（ALI）条件下进行培养。我们在ALI培养第0天对nTAEC单层细胞进行了免疫荧光染色，检测基底细胞特异性标志物——细胞角蛋白5（KRT5）53和肿瘤蛋白p63（TP63）

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讨论

本文所述方案详细介绍了从NICU中接受插管的新生儿收集和处理新生儿气管吸出物样本的方法，并利用既往 established 的方法从这些样本中分离和扩增活的新生儿气道上皮细胞（nTAECs）39。此外，我们还描述了一种将nTAECs在气液界面（ALI）条件下培养的方法，并通过跨上皮电阻（TEER）测定、FITC-葡聚糖通透性实验、免疫荧光染色以及对细胞类型特异性标志物（即基底细胞、纤毛细胞、club细胞和杯状细胞）的qPCR分析，随时间动态表征其分化为极化黏膜纤毛气道上皮的过程。本方案的创新之处在于对发育中的nTAEC单层细胞施加中度高氧（60% O2）以实现大气氧化还原状态的扰动。我们已证实，7天的60% O2暴露可在nTAECs中诱导细胞氧化应激。进一步结果显示，该O2暴露策略不会急性引起显著的细胞凋亡或细胞膜损伤，从而允许在完成O2暴露后继续维持nTAECs的ALI培养。因此，该模型有望用于研究O2暴露对新生儿气道上皮编程的短期和长期影响。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由长老会健康基金会（Presbyterian Health Foundation, PHF）和俄克拉荷马共享临床与转化资源（Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources，资助号U54GM104938，来自NIGMS的机构发展奖（IDeA））资助，资助对象为AG。我们感谢马萨诸塞州波士顿哈佛医学院麻省总医院的Paul LeRou博士和Xingbin Ai博士，他们提供了部分实验所用的新生儿供体细胞。图示由BioRender软件绘制。统计分析使用GraphPad Prism软件完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% 缓冲福尔马林Fisher Scientific23-426796
1× PBS（磷酸盐缓冲盐水）溶液，pH 7.4Gibco10010049
A 83-01Tocris29-391-0
ALI Transwell 小室，6.5 mmCorning3470
乙酰化微管蛋白抗体，小鼠单克隆SigmaT7451
α-微管蛋白抗体Abcamab7291
细胞角蛋白 5 抗体Abcamab53121
支气管上皮气道培养基（BLEAM）LifeLine Cell TechnologyLL-0023
CHIR 99021Tocris44-231-0
裂解型 Caspase-3 抗体Cell signaling9664T
SCGB1A1 或克拉拉细胞蛋白（CC16）人源，兔多克隆抗体BioVendor R&DRD181022220-01
CM-H2DCFDA（通用氧化应激指示剂）Thermo ScientificC6827
Corning 细胞培养处理 T25 培养瓶Corning430639
Corning U 型细胞培养 T75 培养瓶Corning430641U
CyQUANT LDH 细胞毒性检测试剂盒Thermo ScientificC20300
DAPI 溶液（1 mg/mL）Fisher ScientificEN62248
二甲基亚砜 [DMSO] Hybri-MaxSigmaD2650
蒸馏水Gibco15230162
EVOM TEER 测量操作手册World Precision InstrumentEVM-MT-03-01
FBS（胎牛血清）Gibco10082147
异硫氰酸荧光素葡聚糖（平均分子量 10,000）Fisher ScientificF0918100MG
异硫氰酸荧光素–葡聚糖（平均分子量 20,00）SigmaFD20-100MG
山羊抗小鼠 IgG(H+L)，人源吸附-HRPSouthern Biotech1031-05
山羊抗小鼠 IgG2b 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记InvitrogenA-21141
山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 546 标记InvitrogenA-11035
山羊抗兔 IgG(H+L)，小鼠/人源吸附-HRPSouthern Biotech4050-05
HBTEC 气液界面（ALI）分化培养基LifeLine Cell TechnologyLM-0050
HEPESLonzaCC-5024
Heracell VIOS 160i 三气 CO2 培养箱，165 LThermo Scientific51030411
高容量 cDNA 反转录试剂盒Thermo Scientific4368814
HLL 补充剂LifeLine Cell TechnologyLS-1001
ImageJNIHN/Aimagej.nih.gov/ij/
Invivogen Normocin - 抗微生物试剂Fisher ScientificNC9273499
L-谷氨酰胺LifeLine Cell TechnologyLS-1013
正常山羊血清GibcoPCN5000
NormocinInvivogenant-nr-05
p63 抗体Santa Cruz Biotechnologysc-25268
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36930
PureLink RNA 小量提取试剂盒Thermo Scientific12183025
RAPAMYCINThermo ScientificAAJ62473MC
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Scientific4444964
TaqMan 基因表达检测试剂盒：18S rRNAThermo ScientificHs99999901_s1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：CATThermo ScientificHs00156308_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：FOXJ1Thermo ScientificHs00230964_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：GAPDHThermo ScientificHs02786624_g1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：GPX1Thermo ScientificHs00829989_gH
TaqMan 基因表达检测试剂盒：GPX2Thermo ScientificHs01591589_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：GPX3Thermo ScientificHs01078668_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：KRT5Thermo ScientificHs00361185_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：MUC5ACThermo ScientificHs01365616_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：SCGB1A1Thermo ScientificHs00171092_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：SOD1Thermo ScientificHs00533490_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：SOD2Thermo ScientificHs00167309_m1
Thermo Scientific Nalgene 快速过滤无菌一次性滤器（PES 膜，0.22 μm 孔径，500 mL）Thermo Scientific5660020
TM-1 复合补充剂LifeLine Cell TechnologyLS-1055
总 Caspase-3 抗体Cell signaling14220S
Triton X-100Sigma9036-19-5
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红Gibco25300062
Y-27632 2 HClTocris12-541-0

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