用于评估高氧对人类新生儿气道上皮细胞影响的转化型三维细胞培养模型

摘要

我们描述了一种利用新生气管气道上皮细胞（nTAEC）建立气液界面（ALI）培养模型的方案，并进行具有生理相关性的高氧暴露，以研究大气诱导的氧化应激对来自发育中新生儿气道表面上皮细胞的影响。

摘要

早产儿气道上皮持续暴露于环境应激因素中。在患有肺部疾病的新生儿中，其中一种应激因素包括氧气（O₂）₂）高于环境大气的张力——称为高氧（hyperoxia）>21% O₂₂). 高氧对气道的影响取决于多种因素，包括气道的发育阶段、高氧程度以及暴露持续时间，不同的暴露条件可能导致独特的表型。尽管已有大量研究关注高氧对新生儿肺泡化及气道高反应性的影响，但关于高氧对人类新生儿气道上皮细胞短期和长期潜在影响的研究仍十分有限。造成这一现状的主要原因是缺乏有效的 体外 用于研究人类新生儿气道上皮发育与功能的模型。本文描述了一种利用人类新生儿气管吸出物分离和扩增新生儿气道上皮细胞（nTAECs）的方法，并将这些细胞在气液界面（ALI）培养系统中进行培养。我们证明，nTAECs在ALI培养中可形成成熟的极化单层细胞，并发生黏液纤毛分化。此外，我们介绍了一种使用专用培养箱在ALI培养条件下对细胞单层施加中度高氧暴露的方法。同时，我们描述了一种通过荧光定量检测ALI培养中高氧暴露后细胞氧化应激水平的检测方法，结果证实中度高氧暴露可诱导细胞氧化应激，但不会引起显著的细胞膜损伤或凋亡。该模型有望用于模拟新生儿重症监护病房（NICU）中新生儿气道所经历的临床相关高氧暴露，并可用于研究O₂暴露的短期与长期影响。₂ 关于新生儿气道上皮编程的研究。利用该模型开展的研究可用于探索减轻发育中气道早期氧化损伤的方法，此类损伤与早产儿日后发生长期气道疾病相关。

引言

治疗性氧气（O₂）₂是新生儿重症监护室（NICU）中最常用的治疗方法之一¹因此，高氧暴露（>21% O₂₂高氧（hyperoxia）是新生儿无论是否患有显著肺部疾病均常遇到的一种大气应激因素。肺组织对高氧的反应可能因暴露强度和/或持续时间的不同，以及肺部解剖位置、细胞类型和肺发育阶段的差异而有所变化。^2,3,4,5,6新生儿高氧性肺损伤的大部分研究集中于高氧暴露对生后肺泡化过程的影响，以模拟支气管肺发育不良（BPD）——这是早产儿中最常见的慢性肺部疾病^{6,7,8,9,10,11}BPD 严重程度根据呼吸支持的量进行分类，以....

方案

新生儿气管吸出物样本仅在获得家长知情同意后采集，且用于采集、运输和储存的方案已获俄克拉荷马大学健康科学中心机构审查委员会（IRB 14377）批准。

1. nTAEC 的分离、传代及气液界面培养的准备工作

1. 培养基制备
   1. 含抑制剂的支气管上皮气道培养基（BLEAM-I）：通过向500 mL（1瓶，4 °C保存）支气管上皮气道培养基（BLEAM）中添加以下成分制备：1.25 mL HLL添加剂（500 µg/mL人血清白蛋白，0.6 µM亚油酸，0.6 µg/mL卵磷脂），15 mL L-谷氨酰胺（6 mM），2 mL Extract P（0.4%，牛垂体提取物），5 mL TM1（1 µM肾上腺素，5 µg/mL转铁蛋白，10 nM三碘甲腺原氨酸，0.1 µg/mL氢化可的松，5 ng/mL表皮生长因子（EGF），5 ng/mL胰岛素），1 mL抗生素溶液（Normocin，0.1 mg/mL）。为防止原代细胞衰老并提高扩增效率，按先前所述³⁹加入以下生长因子抑制剂：Y-27632（Rho相关蛋白激酶或ROCK抑制剂），终浓度为5 µM；A83-01（抑制Smad信号通路），终浓度为1 µM；CHIR 99021（糖原合成酶激酶-3或GSK3抑制剂），终浓度为0.4 µM；雷帕霉素（雷帕霉素分子靶点或mTOR抑制剂），终浓度为5 nM。使用0.22 µ....

结果

为了分离新生儿气管上皮细胞（nTAECs），我们从新生儿重症监护病房（NICU）中接受插管的新生儿收集气管吸出物，并将样本置于冰上运送至实验室进行后续处理（图1A）。将气管吸出物样本接种于气道上皮细胞生长培养基（含Rho/Smad、GSK3和mTOR抑制剂的BLEAM-I）后，7–10天内出现立方状细胞。至第14天，细胞融合度达到50%–60%；接种约21天后，细胞生长密集，需用胰蛋白酶消化以进行后续传代和扩增。这些细胞经连续传代（最多至P3代）后，于液氮中冷冻保存以长期储存。实验所用细胞（≤第3代）随后被复苏用于气液界面（ALI）培养。

当nTAECs在T75培养瓶中于浸没条件下达到约80%-90%融合度时，将其转移至气液界面（ALI）条件下进行培养。我们在ALI培养第0天对nTAEC单层细胞进行了免疫荧光染色，检测基底细胞特异性标志物——细胞角蛋白5（KRT5）⁵³和肿瘤蛋白p63（TP63）

讨论

本文所述方案详细介绍了从NICU中接受插管的新生儿收集和处理新生儿气管吸出物样本的方法，并利用既往 established 的方法从这些样本中分离和扩增活的新生儿气道上皮细胞（nTAECs）³⁹。此外，我们还描述了一种将nTAECs在气液界面（ALI）条件下培养的方法，并通过跨上皮电阻（TEER）测定、FITC-葡聚糖通透性实验、免疫荧光染色以及对细胞类型特异性标志物（即基底细胞、纤毛细胞、club细胞和杯状细胞）的qPCR分析，随时间动态表征其分化为极化黏膜纤毛气道上皮的过程。本方案的创新之处在于对发育中的nTAEC单层细胞施加中度高氧（60% O₂）以实现大气氧化还原状态的扰动。我们已证实，7天的60% O₂暴露可在nTAECs中诱导细胞氧化应激。进一步结果显示，该O₂暴露策略不会急性引起显著的细胞凋亡或细胞膜损伤，从而允许在完成O₂暴露后继续维持nTAECs的ALI培养。因此，该模型有望用于研究O₂暴露对新生儿气道上皮编程的短期和长期影响。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 缓冲福尔马林	Fisher Scientific	23-426796
1× PBS（磷酸盐缓冲盐水）溶液，pH 7.4	Gibco	10010049
A 83-01	Tocris	29-391-0
ALI Transwell 小室，6.5 mm	Corning	3470
乙酰化微管蛋白抗体，小鼠单克隆	Sigma	T7451
α-微管蛋白抗体	Abcam	ab7291
细胞角蛋白 5 抗体	Abcam	ab53121
支气管上皮气道培养基（BLEAM）	LifeLine Cell Technology	LL-0023
CHIR 99021	Tocris	44-231-0
裂解型 Caspase-3 抗体	Cell signaling	9664T
SCGB1A1 或克拉拉细胞蛋白（CC16）人源，兔多克隆抗体	BioVendor R&D	RD181022220-01
CM-H2DCFDA（通用氧化应激指示剂）	Thermo Scientific	C6827
Corning 细胞培养处理 T25 培养瓶	Corning	430639
Corning U 型细胞培养 T75 培养瓶	Corning	430641U
CyQUANT LDH 细胞毒性检测试剂盒	Thermo Scientific	C20300
DAPI 溶液（1 mg/mL）	Fisher Scientific	EN62248
二甲基亚砜 [DMSO] Hybri-Max	Sigma	D2650
蒸馏水	Gibco	15230162
EVOM TEER 测量操作手册	World Precision Instrument	EVM-MT-03-01
FBS（胎牛血清）	Gibco	10082147
异硫氰酸荧光素葡聚糖（平均分子量 10,000）	Fisher Scientific	F0918100MG
异硫氰酸荧光素–葡聚糖（平均分子量 20,00）	Sigma	FD20-100MG
山羊抗小鼠 IgG(H+L)，人源吸附-HRP	Southern Biotech	1031-05
山羊抗小鼠 IgG2b 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记	Invitrogen	A-21141
山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 546 标记	Invitrogen	A-11035
山羊抗兔 IgG(H+L)，小鼠/人源吸附-HRP	Southern Biotech	4050-05
HBTEC 气液界面（ALI）分化培养基	LifeLine Cell Technology	LM-0050
HEPES	Lonza	CC-5024
Heracell VIOS 160i 三气 CO2 培养箱，165 L	Thermo Scientific	51030411
高容量 cDNA 反转录试剂盒	Thermo Scientific	4368814
HLL 补充剂	LifeLine Cell Technology	LS-1001
ImageJ	NIH	N/A	imagej.nih.gov/ij/
Invivogen Normocin - 抗微生物试剂	Fisher Scientific	NC9273499
L-谷氨酰胺	LifeLine Cell Technology	LS-1013
正常山羊血清	Gibco	PCN5000
Normocin	Invivogen	ant-nr-05
p63 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-25268
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36930
PureLink RNA 小量提取试剂盒	Thermo Scientific	12183025
RAPAMYCIN	Thermo Scientific	AAJ62473MC
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Scientific	4444964
TaqMan 基因表达检测试剂盒：18S rRNA	Thermo Scientific	Hs99999901_s1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：CAT	Thermo Scientific	Hs00156308_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：FOXJ1	Thermo Scientific	Hs00230964_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：GAPDH	Thermo Scientific	Hs02786624_g1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：GPX1	Thermo Scientific	Hs00829989_gH
TaqMan 基因表达检测试剂盒：GPX2	Thermo Scientific	Hs01591589_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：GPX3	Thermo Scientific	Hs01078668_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：KRT5	Thermo Scientific	Hs00361185_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：MUC5AC	Thermo Scientific	Hs01365616_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：SCGB1A1	Thermo Scientific	Hs00171092_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：SOD1	Thermo Scientific	Hs00533490_m1
TaqMan 基因表达检测试剂盒：SOD2	Thermo Scientific	Hs00167309_m1
Thermo Scientific Nalgene 快速过滤无菌一次性滤器（PES 膜，0.22 μm 孔径，500 mL）	Thermo Scientific	5660020
TM-1 复合补充剂	LifeLine Cell Technology	LS-1055
总 Caspase-3 抗体	Cell signaling	14220S
Triton X-100	Sigma	9036-19-5
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红	Gibco	25300062
Y-27632 2 HCl	Tocris	12-541-0