需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

通过生物炼制方法对红藻Gracilaria gracilis进行高值化利用

3.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/65923

⸱

2023年11月21日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, ESTM, Polytechnic University of Leiria, 2MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, Department of Life Sciences, University of Coimbra

本文内容

摘要

本文描述了几种旨在对Gracilaria gracilis进行综合开发利用的实验方案：野生种群的采收、室内培养以及生物活性成分的提取。同时评估了提取物的抗氧化、抗菌和细胞毒性作用，并对添加了全藻类生物量及色素的食品进行了营养成分和稳定性评价。

摘要

人们对海藻作为获取高价值且具有多靶点生物活性成分的丰富原料的兴趣正在持续增长。在本研究中，我们探讨了Gracilaria gracilis的潜力，这是一种在全球范围内广泛养殖的可食用红藻，因其在商业上可作为琼脂及其他用于化妆品、药物、食品和饲料应用成分的来源而备受关注。

G. gracilis 通过营养繁殖和孢子形成，并在调控理化条件以获得大量生物量的基础上，优化了生长条件。采用乙醇和水对海藻生物量进行了绿色提取。通过一系列实验评估了提取物的生物活性潜力 体外 有关其细胞毒性、抗氧化性和抗菌特性的检测。此外，将干燥的海藻生物质掺入意大利面配方中，以提高食品的营养价值。从海藻中提取的色素 G. gracilis 还被作为天然着色剂添加到酸奶中，并对其稳定性进行了评估。两种产品均提交给半熟练感官评价小组进行品评，旨在上市前确定最佳的最终配方。

研究结果支持G. gracilis在作为完整生物量、提取物和/或色素应用时所具备的多功能性。通过实施多种优化后的实验方案，本研究推动了具有潜力的产品开发，可用于食品、化妆品和水产养殖市场，促进环境可持续性以及蓝色循环经济的发展。

此外，根据生物炼制的理念，残留的海藻生物质将被用作促进植物生长的生物刺激剂，或转化为碳材料，用于葡萄牙马雷-莱里亚理工学院室内水产养殖系统的水净化。

引言

 海藻可被视为一种具有潜力的天然原材料，可在制药、食品、饲料和环境领域得到充分利用。它们能够生物合成多种分子，其中许多是陆地生物所不具备的，并具有重要的生物学特性1,2。然而，需要建立针对海藻优化的培养方案，以确保获得充足的生物量。

培养方法必须始终考虑海藻叶状体的特性和整体形态。Gracilaria gracilis 是一种克隆型分类群，意味着其附着器官可产生多个营养轴。因此可通过碎片化（营养繁殖）实现繁殖，因为每个营养轴均能完全独立于母体叶状体而生存3。克隆型分类群可成功结合简单快速的单步培养方法，通过将叶状体分割成小片段获得大量生物量，这些片段能迅速再生并生长为新的、基因完全相同的个体。在此过程中，单倍体和二倍体叶状体均可使用。尽管该属具有复杂的单双倍体同形三相生活史，但除非需要通过遗传更新种群以获得更优良的品系，否则通常无需进行孢子形成。在此情况下，四分孢子（通过减数分裂形成的单倍体孢子）和果孢子（通过有丝分裂形成的二倍体孢子）均可发育为宏观叶状体，随后可通过营养繁殖进行培养和扩增4。生长周期受环境条件和个体生理状态等多种生物因素（如附生生物的出现及其他生物的附着）共同调控。因此，优化培养条件对于确保高生产力和获得高质量生物量至关重要5。

从海藻（包括G. gracilis）中提取生物活性化合物可通过多种方法实现6,7。提取方法的选择取决于目标化合物的种类、应用目的以及海藻的特性。在本研究中，我们采用溶剂提取法，即使用水或乙醇等绿色溶剂溶解并从海藻生物质中提取生物活性成分。该提取过程可通过浸渍法以一种通用且高效的方式进行，适用于多种化合物的提取。该方法操作简单，应用广泛，通常将生物质浸泡于溶剂中较长时间，一般在室温或略高的温度下进行，并通过搅拌以增强提取效率。在达到预定提取时间后，通过过滤或离心将溶剂与固体物质分离。

水因其安全性、易得性以及与多种食品的良好相容性，常被用作食品应用中的溶剂。水提法适用于提取多糖、肽类和某些酚类等极性化合物，但可能无法有效提取非极性化合物。乙醇也是食品应用中广泛使用的溶剂，可用于有效提取多种生物活性分子，包括酚类化合物、黄酮类以及某些色素。乙醇通常被认为在食品中使用是安全的，且易于蒸发，从而留下目标提取物。值得注意的是，选择提取方法时应综合考虑提取效率、选择性、成本效益以及环境影响等因素。优化提取参数（如溶剂浓度、提取时间、温度和压力）对于从G. gracilis或其他海藻中获得最佳生物活性成分产率至关重要。

研究表明，海藻对多种微生物（包括细菌、真菌和病毒）具有抗菌活性8。这种活性归因于其含有的生物活性成分，如酚类化合物、多糖、肽类和脂肪酸。多项研究已证实海藻对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmonella sp.）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等病原体具有抑制作用9。海藻的抗菌作用机制主要与其所含的生物活性化合物有关，这些化合物可干扰微生物的细胞壁、细胞膜、酶系统及信号传导通路10。这些成分可能破坏微生物的生长、抑制生物膜的形成，并调节宿主的免疫反应。

红藻，也称为红藻门生物，是一类能够对多种微生物表现出抗菌活性的藻类。在这类藻中，G. gracilis 含有多种可能与其报道的抗菌活性相关的生物活性化合物。尽管具体的分子成分可能有所不同，但在 G. gracilis 中已有报道且可能具有抗菌特性的常见化合物类别包括多糖、酚类化合物、萜类化合物以及色素11。然而需要指出的是，这些成分的存在与否及其含量会受到多种因素影响，例如海藻采集地点、季节变化、藻体的生理状态以及环境条件。因此，G. gracilis 中抗菌化合物的具体类别和浓度也可能随之变化。

G. gracilis 还被发现具有抗氧化特性，含有多种酚类化合物，这些化合物已被证明能够清除自由基并减轻氧化应激12。 抗氧化剂有助于保护细胞免受活性氧物种造成的损伤，并具有潜在的健康益处。抗氧化能力可通过不同方法直接评估，包括2,2-二苯基-1-苦肼基（DPPH）自由基清除活性；也可通过总多酚含量（TPC）的定量进行间接评估13。

尽管某种成分被报道具有显著的生物活性，但在评估拟与活细胞或组织接触的天然和合成物质时，对其细胞毒性进行评价仍是不可或缺的。目前有多种测定细胞毒性的方法，每种方法均有其优势与局限性。总体而言，这些方法为评估多种物质对细胞的有害影响提供了丰富的选择，同时也有助于研究细胞损伤和死亡的机制14。

在本研究中，我们采用 Mosmann（1983）提出的 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）比色法15该方法通过检测代谢活跃细胞将四唑盐还原为紫色甲臜产物的过程来评估细胞活性。甲臜结晶生成量越多，表明活细胞数量越多，从而间接反映细胞毒性水平14由于在本研究中， G. gracilis 水提物和乙醇提物拟用于皮肤化妆品配方中， 体外 在角质形成细胞（HaCaT）细胞系中进行细胞毒性评估。

关于食品应用，海藻通常热量较低，且富含膳食纤维、必需元素和氨基酸、多糖、多不饱和脂肪酸、多酚以及维生素2,16. G. gracilis 也不例外，具有有趣的营养价值。Freitas 等（2021）4 发现培养的 G. gracilis 蛋白质和维生素C含量更高，且总脂质水平与野生海藻相当。这可能具有经济和环境优势，因为从营养角度来看，人工生产优于对野生资源的开发。此外，消费者日益关注所摄入食物的种类，因此引入新型成分用于食品强化，并利用新资源获取可提升产品附加值并宣称具有特定健康益处的提取物显得尤为重要 "清洁标签" 此外，当前市场竞争激烈，需要开发新产品并制定创新策略，以使制造商能够区别于竞争对手17.

通过海藻等海洋资源强化意大利面等营养价值较低的产品，是一种将此类资源作为新型食品引入市场，并通过具有独特营养价值的产品实现市场差异化的策略。另一方面，G. gracilis 是天然红色色素（如藻胆蛋白）的来源18，在食品工业中具有广阔的应用前景。这种海藻在多个领域均受到广泛关注，其应用形式可包括全海藻、提取物和/或残余生物质。在本研究中，我们展示了若干此类应用的实例。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 生物量收获与制备

  1. 在退潮期间采集G. gracilis样本，并迅速将其置于避光、冷却的容器中运输至实验室，避免干燥、光照和空气暴露。
  2. 在实验室内，用流动的海水冲洗每个藻体，并彻底清洗以去除表面的碎屑、坏死组织、附生生物及其他附着生物。
  3. 将野外采集的生物量置于气候培养室（20 ± 1 °C）中，使用持续充气的海水（盐度31–35 psu），并以日光型冷白色荧光灯提供低光照强度，光周期设定为16:08（光照：黑暗），持续7天。在此期间不添加任何营养培养基，使海藻逐步适应室内培养条件。

2. 菌种保藏

  1. 驯化期结束后，使用无菌刀片切割海藻叶状体的健康顶端。根据 Redmond 等（2014）19 的方法，在无菌条件下，将每个顶端在预先制备于培养皿中的琼脂凝胶（1.0% 细菌学琼脂，以1:1的蒸馏水/海水比例配制）上拖过，以去除任何残留污染物。每个顶端需重复进行三次琼脂拖带操作，并始终将顶端拖过琼脂凝胶中未使用过的区域。
  2. 用盐酸溶液（HCl，15%）清洗玻璃器皿，并用蒸馏水彻底冲洗。将清洁过程中使用的所有工具、玻璃器皿、琼脂、海水和蒸馏水通过高压灭菌器进行灭菌（121 °C，15 分钟）。
    警告：请参阅供应商提供的 HCl 安全数据表。
  3. 顶端在灭菌海水中培养，盐度为 35 psu，并添加经 Redmond 等（2014）19 针对红藻改良的 Von Stosch 富集液（VSE）。向培养基中加入二氧化锗（GeO2）（1 mL/L），以抑制附生硅藻的生长。
    警告：请参阅供应商提供的 GeO2 安全数据表。
    注意：若观察到顶端出现部分或完全褪色等色素丧失现象，则表明其处于胁迫状态或已死亡，应予以丢弃。

3. 培养与扩增

  1. 驯化期结束后，在气候室中将约8-10个健康藻尖随机分配至250 mL平底烧瓶中，培养条件为：20 ± 1 °C，白光冷光源光照强度为20 ± 0.5 µmol photons m-2 s-1（1500 lux），光周期设定为16小时光照:8小时黑暗，并每周更换一次添加VSE培养基的无菌海水。
  2. 每周进行一次重量测量，注意避免过度拉扯藻体20。操作时，小心地将藻尖从培养液中取出，轻轻冲洗后，在实验室天平上以毫克为单位称重。
    注意：此操作可与每周更换培养液同时进行。
  3. 藻体在烧瓶中的培养密度可达2 g/L。达到此密度后，需进行容器扩增（依次为250 mL、1 L和5 L）。当培养体积达到5 L时，转移至室外50 L或更大的白色开放容器中继续培养。
  4. 根据Patarra等（2017）21的方法计算相对生长速率（RGR）：
    RGR (% fw/天) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) × 100
    其中，iw 和 fw 分别表示初始和最终鲜重（单位：克），t 表示培养天数。
    注意：在此实验室条件下，RGR最高可达每日21%。生物量收获可在任意时间进行。为防止降解，收获后应迅速处理，可选择烘箱干燥、冷冻干燥，或直接冷冻保存（-20 °C），具体方法取决于后续用途。干燥后的生物量可于室温（RT）保存，也可继续冷冻储存。

4. 提取步骤

注意：为了评估 体外 细胞毒性、抗氧化和抗菌特性 G. gracils 提取物的制备需考虑两个不同参数：提取温度和溶剂类型。

  1. 为了进行提取，将样品在烘箱中干燥 G. gracilis 生物量并研磨生物量（例如，使用家用咖啡研磨机），直至粉末能通过 200 µm 筛子
  2. 称取干燥的生物量（10 g），溶于100 mL溶剂（无水乙醇或无菌水）中。
  3. 在避光容器中搅拌30分钟。
  4. 依次进行乙醇处理 > 水和水 > 室温下乙醇提取， 40 °C，以及 70 °C.
  5. 每种温度下，分别使用乙醇和水各进行两次提取。
  6. 通过滤纸（Whatman No.1）过滤，将液体提取物与剩余的生物质分离，随后在8000 x g条件下离心 g 室温下孵育10分钟。
  7. 将剩余的藻类生物质重新用于其他溶剂的进一步提取。如果样品先用乙醇提取，则接下来用水提取，反之亦然。
  8. 冷冻干燥水提物，并在旋转蒸发仪中蒸发乙醇提取物 40 °C.
  9. 将干燥的提取物储存于 4 °C.
  10. 将提取物溶解至50 mg/mL（用于抗菌实验）或10 mg/mL（用于抗氧化实验）。水相提取物用无菌水溶解，乙醇提取物用无水乙醇溶解。

5. 抗微生物活性

注意：乙醇提取物和水提取物应分别对Bacillus subtilis subsp. spizizenii (DSM 347)、Escherichia coli (DSM 5922) 和 Listonella anguillarum (DSM 21597) 进行测试。抗菌活性测试必须按照美国临床实验室标准委员会（NCCLS，2012）22 的建议进行。所有菌株均购自德国微生物与细胞培养保藏中心（DSMZ）。L. anguillarum 在添加了1%氯化钠（NaCl）的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）或胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）中培养。其余两种菌株在LB培养基（VWR Chemicals）上培养。Bacillus subtilis subsp. spizizenii (DSM 347) 和 Listonella anguillarum (DSM 21597) 根据供应商说明在30 °C下培养，而Escherichia coli (DSM 5922) 则在37 °C下培养。液体培养基中的抗菌活性可通过微量稀释法测定，该方法应在微尺度上进行，以便快速高效地评估其抗菌潜力。这种低成本方法可在仅24小时内获得结果，因此适用于在早期阶段确定最佳提取条件，从而针对特定微生物菌株获得生长抑制效果的数据。然而，该方法需要使用带有适用于微生物生长的盖子的无菌微孔板，以及能够在600 nm波长下检测的微孔板读数仪。

  1. 使用未经处理的圆底96孔微量培养板进行肉汤微量稀释试验，每孔加入170 µL Mueller-Hinton肉汤（MHB），并接种10 µL标准浓度菌液（0.5麦氏比浊标准）和20 µL各提取物（50 mg/mL）。
  2. 将培养板在各菌株最适生长温度下孵育24小时。
  3. 通过检测可见浊度的降低来判断抗菌活性，使用酶标仪在0小时和24小时测定光密度（OD600）。
  4. 以抑制率的百分比表示结果：
    抑制率计算公式：%抑制率 = [1-(Abs.ext/Abs)]×100；分析方法示意图。
    其中Abs. ext表示含细菌菌株与提取物共同培养的孔中，0小时与24小时之间吸光度的差值；Abs表示含细菌菌株与溶剂的孔中相应的吸光度差值。
  5. 本方法需设置对照反应：包括仅含培养基的孔作为阴性对照，以及含接种标准菌株并添加溶剂（乙醇或水）的孔，同时设置含细菌菌株和阳性对照抗生素（氯霉素）的孔。

6. 抗氧化活性及总多酚含量的测定

  1. 总多酚含量
    ​注意：总多酚含量（TPC）采用福林-酚法23测定，并适配于微量化操作。
    1. 在避光的96孔微孔板的每个孔中加入158 µL超纯水、2 µL样品和10 µL福林-酚试剂。
      注意：请参阅供应商提供的福林-酚试剂的安全数据表。
    2. 2分钟后，加入30 µL Na2CO3 (20%)。
    3. 在室温下避光孵育1小时后，于755 nm波长下用分光光度计测定样品吸光度。
    4. 以没食子酸（用于绘制标准曲线）或超纯水（2 µL）作为对照。
    5. 结果以没食子酸当量表示（mg GAE/g 提取物）。
  2. 2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）自由基清除活性
    ​注意：提取物的抗氧化活性参照Duan等（2006）24所述方法进行测定，并适配于微量化操作。
    1. 在避光的96孔微孔板中，加入每种样品2 µL（浓度为10 mg/mL）和198 µL溶于无水乙醇中的DPPH溶液（0.1 mM）。
      ​注意：请参阅供应商提供的DPPH试剂的安全数据表。
    2. 在室温避光条件下反应30分钟，使用微孔板分光光度计在517 nm处测定吸光度。
    3. 以2 µL无水乙醇/蒸馏水与198 µL DPPH溶液进行对照反应；以2 µL提取物与198 µL无水乙醇进行空白测定。
    4. 使用以下公式计算DPPH抑制率百分比：
      DPPH抑制公式，方程，抗氧化测定，化学分析，实验室实验。
      其中As为藻类提取物的吸光度，Ab为空白样品的吸光度，Ac为对照的吸光度。

7. 表皮细胞中的细胞毒性评估

注意： 体外 水提物和乙醇提取物的细胞毒性作用 G. gracilis 通过MTT比色法在人角质形成细胞（HaCaT细胞 - 300493）中进行评估，方法如前所述25细胞购自德国细胞系服务公司（Cell Lines Services, Germany, CLS），实验方法严格遵循机构指南及CLS操作说明。
警告：请参阅供应商提供的MTT安全数据表

  1. 细胞培养维持
    1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素/抗真菌素溶液（两性霉素B，0.25 mM；青霉素，60 mM；链霉素，100 mM）的高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养 HaCaT 细胞。
    2. 使用胰蛋白酶-EDTA 消化细胞。
      注意：HaCaT 细胞传代应在细胞达到完全汇合后进行。
    3. 将细胞置于37 °C、5% CO2 和95%湿度的培养箱中培养。
    4. 当细胞培养物达到80%-85%汇合度时，根据生物样本库说明进行传代。
  2. 细胞毒性评估
    1. 将细胞接种于96孔板中，过夜培养后，用先前溶于DMSO（100 mg/mL）的干燥提取物处理 HaCaT 细胞（4 × 104 个细胞/孔）。然后，将2 µL提取物溶液加入198 µL培养基中，并将培养板继续孵育24小时。
    2. 移除培养基，向每孔加入100 µL MTT溶液（0.5 mg/mL），在上述常规培养条件下避光孵育30分钟。
    3. 移除MTT溶液，加入100 µL DMSO溶解细胞内生成的甲臜结晶。
    4. 使用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度。结果以未处理对照组细胞的百分比表示。

8. 食品创新

  1. 新型食品产品：海藻意面
    1. 原料选择与意大利面配方设计
      注意：原料的选择是与一家 pasta 公司合作完成的。关键原料的选择（见第 8.2 节）基于其易得性以及与现有生产线的兼容性，并利用海洋资源制备具有额外营养价值的 pasta。
      1. 在确定原料选择后，通过电子表格分析配方的理论化学成分，根据预期的营养价值（膳食纤维、维生素和矿物质来源，低饱和脂肪）设计配方。
      2. 当满足理论要求后，按照8.1.2步骤所述进行实验室规模的生产。
      3. 使用半训练感官评价小组进行感官测试（>10 名品尝者）以验证是否需要重新配方，或确认该配方可进入后续步骤。
        注意：该品评小组此前已接受过意大利面品尝培训，并针对风味、口感、气味、质地和外观等属性对所呈现的配方进行了享乐性评价。
    2. 面条生产
      注意：生产 Chifferi 使用意大利面挤出机制备意大利面样品。
      1. 在设备中，混合先前确定份量的米粉， G. gracilis 和 Chlorella vulgaris，向混合物中加入约30%的水。
      2. 为了获得干意大利面，需进行干燥处理 奇费里 在 68 °C 42分钟，随后5小时30分钟 76 °C，模拟一个工业过程。
      3. 最后，将样品包装并真空密封，于室温避光处保存，待进一步分析。
    3. 营养分析
      注意：进行营养成分分析时，需使用干燥并研磨的样品，每组设三个重复。
      1. 粗蛋白含量：通过总蛋白测定法进行检测 凯氏定氮法 方法，改编自 Duarte 等人（2022）26，执行步骤 8.1.3.2-8.1.3.6。
      2. 准确称取1.0 g样品（空白试验用蒸馏水），加入两片凯氏定氮片和25 mL H2SO4 在消化管中。
        警告：请参阅 H 的安全数据表2SO4 由供应商提供。
      3. 在凯氏定氮消化器中进行样品消化 220 °C 30分钟，随后90分钟 400 °C.
      4. 冷却至室温后，加入80 mL蒸馏水，并将生成的氨蒸馏至30 mL 4% H3BO3 含有溴甲酚绿和甲基红的溶液。该步骤在碱性条件下进行（使用40% NaOH进行蒸馏，采用 凯氏定氮法 蒸馏器
        警告：请参阅 H 的安全数据表3BO3 含有溴甲酚绿、甲基红和40% NaOH的溶液，由供应商提供。
      5. 用 0.1 M HCl 滴定蒸馏后的样品，直至观察到颜色变为灰粉色。
      6. 根据以下公式计算粗蛋白含量，该含量以样品的氮含量表示，并以每100克样品中的克数（g/100 g）表示：
        静力平衡方程，ΣFx=0，示意图，物理教学，受力平衡计算
        其中 Vs 对应于样品滴定中所用 HCl 体积（mL）；Vb 对应空白试验所用体积；N 对应 HCl 的当量浓度；w 对应样品重量（g）。
      7. 总脂肪含量：采用Folch法测定总脂肪含量，该方法改编自Folch等（1957）的研究。27，执行步骤 8.1.3.8-8.1.3.14。
      8. 通过混合 CHCl₃ 和 MeOH 制备 Folch 试剂3 且甲醇的比例为2:1（v:v）。
        警告：请参阅供应商提供的Folch试剂安全数据表。
      9. 向含有1 g样品的试管中加入5 mL Folch试剂和0.8 mL蒸馏水，涡旋混合1分钟。
      10. 然后，加入另外5 mL Folch试剂，匀浆5分钟。加入1.2 mL 0.8% NaCl溶液，匀浆2分钟。.
      11. 以 7000 x g 10 分钟。将有机相（下层）通过亲水性棉花和无水硫酸钠过滤至圆底玻璃烧瓶中。
      12. 为避免样品损失，重复加入5 mL CHCl的步骤3，均质化、离心和过滤均在相同条件下进行。
      13. 通过减压蒸发去除收集的有机相中的有机溶剂，并置于烘箱中干燥 105 °C 孵育4小时。将样品置于干燥器中冷却。
      14. 使用以下公式计算脂肪含量，以每100克中的克数（g/100 g）表示：
        总脂肪含量公式，\(Total \, fat \,(g/100 \, g) = \frac{W_3-W_1}{W_2} \times 100\)，方程。
        其中 W1 为空的圆底玻璃烧瓶重量；W2 是样品的初始重量；W3 是装有样品的圆底玻璃烧瓶。
      15. 粗纤维含量：采用依据ISO 6865 (2000) 修订的方法测定粗纤维含量28，按照步骤 8.1.3.16-8.1.3.22。
      16. 称取1 g样品（W0）于带滤底的玻璃坩埚（参考编号P2）中，放入纤维分析仪。
      17. 第一步是酸水解：加入150 mL 1.25% H2SO4，预热后，加入2 mL消泡剂（n-octanol）加入每个坩埚的柱中；加热至沸腾，保持30分钟。
      18. 除去溶剂后，用去离子水洗涤三次，然后进行碱性水解。向无液体的柱中加入150 mL预热的1.25% NaOH溶液和5 mL消泡剂，加热程序与酸水解相同。
      19. 最后，用150 mL丙酮对冷提取物进行三次洗涤。
      20. 完成此步骤后，小心地将坩埚从系统中取出，并放入烘箱中 150 °C 1小时。记录最终重量（W1）。
      21. 将坩埚放入马弗炉中 500 °C 3小时后记录最终重量（W2）。
      22. 计算粗纤维含量，并使用以下公式将结果表示为百分比：
        %粗纤维 = 100 × (W1 - W2) / W0
      23. 脂肪酸（FA）谱分析：根据 Fernández 等（2015）的方法测定脂肪酸谱29，执行步骤 8.1.3.24-8.1.3.29。
        注意：脂肪酸甲酯（FAMEs）通过冷冻干燥研磨样品的直接酸催化转甲基化反应获得。所有分析均设三个重复。
      24. 加入2 mL 2%（v/v）H2SO4 将甲醇溶液加入50 mg样品中，混匀后倾入 80 °C 持续搅拌2小时。
        警告：请参阅供应商提供的甲醇安全数据表。
      25. 冷却至室温后，加入1 mL超纯水和2 mL n-向每个样品中加入正庚烷，涡旋混合1分钟，然后离心5分钟。
        警告：请参阅供应商提供的正庚烷安全数据表。
      26. 回收上清液 n将含有脂肪酸甲酯（FAMEs）的正庚烷相（有机相）转移至气相色谱（GC）进样瓶中。
      27. 使用配备 TR-FAME 毛细管柱（60 m × 0.25 mm ID）的气相色谱仪进行分析， 0.25 µm 膜厚度）、自动进样器和火焰离子化检测器（FID）
      28. 将进样器（不分流模式）设置为 250 °C 和检测器位于 280 °C将色谱柱的初始温度设置为 75 °C 并保持1分钟。然后以 5 °C/分钟 170 °C 并保持10分钟。然后升温至 5 °C/分钟 190 °C 并再保持10分钟。最后，升温至 2 °C/分钟 240 °C 并保持10分钟。使用氦气作为载气，流速为1.5 mL/min。空气和氢气的流速分别为350 mL/min和35 mL/min。
      29. 通过将所得保留时间与标准品进行比较来确定脂肪酸谱型，并将结果表示为总脂肪的百分比。
      30. 矿物质元素谱分析：采用经Pinto等（2022）方法改进的程序，通过电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定样品中钙（Ca）、磷（P）、镁（Mg）、钠（Na）、钾（K）、铁（Fe）、铜（Cu）、锰（Mn）、锌（Zn）等矿物质元素含量。30，按照步骤 8.1.3.31-8.1.3.34。
      31. 准确称取每种干燥样品约0.4 g，加入7.5 mL HNO₃3 和 2.5 mL HCl。
        警告：请参阅 HNO 的安全数据表3 以及供应商提供的 HCl。
      32. 消化过程分为两个阶段：将温度从室温升至 90 °C 30分钟（并在该温度下继续维持30分钟），随后在60分钟内于 105 °C.
      33. 冷却样品溶液，定容至25 mL，过滤后置于带标签的试管中保存。每次消解过程中，同时对标准参考物质和空白样品进行相同处理。采用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定各元素的浓度。
      34. 以每100克鲜重（fw）中的毫克数（mg）表示结果。
      35. 碳水化合物含量：按照步骤 8.1.3.36–8.1.3.37 计算碳水化合物含量。
      36. 根据联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization, FAO；2003）的方法，利用以下公式，通过此前测定的各组分含量之差计算每100 g样品中的可利用碳水化合物（不包括膳食纤维）含量。31
        总碳水化合物计算公式：总碳水化合物 = 100 -（蛋白质 + 脂肪 + 灰分 + 水分 + 膳食纤维）。
      37. 以每100克中的克数（g/100 g）表示结果。
      38. 水分和灰分含量：按照步骤 8.1.3.39–8.1.3.45 测定水分和灰分含量。
      39. 将瓷坩埚在指定条件下孵育 3 h 105 °C，放入干燥器中冷却并称重。
      40. 将10 g样品称量至坩埚中，并置于干燥烘箱内 105 °C 每次3小时循环，直至连续几次称重的数值差异不超过10 mg。
      41. 使用以下公式计算水分含量，以每100 g鲜重（fw）中的克数（g/100 g fw）表示：
        水分含量公式，用于计算物质中水比例的方程，分析化学。
        其中 W1 为空坩埚的质量，W2 为坩埚与新鲜样品的总重量，W3 坩埚加干燥样品的重量。
      42. 水分含量测定完成后，将装有干燥样品的坩埚放入马弗炉中 525 °C 4小时。
      43. 重复此步骤，直至连续几次称重结果之间的差异不超过1 mg。
      44. 将样品在干燥器中冷却至室温，然后称重。
      45. 使用以下公式计算灰分含量，以每100克鲜重（fw）中的克数（g/100 g fw）表示：
        灰分含量计算公式；样品中灰分百分比的测定方程；科学计算
        其中 W1 为空坩埚的重量，W2 是装有新鲜样品的坩埚重量，W3 是带重量的坩埚的重量。
      46. 能量值：按照步骤 8.1.3.47-8.1.3.48 计算能量值。
      47. 根据欧盟法规《向消费者提供食品信息》（法规 1169/2011）计算样品的能量值32，使用以下公式：
        能量（kcal/100 g）= 4 × （克蛋白质）+ 4 × （克碳水化合物）+ 9 × （克脂肪）+ 2 × （克纤维）
        能量（kJ/100 g）= 17 × （克 蛋白质）+ 17 × （克 碳水化合物）+ 37 × （克 脂肪）+ 8 × （克 纤维）
      48. 以每100克的千卡和千焦表示结果。
    4. 消费者接受度
      1. 使用蒸馏水煮8分钟的意大利面样品评估消费者接受度。
      2. 进行消费者接受度测试：评价样品的外观、颜色、质地、气味、海味、总体口感、总体评价及购买意愿。
        注意：消费者可接受性测试基于享乐型测试，对视觉外观、颜色、质地、气味、海味、总体口感、总体评价及购买意愿进行1-9级评分，其中1分为评价极差，9分为评价极佳。
      3. 在感官分析实验室的独立感官检测间（具备温控和照明控制）内进行感官测试。提供餐具、餐巾以及矿泉水玻璃杯，用于在样品间清洁 palate（味觉）。
        注意：品尝者年龄为16至64岁，来自不同背景（n > 80).
  2. 酸奶
    1. 色素提取
      注意：通过 Pereira 等（2020）所述的方法进行色素提取18.
      1. 配制提取溶剂：0.1 M 磷酸钠缓冲液，包含磷酸氢二钠（0.03 M）和磷酸二氢钠（0.07 M）。使用 NaOH 或 HCl 将 pH 调至 6.8。
      2. 称取1 g G. gracilis 加入50 mL磷酸钠缓冲液（pH 6.8），匀浆10分钟，随后用研钵和研杵研磨10分钟。
      3. 将溶液转移至离心管中，在12,298 x g条件下离心20分钟 g (4 °C).
      4. 合并上清液，并缓慢加入65%硫酸铵。待硫酸铵完全溶解后，用铝箔覆盖溶液，静置沉淀 4 °C 过夜。
        警告：请参阅供应商提供的硫酸铵安全数据表。
      5. 将沉淀物在 12,298 x g 条件下离心 20 分钟 g (4 °C回收沉淀，并溶于蒸馏水（约5 mL）中。
      6. 使用透析管膜（14 kDa）对提取物进行透析，以水为透析液持续24小时，随后进行冷冻干燥。将冻干后的提取物避光保存于 4 °C 直至使用。
    2. 酸奶制备
      1. 在恒温混合器中将1 L巴氏灭菌牛奶、120 g天然酸奶、20 g蔗糖和50 g奶粉混合，搅拌5 min，制备天然酸奶。 50 °C，速度 3
      2. 将混合物放入恒温混匀仪的离心管中，置于培养箱内 37 °C 12 小时。
      3. 将提取物以0.21%的浓度混入酸奶中，将样品分别储存于玻璃烧瓶中 4 °C 直至分析前。
      4. 将不含色素的酸奶分装样品（对照组）储存于 4 °C 直至分析前。
    3. 颜色稳定性
      注意：通过色度分析评估色素在酸奶中12天内的稳定性。使用反射式色差计进行色度分析，采用2°标准观察者和D65光源。结果以CIELab坐标表示，包括L*（明度，黑-白，0-100）、a*（绿-红，-60-60）和b*（蓝-黄，-60-60）参数。a*值为正时表示偏红色调，为负时表示偏绿色调；b*值为正时表示偏黄色调，为负时表示偏蓝色调。L*为明度参数，表示颜色在黑白灰度等级间的相对亮度特性。33.
      1. 使用制造商提供的白色陶瓷板（L* 88.5，a* 0.32，b* 0.33）校准色度计。
      2. 将约28 g样品（或对照）装入细胞中，使用颜色数据分析软件分析颜色。
        注意：用于颜色数据分析的软件为 SpectraMagic NX。
      3. 在样本/对照组的三复孔中各进行5次读数。
    4. 感官分析
      注意：采用三角检验法（ISO 4120, 2004）对添加色素的酸奶进行感官评价34 对颜色、味道及整体喜好度的享乐性评价。
      1. 三角检验中，向评价人员提供三个样品（一个添加色素的酸奶样品和两个对照样品，或两个添加色素的酸奶样品和一个对照样品），要求他们根据香气、质地和味道选择出不同的样品。所提供的样品应体积相近，并用随机的三位数字编码标识。
      2. 对于添加色素的酸奶进行享乐性评价时，向评价小组提供一份含色素的酸奶样品，要求他们使用9点享乐量表（从极不喜欢到极喜欢）对样品的颜色、味道及整体喜好程度进行评价。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

抗菌活性

在解读实验结果时，应注意抑制率越高，表明该提取物对特定菌株生长的抑制效果越强，因而作为抗菌剂的潜力也越大。通过该方法，我们能够快速鉴定出对某些细菌菌株具有较强活性的提取物，同时筛选出在后续应用方面更具研究价值的提取物，从而为针对该提取物的进一步研究提供起点。

图1展示了水提物的提取结果，包括在生物量干燥后立即进行的第一和第二次水提（图1A），以及在乙醇提取后进行的第三和第四次水提结果（图1B），后者为对生物量的综合利用。可以看出，最具意义的结果来自第三和第四次水提，其抗菌活性更高，尤其是在70 °C条件下获得的提...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

在液体培养基中进行的抗菌活性试验用于评价抗菌物质对悬浮于液体培养基中微生物的作用效果，通常用于测定某种物质抑制或杀灭微生物的能力35,36,37,38。该类试验用于评估微生物对抗菌剂的敏感性，通常在试管或微量滴定板中进行，其中将不同浓度的抗菌物质与标准化的靶向微生物悬液共同孵育22。在适当的孵育时间后，通过测定微生物的生长情况或培养基中浊度的有无来评估抗菌活性。

进行这些检测的方法有多种，例如肉汤稀释法、琼脂扩散法（如纸片扩散试验）以及肉汤微量稀释法，其中肉汤微量稀释法是目前应用最广泛的方法之一38。这些方法中一些最关键的环节包括接种物的正确制备、培养基的选择、所用抗菌药物的质量、技术操作的标准化以及有效的污染控制。接种物是一种标准化...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由葡萄牙科学技术基金会（FCT）通过授予海洋与环境科学中心（MARE-Marine and Environmental Sciences Centre）的战略项目（UIDP/04292/2020 和 UIDB/04292/2020）以及联合实验室 ARNET（LA/P/0069/2020）提供支持。FCT 还资助了授予 Marta V. Freitas（UI/BD/150957/2021）和 Tatiana Pereira（2021.07791.BD）的个人博士奖学金。本工作还获得了项目 HP4A - HEALTHY PASTA FOR ALL（共促项目编号 039952）的财政支持，该项目由欧洲区域发展基金（ERDF）共同资助，并通过葡萄牙 2020 计划下的 COMPETE 2020 - 竞争力与国际化运营计划实施。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无水乙醇Aga，葡萄牙64-17-5
氯化铵PanReac12125-02-9
两性霉素BSigma-Aldrich1397-89-3
分析天平Sartorius，TE124S22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii德国微生物与细胞培养保藏中心（DSMZ）DSM 347
生物素Panreac AppliChem58-85-5
离心机Eppendorf，5810R5811JH490481
氯霉素PanReac56-75-7
CO2 培养箱MemmertN/A
冷白色荧光灯OSRAM Lumilux SkywhiteN/A
麦氏比浊仪Grant InstrumentsN/A
DMEM培养基Sigma-AldrichD5796
DMSOSigma-Aldrich67-68-5
DPPHSigma，Steinheim，德国1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922)德国微生物与细胞培养保藏中心（DSMZ）DSM5922
96%乙醇AGA-葡萄牙64-17-5
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（Na2EDTA）J.T.Baker6381-92-6
胎牛血清（FBS）Sigma-AldrichF7524
滤纸（Whatman No.1）WhatmanWHA1001320
烧瓶VWR International，Alcabideche，葡萄牙 N/A
福林-酚试剂VWR Chemicals31360.264
没食子酸 Merck149-91-7
四氧化锗（99.999%）AlfaAesar1310-53-8
HaCaT细胞 – 300493CLS-Cell Lines Services，德国 300493
磁力搅拌加热板IKA，C-MAG HS706.090564
硫酸亚铁VWR Chemicals10124-49-9
超净工作台TelStar，葡萄牙526013
LB培养基 VWR ChemicalsJ106
Listonella anguillarum德国微生物与细胞培养保藏中心（DSMZ） DSM 21597
氯化锰VWR Chemicals7773.01.5
微量移液器 Eppendorf，葡萄牙N/A
微孔板VWR International，Alcabideche，葡萄牙 10861-666
微孔板Greiner738-0168
无菌微孔板Fisher Scientific10022403
酶标仪 Epoch Microplate Spectrophotometer，BioTek，佛蒙特州，美国1611151E
MTTSigma-Aldrich289-93-1
穆勒-欣顿肉汤（MHB）VWR Chemicals90004-658
烘箱Binder，FD11512-04490
烘箱Binder，BD11504-62615
青霉素Sigma-Aldrich1406-05-9
pH计 Inolab VWR International，Alcabideche，葡萄牙 15212099
移液器吸头Eppendorf，葡萄牙5412307
Pyrex培养基储存瓶 VWR International，Alcabideche，葡萄牙 16157-169
旋转蒸发仪Heidolph，Laborota 400080409287
旋转蒸发仪IKA HB10，VWR International，Alcabideche，葡萄牙07.524254
碳酸钠（Na2CO3）Chem-Lab497-19-8
氯化钠（NaCl） Normax Chem7647-14-5
磷酸氢二钠Riedel-de Haën7558-79-4
SpectraMagic NXKonica Minolta，日本颜色数据分析软件
分光光度计Evolution 201，Thermo Scientific，麦迪逊，威斯康星州，美国5A4T092004
链霉素Sigma-Aldrich57-92-1
硫胺素Panreac AppliChem59-43-8
胰蛋白酶-EDTASigma-AldrichT4049
胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）VWR ChemicalsICNA091010617
胰蛋白酶大豆肉汤（TSB） VWR Chemicals22091
超纯水 Advantage A10 Milli-Q lab，Merck，达姆施塔特，德国F5HA17360B
真空泵Buchi，瑞士FIS05-402-103
维生素B12Merck68-19-9

参考文献

  1. Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
  2. Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
  3. Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. Seaweed Ecology and Physiology. (second). , Cambridge University Press, UK. (2014).
  4. Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562(2021).
  5. Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
  6. Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516(2021).
  7. Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O'Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
  8. Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. Ravishankar, G., Ambati, R. R. , 1st ed, CRC Press, Boca Raton, Florida. (2019).
  9. Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
  10. Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81(2016).
  11. Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492(2018).
  12. Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
  13. Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. , Elsevier. 299-341 (2023).
  14. Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , Intechopen. 111822(2023).
  15. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  16. Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
  17. Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769(2023).
  18. Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688(2020).
  19. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. , Connecticut Sea Grant, University of Connecticut. (2014).
  20. Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
  21. Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
  22. NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, 11th ed, Wayne, PA, USA. M02-M11 (2012).
  23. Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
  24. Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
  25. Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611(2020).
  26. Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
  27. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  28. ISO 6865. Animal feeding stuffs - Determination of crude fibre content - Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
  29. Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
  30. Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482(2022).
  31. FAO. Food energy - methods of analysis and conversion factors. , FAO Food and Nutrition Paper 77 at https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003).
  32. Regulation (EU) Nr. 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011. 25, https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011).
  33. Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
  34. ISO 4120. Sensory analysis - Methodology - Triangle test. International Standard. , https://www.iso.org/standard/33495.html (2004).
  35. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  36. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
  37. Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427(2022).
  38. Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068(2023).
  39. Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364(2017).
  40. Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642(2020).
  41. Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380(2021).
  42. Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
  43. Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431(2021).
  44. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827(2021).
  45. Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

海藻提取生物活性化合物抗氧化活性细胞毒性检测感官分析脂肪酸谱食品强化
通过生物炼制方法对红藻Gracilaria gracilis进行高值化利用
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。