本文描述了几种旨在对Gracilaria gracilis进行综合开发利用的实验方案：野生种群的采收、室内培养以及生物活性成分的提取。同时评估了提取物的抗氧化、抗菌和细胞毒性作用，并对添加了全藻类生物量及色素的食品进行了营养成分和稳定性评价。
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本文内容
摘要
摘要
人们对海藻作为获取高价值且具有多靶点生物活性成分的丰富原料的兴趣正在持续增长。在本研究中，我们探讨了Gracilaria gracilis的潜力，这是一种在全球范围内广泛养殖的可食用红藻，因其在商业上可作为琼脂及其他用于化妆品、药物、食品和饲料应用成分的来源而备受关注。
G. gracilis 通过营养繁殖和孢子形成，并在调控理化条件以获得大量生物量的基础上，优化了生长条件。采用乙醇和水对海藻生物量进行了绿色提取。通过一系列实验评估了提取物的生物活性潜力 体外 有关其细胞毒性、抗氧化性和抗菌特性的检测。此外，将干燥的海藻生物质掺入意大利面配方中，以提高食品的营养价值。从海藻中提取的色素 G. gracilis 还被作为天然着色剂添加到酸奶中，并对其稳定性进行了评估。两种产品均提交给半熟练感官评价小组进行品评，旨在上市前确定最佳的最终配方。
研究结果支持G. gracilis在作为完整生物量、提取物和/或色素应用时所具备的多功能性。通过实施多种优化后的实验方案，本研究推动了具有潜力的产品开发，可用于食品、化妆品和水产养殖市场，促进环境可持续性以及蓝色循环经济的发展。
此外，根据生物炼制的理念，残留的海藻生物质将被用作促进植物生长的生物刺激剂，或转化为碳材料，用于葡萄牙马雷-莱里亚理工学院室内水产养殖系统的水净化。
引言
海藻可被视为一种具有潜力的天然原材料，可在制药、食品、饲料和环境领域得到充分利用。它们能够生物合成多种分子，其中许多是陆地生物所不具备的，并具有重要的生物学特性1,2。然而，需要建立针对海藻优化的培养方案，以确保获得充足的生物量。
培养方法必须始终考虑海藻叶状体的特性和整体形态。Gracilaria gracilis 是一种克隆型分类群，意味着其附着器官可产生多个营养轴。因此可通过碎片化（营养繁殖）实现繁殖，因为每个营养轴均能完全独立于母体叶状体而生存3。克隆型分类群可成功结合简单快速的单步培养方法，通过将叶状体分割成小片段获得大量生物量，这些片段能迅速再生并生长为新的、基因完全相同的个体。在此过程中，单倍体和二倍体叶状体均可使用。尽管该属具有复杂的单双倍体同形三相生活史，但除非需要通过遗传更新种群以获得更优良的品系，否则通常无需进行孢子形成。在此情况下，四分孢子（通过减数分裂形成的单倍体孢子）和果孢子（通过有丝分裂形成的二倍体孢子）均可发育为宏观叶状体，随后可通过营养繁殖进行培养和扩增4。生长周期受环境条件和个体生理状态等多种生物因素（如附生生物的出现及其他生物的附着）共同调控。因此，优化培养条件对于确保高生产力和获得高质量生物量至关重要
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方案
1. 生物量收获与制备
- 在退潮期间采集G. gracilis样本，并迅速将其置于避光、冷却的容器中运输至实验室，避免干燥、光照和空气暴露。
- 在实验室内，用流动的海水冲洗每个藻体，并彻底清洗以去除表面的碎屑、坏死组织、附生生物及其他附着生物。
- 将野外采集的生物量置于气候培养室（20 ± 1 °C）中，使用持续充气的海水（盐度31–35 psu），并以日光型冷白色荧光灯提供低光照强度，光周期设定为16:08（光照：黑暗），持续7天。在此期间不添加任何营养培养基，使海藻逐步适应室内培养条件。
2. 菌种保藏
- 驯化期结束后，使用无菌刀片切割海藻叶状体的健康顶端。根据 Redmond 等（2014）19 的方法，在无菌条件下，将每个顶端在预先制备于培养皿中的琼脂凝胶（1.0% 细菌学琼脂，以1:1的蒸馏水/海水比例配制）上拖过，以去除任何残留污染物。每个顶端需重复进行三次琼脂拖带操作，并始终将顶端拖过琼脂凝胶中未使用过的区域。
- 用盐酸溶液（HCl，15%）清洗玻璃器皿，并用蒸馏水彻底冲洗。将清洁过程中使用的所有工具、玻璃器皿、琼脂、海水和蒸馏水通过高压灭菌器进行灭菌（121 °C，15 分钟）。
警告：请参阅供应商提供的 HCl 安全数据表。 - 顶端在灭菌海水中培养，盐度为....
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结果
抗菌活性
在解读实验结果时，应注意抑制率越高，表明该提取物对特定菌株生长的抑制效果越强，因而作为抗菌剂的潜力也越大。通过该方法，我们能够快速鉴定出对某些细菌菌株具有较强活性的提取物，同时筛选出在后续应用方面更具研究价值的提取物，从而为针对该提取物的进一步研究提供起点。
图1展示了水提物的提取结果，包括在生物量干燥后立即进行的第一和第二次水提（图1A），以及在乙醇提取后进行的第三和第四次水提结果（图1B），后者为对生物量的综合利用。可以看出，最具意义的结果来自第三和第四次水提，其抗菌活性更高，尤其是在70 °C条件下获得的提.......
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讨论
在液体培养基中进行的抗菌活性试验用于评价抗菌物质对悬浮于液体培养基中微生物的作用效果，通常用于测定某种物质抑制或杀灭微生物的能力35,36,37,38。该类试验用于评估微生物对抗菌剂的敏感性，通常在试管或微量滴定板中进行，其中将不同浓度的抗菌物质与标准化的靶向微生物悬液共同孵育22。在适当的孵育时间后，通过测定微生物的生长情况或培养基中浊度的有无来评估抗菌活性。
进行这些检测的方法有多种，例如肉汤稀释法、琼脂扩散法（如纸片扩散试验）以及肉汤微量稀释法，其中肉汤微量稀释法是目前应用最广泛的方法之一38。这些方法中一些最关键的环节包括接种物的正确制备、培养基的选择、所用抗菌药物的质量、技术操作的标准化以及有效的污染控制。接种物是一种标准化.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由葡萄牙科学技术基金会（FCT）通过授予海洋与环境科学中心（MARE-Marine and Environmental Sciences Centre）的战略项目（UIDP/04292/2020 和 UIDB/04292/2020）以及联合实验室 ARNET（LA/P/0069/2020）提供支持。FCT 还资助了授予 Marta V. Freitas（UI/BD/150957/2021）和 Tatiana Pereira（2021.07791.BD）的个人博士奖学金。本工作还获得了项目 HP4A - HEALTHY PASTA FOR ALL（共促项目编号 039952）的财政支持，该项目由欧洲区域发展基金（ERDF）共同资助，并通过葡萄牙 2020 计划下的 COMPETE 2020 - 竞争力与国际化运营计划实施。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无水乙醇 | Aga，葡萄牙 | 64-17-5 | |
| 氯化铵 | PanReac | 12125-02-9 | |
| 两性霉素B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| 分析天平 | Sartorius，TE124S | 22105307 | |
| Bacillus subtilis subsp. spizizenii | 德国微生物与细胞培养保藏中心（DSMZ） | DSM 347 | |
| 生物素 | Panreac AppliChem | 58-85-5 | |
| 离心机 | Eppendorf，5810R | 5811JH490481 | |
| 氯霉素 | PanReac | 56-75-7 | |
| CO2 培养箱 | Memmert | N/A | |
| 冷白色荧光灯 | OSRAM Lumilux Skywhite | N/A | |
| 麦氏比浊仪 | Grant Instruments | N/A | |
| DMEM培养基 | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
| DPPH | Sigma，Steinheim，德国 | 1898-66-4 | |
| Escherichia coli (DSM 5922) | 德国微生物与细胞培养保藏中心（DSMZ） | DSM5922 | |
| 96%乙醇 | AGA-葡萄牙 | 64-17-5 | |
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（Na2EDTA） | J.T.Baker | 6381-92-6 | |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| 滤纸（Whatman No.1） | Whatman | WHA1001320 | |
| 烧瓶 | VWR International，Alcabideche，葡萄牙 | N/A | |
| 福林-酚试剂 | VWR Chemicals | 31360.264 | |
| 没食子酸 | Merck | 149-91-7 | |
| 四氧化锗（99.999%） | AlfaAesar | 1310-53-8 | |
| HaCaT细胞 – 300493 | CLS-Cell Lines Services，德国 | 300493 | |
| 磁力搅拌加热板 | IKA，C-MAG HS7 | 06.090564 | |
| 硫酸亚铁 | VWR Chemicals | 10124-49-9 | |
| 超净工作台 | TelStar，葡萄牙 | 526013 | |
| LB培养基 | VWR Chemicals | J106 | |
| Listonella anguillarum | 德国微生物与细胞培养保藏中心（DSMZ） | DSM 21597 | |
| 氯化锰 | VWR Chemicals | 7773.01.5 | |
| 微量移液器 | Eppendorf，葡萄牙 | N/A | |
| 微孔板 | VWR International，Alcabideche，葡萄牙 | 10861-666 | |
| 微孔板 | Greiner | 738-0168 | |
| 无菌微孔板 | Fisher Scientific | 10022403 | |
| 酶标仪 | Epoch Microplate Spectrophotometer，BioTek，佛蒙特州，美国 | 1611151E | |
| MTT | Sigma-Aldrich | 289-93-1 | |
| 穆勒-欣顿肉汤（MHB） | VWR Chemicals | 90004-658 | |
| 烘箱 | Binder，FD115 | 12-04490 | |
| 烘箱 | Binder，BD115 | 04-62615 | |
| 青霉素 | Sigma-Aldrich | 1406-05-9 | |
| pH计 Inolab | VWR International，Alcabideche，葡萄牙 | 15212099 | |
| 移液器吸头 | Eppendorf，葡萄牙 | 5412307 | |
| Pyrex培养基储存瓶 | VWR International，Alcabideche，葡萄牙 | 16157-169 | |
| 旋转蒸发仪 | Heidolph，Laborota 4000 | 80409287 | |
| 旋转蒸发仪 | IKA HB10，VWR International，Alcabideche，葡萄牙 | 07.524254 | |
| 碳酸钠（Na2CO3） | Chem-Lab | 497-19-8 | |
| 氯化钠（NaCl） | Normax Chem | 7647-14-5 | |
| 磷酸氢二钠 | Riedel-de Haën | 7558-79-4 | |
| SpectraMagic NX | Konica Minolta，日本 | 颜色数据分析软件 | |
| 分光光度计 | Evolution 201，Thermo Scientific，麦迪逊，威斯康星州，美国 | 5A4T092004 | |
| 链霉素 | Sigma-Aldrich | 57-92-1 | |
| 硫胺素 | Panreac AppliChem | 59-43-8 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| 胰蛋白酶大豆琼脂（TSA） | VWR Chemicals | ICNA091010617 | |
| 胰蛋白酶大豆肉汤（TSB） | VWR Chemicals | 22091 | |
| 超纯水 | Advantage A10 Milli-Q lab，Merck，达姆施塔特，德国 | F5HA17360B | |
| 真空泵 | Buchi，瑞士 | FIS05-402-103 | |
| 维生素B12 | Merck | 68-19-9 |
参考文献
- Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
- Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R.
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