基于转录组学的低成本药物筛选

摘要

本方案描述了从ex vivo或in vitro细胞培养到转录组数据预处理的工作流程，用于低成本的基于转录组的药物筛选。

摘要

转录组学能够 全面深入地揭示细胞程序及其对扰动的响应。尽管在过去十年中，文库构建和测序的成本显著降低，但将这些技术应用于药物筛选所需的规模时，其费用仍然过高，限制了这些方法巨大潜力的发挥。本研究提出了一种基于转录组的低成本药物筛选系统，结合了微型化扰动培养与微型批量转录组学（mini-bulk transcriptomics）技术。优化后的微型批量转录组学方案可在经济的测序深度下获得具有生物学意义的信号，从而实现对已知药物和新分子的大规模筛选。根据所选处理方式和孵育时间，该方案可在约2天内完成测序文库的制备。由于本方案中设置了多个可暂停的步骤，文库构建和测序可在不同时间点独立进行。该方法支持高通量样本的并行处理，已成功测试同时处理多达384个样本，且未出现数据质量下降。尽管不同药物的最佳孵育时间可能存在差异，但该方法对处理条件和/或药物数量尚无已知限制。

引言

新药研发是一个复杂且耗时的过程，涉及潜在药物及其靶点的识别、候选药物的优化与合成，以及在临床前和临床试验中对其有效性和安全性的测试¹。传统的药物筛选方法，即对候选化合物库进行系统性评估以寻找治疗用途的方法，通常采用动物模型或基于细胞的检测手段来测试化合物对特定靶点或通路的作用。尽管这些方法在发现候选药物方面已取得成功，但往往无法充分揭示药物疗效背后的复杂分子机制，同时也难以阐明潜在的毒性及副作用机制。

评估全基因组范围的转录状态为克服当前药物筛选的局限性提供了一种强有力的方法，因为它能够全面评估药物处理后基因表达的变化²。通过以全基因组方式测量特定时间点表达的RNA转录本，转录组学旨在提供药物诱导的转录变化的整体视图，包括基因表达模式的改变、可变剪接以及非编码RNA的表达变化³。这些信息可用于确定药物靶点、预测药物疗效和毒性，并优化药物剂量和治疗方案。

将转录组学与无偏倚药物筛选相结合的主要优势之一，是有可能发现此前未被考虑的新型药物靶点。传统的药物筛选方法通常集中于已确立的靶分子或信号通路，这限制了新靶点的发现，并可能导致药物产生意想不到的副作用以及疗效受限。转录组学可通过揭示药物处理后发生的分子变化，克服这些局限性，从而发现可能此前未被关注的潜在靶点或信号通路

方案

本方案遵循波恩大学当地伦理委员会的指导原则。

1. 缓冲液、溶液和仪器的准备

1. 准备 材料表 中所述的溶液并收集所需材料。
2. 将水浴加热至 37 °C，并预热完全培养基（RPMI-1640 + 10% 胎牛血清 (FCS) + 1% 青霉素/链霉素）。
3. 细胞收获时使用冰冻磷酸盐缓冲液 (PBS)。
   ​注：操作细胞时应保持环境洁净，以维持无菌状态。

2. 细胞操作

注意：人血中分离的外周血单个核细胞（PBMC）的详细冻存方案可参见文献⁷。

1. 细胞解冻与计数
   1. 从液氮中取出冻存管，在水浴中解冻 37 °C 轻柔倒置 2 - 3 分钟。
   2. 将解冻的细胞转移至50 mL离心管中。
   3. 用1 mL温热的完全培养基冲洗冻存管，并将此溶液逐滴加入试管中的细胞（1^st 稀释步骤
   4. 以1:1比例重复稀释，直至总体积达到32 mL（共进行5次稀释，分别加入1、2、4、8和16 mL预热的完全培养基）。添加培养基时应逐滴加入，同时轻轻振....

结果

按照已报道的方案，将人外周血单个核细胞（PBMCs）接种后，用不同的免疫调节药物处理，并在不同孵育时间后收集细胞，采用测序方案进行大规模转录组分析（图1）。

应在本方案之前，借助互补的实验策略并根据具体的科学问题，确定待测化合物的理想药物浓度和孵育时间。在大多数情况下，孵育2 - 4小时和24小时可分别代表药物处理后早期和晚期的转录响应情况。

评估本实验方案正确执行的最重要结果是cDNA和文库的质控（QC）图2 和 图3）。cDNA 谱应具有较宽的分布，平均大小为 > 1000 bp (图2），较低的平均分子量或低分子量下分子的累积图4）可能表明RNA投入量较低或RNA降解。

讨论

药物发现与药物开发可从批量转录组学所提供的细胞过程整体视角中显著受益。然而，由于标准批量RNA测序方案的实验成本较高，该方法常受到限制，从而阻碍了其在学术环境中的应用以及在工业规模上的扩展潜力。

该实验方案中最关键的步骤是细胞复苏以及文库构建的初始步骤。复苏后确保细胞具有较高的存活率，对于后续处理和转录组分析的成功至关重要。从细胞收集到cDNA合成的文库构建初期步骤，对于维持RNA的完整性至关重要。在此阶段，必须始终将细胞裂解物置于冰上，并尽快处理样品。若观察到RNA出现严重降解，应使用特定产品清洁实验台面和仪器，以抑制任何RNase活性。

本文所述方案目前针对健康供体外周血单个核细胞（PBMCs）的药物处理进行了优化，最长处理时间不超过24小时。若使用不同细胞类型或延长孵育时间，可能需要相应优化接种细胞数量和培养条件。

通过本方案，我们提供了一种使用常规实验室设备对药物处理后的外周血单个核细胞（PBMCs）进行转录组分析的工作流程，且无需商业试剂盒。采用该方法并省去RN.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 mL 锥形管	fisher scientific	10203001
粘性 PCR 板密封膜	Thermo Fisher Scientific	AB0558
扩增子片段化混合液（ATM）	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA 文库制备试剂盒（96 样本）
AMPure XP 磁珠	Beckman Coulter	A 63881
Betaine	Sigma-Aldrich	61962
细胞培养级 96 孔板	Thermo Fisher Scientific	260860
细胞培养真空泵（VACUSAFE）	Integra Bioscience	158300
脱氧核苷三磷酸（dNTPs）混合液（每种 10 mM）	Fermentas	R0192
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
DTT（100 mM）	Invitrogen	18064-014
EDTA	Sigma-Aldrich	798681	用于贴壁细胞
乙醇	Sigma-Aldrich	51976
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	26140079
滤芯吸头（10 µL）	Gilson	F171203
滤芯吸头（100 µL）	Gilson	F171403
滤芯吸头（20 µL）	Gilson	F171303
滤芯吸头（200 µL）	Gilson	F171503
盐酸胍	Sigma-Aldrich	G3272
ISPCR 引物（10 µM）	Biomers.net GmbH	SP10006	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix（2X）	KAPA Biosystems	KK2601
氯化镁（MgCl2）	Sigma-Aldrich	M8266
96 孔磁力架	Ambion	AM10027
中和片段化（NT）缓冲液	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA 文库制备试剂盒（96 样本），或替代使用 0.2% SDS
与 Nextera 兼容的索引引物	Illumina
无核酸酶水	Invitrogen	10977049
PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9624
PCR 96 孔板	Thermo Fisher Scientific	AB0600
PCR 板封膜仪	Thermo Fisher Scientific	HSF0031
青霉素/链霉素	Thermo Fisher Scientific	15070063
Qubit 4 荧光计	Invitrogen	15723679
重组 RNase 抑制剂（40 U/µL）	TAKARA	2313A
RPMI-1640 细胞培养基	Gibco	61870036	若非使用 PBMCs，请根据细胞类型调整
SMART dT30VN 引物	Sigma-Aldrich		5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3
常规实验室设备	多种	多种	例如离心机、制冰机、冰桶、蒸馏水、水浴锅
SuperScript II 逆转录酶（SSRT II）	Thermo Fisher Scientific	18064-014
SuperScript II 逆转录酶（SSRT II）缓冲液（5x）	Thermo Fisher Scientific	18064-014
片段化 DNA 缓冲液（TD）	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA 文库制备试剂盒（96 样本）
TapeStation 4200 系统	Agilent	G2991BA
热循环仪（S1000）	Bio-Rad	1852148
TSO-LNA（100 µM）	Eurogentec		5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 混匀仪	Sigma-Aldrich	Z258415