该文章描述了进行杂交链式反应RNA整体荧光染色所需的方法与试剂 原位 通过杂交链式反应RNA全组织荧光原位杂交（HCR RNA WM-FISH）揭示蚊子触角和下颚须中化学感受器基因的空间与细胞分辨率特征。
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本文内容
摘要
摘要
蚊子是致命疾病的高效传播媒介，能够利用其嗅觉附属器官中表达的化学感受受体来导航其化学环境。了解化学感受受体在周围嗅觉附属器官中的空间组织方式，有助于揭示气味在蚊子嗅觉系统中如何被编码，并为防控蚊媒疾病传播提供新思路。第三代杂交链式反应RNA整体荧光原位杂交技术的出现 原位 杂交（HCR RNA WM-FISH）可实现多个化学感受基因的空间定位及同步表达谱分析。本文中，我们描述了一种在样本上逐步实施HCR RNA WM-FISH的方案 按蚊属 蚊子触角和下颚须。我们通过检测离子型嗅觉受体的表达谱，评估了该技术的灵敏度。我们探讨了所描述的HCR WM-FISH技术是否适用于将RNA探针偶联至三种光谱 distinct 的荧光染料，从而进行多重检测。结果表明，HCR RNA WM-FISH具有高度灵敏性，可同时检测触角和下颚须嗅觉附肢中的多种化学感受基因。进一步的研究证实，HCR WM-FISH适用于双重和三重RNA靶标的共表达谱分析。该技术若加以适当改进，还可推广用于其他昆虫物种嗅觉组织或其他附肢中目标基因的定位研究。
引言
冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）等蚊媒依赖其外周嗅觉附器中表达的丰富化学感受基因，在复杂的化学环境中生存，并识别来自人类宿主的行为相关气味、探测花蜜来源以及定位产卵场所1。蚊子的触角和下颚须富含驱动嗅觉附器气味检测的化学感受基因。三类主要的配体门控离子通道介导蚊子嗅觉附器中的气味检测：气味受体（ORs），其需与必需的气味受体共受体（Orco）共同发挥作用；离子型受体（IRs），其与一种或多种IR共受体（IR8a、IR25a和IR76b）相互作用；以及作为三种蛋白复合物发挥作用以检测二氧化碳（CO2）的化学感受味觉受体（GRs）1,2。
RNA 荧光原位杂交是一种检测内源性 mRNA 表达的强大工具3。 该方法通常使用带有荧光标记的单链核酸探针，其序列与目标 mRNA 互补。荧光 RNA 探针与目标 RNA 结合后，即可识别表达特定转录本的细胞。近年来的技术进步使得在完整蚊虫组织中检测转录本成为可能4,5。第一代杂交链式反应（HCR）技术采用基于 RNA 的 HCR 放大器，而第二代方法则改用工程化 DNA 作为 HCR 放大器，从而实现了技术改进6,7。这一升级使信号强度提高了 10 倍，显著降低了生产成本，并大幅提升了试剂的稳定性6,7。
在本方案中，我们描述了第三代 HCR 全组织 RNA 荧光检测技术的应用 原位 用于检测任意基因空间定位与表达的杂交链式反应（HCR RNA WM-FISH）方法8,9该两步法首先利用针对目标 mRNA 的特异性核酸探针，这些探针还包含引发剂识别序列；第二步利用带有荧光标记的发夹结构，其可结合至引发剂序列以扩增荧光信号图1该方法还可实现两个或多个RNA探针的多重检测，并可扩增探针信号，从而促进RNA的检测与定量8可视化化学感受基因在嗅觉附器中表达的转录本丰度及RNA定位模式，可为化学感受基因功能与气味编码提供初步研究线索。
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方案
1. 考虑事项与材料准备
- 确定使用组织全装片还是冷冻切片是否合适。本方案针对无需冷冻切片的埃及伊蚊（Anopheles）触角和下颚须中RNA的全装片原位成像进行了优化。如果样品厚度超过5 mm，建议进行冷冻切片以促进探针渗透。
- 确定目标基因，并从合适的数据库中复制包含内含子和外显子的序列。将基因序列转录为RNA用于合成。
- 确定是从商业供应商购买探针，还是在实验室中自行合成探针。
注：本研究中的原位探针购自商业供应商（见材料表）。或者，也可按照先前报道的方法进行合成10。研究中使用的试剂详见表1。配制试剂所需的材料列于材料表中。
2. 组织预固定
- 使用吸蚊管将10-15只5-10日龄的成年雌性或雄性Anopheles coluzzii蚊子（N'Gousso品系）收集至纸杯或塑料管中，并将其置于装有冰块的容器内，通过低温诱导麻醉。当蚊子完全不动时，表明麻醉成功。
- 用镊子从颈部取下蚊子头部进行断头操作。用非优势手的镊子夹住胸部，用优势手持另一把镊子将颈部与身体分离。将头部放入含有500 µL几丁质酶-糜蛋白酶二甲基亚砜缓冲液（CCD缓冲液）的1.5 mL离心管中，并置于冰上。
注意：冷冻动物可能导致触角变形，建议使用快速冰击麻醉法。实验中蚊子的年龄可根据具体研究项目调整。重要的是需确认并协调其生理状态，例如是否已吸血、饥饿或交配。本研究中，嗅觉附器取自已吸血且已交配的蚊子。 - 将含蚊子头部的离心管在37 ˚C金属加热块中预热CCD缓冲液5分钟，随后将管子转移至杂交炉中，在37 ˚C下旋转孵育。在CCD缓冲液中的孵育时间取决于组织类型：雌性Anopheles触角为20分钟，雄性触角为15分钟，而下颚须则需要较长的孵育时间（1小时）。
- 将离心管中的全部内容物转移至解剖用表面皿中。轻柔地将样品倒入表面皿（解剖皿）的凹槽内。若蚊子头部粘附在管壁上，可用移液器向管内加入CCD缓冲液冲洗出头部。
- 用镊子小心转移头部或在孵育过程中脱落的触角/须肢，并将其固定于1 mL预固定液中。
注意：剩余的CCD缓冲液可在-20 ˚C保存。 该缓冲液最多可重复使用3次。若因组织携带少量CCD缓冲液导致预固定液略呈棕褐色，应更换为新的1 mL固定液。 - 使用振荡器在4 ˚C下将头部在预固定液中振荡固定24小时。
注意：本研究所用振荡器的摇动速度不可调节，采用制造商设定的默认速度（12 rpm）。
3. 组织解剖
- 在冰上用1 mL 0.1% PBS-Tween溶液清洗头部4次（每次5分钟）。为避免样品损失，使用连接加样枪头的移液器去除液体。
注意：可采用两轮快速清洗，随后进行一次10分钟的长时间清洗，最后再进行一次快速清洗，以替代步骤3.1。 - 将管中的头部转移至解剖用表面皿中。轻柔地将样品倒入表面皿的凹槽内。用0.1% PBS-Tween溶液冲洗残留在管内的蚊子头部。
- 在解剖显微镜下，使用尖头镊子从头部取下目标组织（触角/喙下叶）。用镊子夹住头部后部，再用另一把镊子从基部夹住一条触角。用经无RNA酶溶剂润湿的纸巾清洁镊子。采用相同方法去除喙下叶。
- 用镊子将触角和喙下叶转移至置于冰上的无DNA/RNA酶的空管中。将不同组织部分分装至预先标记好的不同管中。
- 在400 µL含有甲醇（MeOH 80%）和二甲基亚砜（DMSO 20%）混合液的溶剂中，室温下脱水1小时。
注意：无需将组织置于摇床上；将其静置于实验台上的试管架中，室温放置即可。建议使用新鲜配制的溶剂混合液。配制500 µL储备液时，混合400 µL MeOH与100 µL DMSO。 - 将脱水试剂更换为400 µL纯甲醇（100%），并在-20 ˚C下过夜脱水。让组织自然沉降，使用移液器去除上清液。
注意：样品可在脱水状态下长期保存，经测试最长可达4个夜晚而无信号损失。
4. 组织后固定
- 在冰上用四步梯度的 400 µL 甲醇/PBS-Tween 溶液对组织进行复水，每步 10 分钟。依次使用 75% 甲醇/25% PBS-Tween、50% 甲醇/50% PBS-Tween、25% 甲醇/75% PBS-Tween，最后使用 100% PBS-Tween。
注意：可使用开口极小的加样枪头移除管中缓冲液，以避免组织丢失。可在解剖显微镜下进行缓冲液的移除。 - 用 400 µL 含 0.1% Tween-20 的磷酸盐缓冲液（PBS-T）在室温下洗涤 10 分钟。将样本置于振荡器上进行洗涤。
- 配制 20 µg/mL 的蛋白酶K溶液，并在 400 µL 该溶液中于室温孵育 30 分钟。
注意：将 20 mg/mL 的蛋白酶K储备液（1000 倍浓缩液）稀释，即 2 µL 加入 2 mL 的 0.1% PBS-Tween 中。剩余溶液可保存于 -20 ˚C 冰箱中。 - 用 400 µL 0.1% PBS-Tween 洗涤两次，每次 10 分钟，以终止组织的酶消化反应。
- 加入 400 µL 后固定液，室温孵育 20 分钟。随后用 400 µL 0.1% PBS-Tween 洗涤三次，每次 15 分钟。
5. 探针杂交
- 将组织在 400 µL 杂交缓冲液中孵育 5 分钟。通过轻轻吹打确保组织完全浸没在缓冲液中。
- 取一份杂交缓冲液，于 37 ˚C 预热 30 分钟，为下一步操作做准备。
- 移除缓冲液，并加入 400 µL 预热的杂交缓冲液，在 37 ˚C 下预杂交 30 分钟。
- 通过添加 8 pM 探针制备针对目标化学感受受体（IR8a、IR76b、IR25a、IR41t.1、IR75d、IR7t、IR64a 或 Orco）的探针溶液。将 8 µL 的 1 µM 探针原液加入 500 µL 预热的杂交缓冲液中。
- 移除预热的杂交缓冲液，替换为 400 µL 加热后的探针溶液。
- 将组织置于孵育箱内的振荡器上，加盖盒子覆盖，在 37 ˚C 下孵育两晚。
6. 探针扩增
- 将探针洗涤缓冲液加热至 37 ˚C。在孵育器中，用 400 µL 37 ˚C 的探针洗涤缓冲液，振荡洗涤组织 5 次，每次 10 分钟，以去除多余的探针溶液。
注意：可开始准备步骤 6.4。参见步骤 6.4 中的说明。 - 用 400 µL 含 10% Tween-20 的 5× 盐水-柠檬酸钠缓冲液（SSCT），室温下洗涤样本 2 次，每次 5 分钟。在实验台面上将扩增缓冲液解冻至室温。
- 将组织置于400 µL扩增缓冲液中，室温孵育10分钟，以进行扩增前处理。由于扩增缓冲液具有较高黏度，组织可能无法完全浸没。通过移液器将缓冲液轻轻吹打至组织下方，并将缓冲液排至组织上方，反复操作直至组织完全浸没。
- 分别准备18 pM的发夹结构h1和18 pM的发夹结构h2：取6 µL浓度为3 µM的储备液，于95 °C加热90秒，随后在避光的抽屉中冷却至室温，持续30分钟。在热循环仪中加热时，确保PCR管盖紧，防止发夹结构溶液蒸发。
注意：为节省时间，可在进行第4步时提前开始第6.4步。th 第6.1步中的洗涤步骤。应将发夹探针分别加热，以防止交叉反应。此步骤中不得用任何缓冲液稀释发夹探针。发夹探针可与探针一同从探针生产商处购买。 - 将步骤6.3中加入的扩增缓冲液替换为含有已加热发夹结构（来自步骤6.4）与100 µL扩增缓冲液的混合液。典型的反应体系包含6 µL h1、6 µL h2以及100 µL扩增缓冲液。
注意：待冷却至室温后，可将发夹结构 h1 和 h2 混合，再加入 100 µL 扩增缓冲液中。为避免将组织样本从一个离心管转移至另一个离心管，可在第 6.3 步中移除扩增缓冲液，并替换为用扩增缓冲液稀释的发夹混合物。 - 将组织在室温下避光孵育过夜，并使用摇摆混合器的默认速度进行振荡。
7. 组织样本封片
- 用 300 µL 的 5x SSCT（氯化钠-柠檬酸钠Tween-20缓冲液）稀释孵育组织中的扩增缓冲液。
注意：稀释有助于降低黏度，使扩增缓冲液更易于从组织中去除。我们在预固定步骤中使用 Triton-X 100，在固定后步骤中使用 Tween-20，因为这两种试剂在细胞膜通透化作用方面存在差异。 - 用 400 µL 的 5x SSCT 在室温下洗涤组织 5 次。
注意：如有需要，可将组织暂时保存在 4 °C，待准备包埋时再取出。我们通常在 2 天内完成成像。 - 在载玻片上滴加5滴封片液。剪切200 µL移液器吸头的尖端使其变宽，将组织转移至新的载玻片上。
- 用镊子夹住组织样本的基部，轻轻浸入并漂洗于一系列封片液液滴中。此步骤中需注意避免损坏组织。
- 用封片剂封片，盖上盖玻片，并用指甲油密封。成像 原位 使用共聚焦显微镜观察组织样本。
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结果
在Anopheles触角中对化学感受基因的稳健检测
我们研究了HCR FISH方法（图1）检测蚊子嗅觉组织中化学感受受体表达的灵敏度。根据先前报道的雌性Anopheles蚊子触角RNA转录组数据，我们设计了靶向多种IR的探针。四项独立的触角转录组研究的平均转录本值显示，Ir41t.1（11 RPKM）、Ir75d（12 RPKM）和Ir7t（13 RPKM）在触角中的丰度低于共受体Ir25a（197 RPKM）和Ir76b（193 RPKM）5,11,12,13,14。我们为此生成了靶向Ir41t.1、Ir75d和Ir7t的探针。此外，IR64a（31 RPKM）也被纳入靶点，因...
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讨论
第三代杂交链式反应（HCR）因其能够灵敏且稳健地可视化多个RNA靶标而备受关注8HCR WM-FISH 已成功应用于胚胎的 果蝇鸡、小鼠和斑马鱼，以及线虫和斑马鱼的幼虫10,16,17蚊虫的触角和下颚须通常具有较强的自发荧光和较弱的探针渗透性，这在进行传统的整体荧光原位杂交时尤为具有挑战性。 原位 方法。这些缺点已通过整合到HCR方案中的信号扩增步骤而得以减弱，该步骤可提高信噪比，从而实现对嗅觉化学感受器mRNA转录本的检测（图2HCR方案设计确保起始探针与扩增聚合物相连，从而实现对低信号RNA靶标的成像。在多重检测体系中，不同的正交HCR扩增系统分别连接光谱上 distinct 的荧光染料。该策略对于避免相邻成像通道间的光谱串扰至关重要。
为优化HCR方...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Margo Herre 和 Leslie Vosshall 实验室分享他们的原位杂交实验方案 Aedes aegypti 嗅觉附器。本研究获得了美国国立卫生研究院向C.J.P.提供的资助（NIAID R01Al137078），HHMI Hanna Gray博士后奖学金、约翰斯·霍普金斯大学博士后加速奖及约翰斯·霍普金斯疟疾研究所博士后奖学金向J.I.R.提供的支持。我们感谢约翰斯·霍普金斯疟疾研究所和彭博慈善基金会提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 扩增缓冲液 | 分子仪器 | 分子仪器公司 | 原位杂交 + 免疫荧光 | 50 mL |
| 1 M 氯化钙（CaCl2） | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| 几丁质酶 | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| 胰凝乳蛋白酶 | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf管 | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| 镊子 | Dumont | 11251 | 5号 |
| 凝胶上样枪头 | Costar | 4853 | 1-200 µL型尖端 |
| 发夹结构 | 分子仪器 | 分子仪器公司 | 原位杂交 + 免疫荧光 | h1 和 h2 起始子分离 |
| HEPES (1 M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a 探针 | 分子仪器 | 探针组ID：PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 探针 | 分子仪器 | 探针组ID：PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a 探针 | 分子仪器 | 探针组ID：PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d 探针 | 分子仪器 | 探针集ID：PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b 探针 | 分子仪器 | 探针组ID：PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t 探针 | 分子仪器 | 探针组ID：PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a 探针 | 分子仪器 | 探针组ID：PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind 管 | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA低吸附管 |
| 氯化镁 (MgCl21 M | 赛默飞世尔科技 | AM9530G | |
| 甲醇 | Fisher | A412-500 | |
| 无核酸酶水 | 赛默飞世尔科技 | 43-879-36 | |
| 旋转器 | 丹维尔科学公司 | 模型 135 | 3-D迷你摇床 |
| Orco探针 | 分子工具 | 探针组 ID PRD954 | AGAP002560 |
| 多聚甲醛（20%） | 电子显微镜服务 | 15713-S | |
| 磷酸盐缓冲液（10倍浓缩PBS） | 赛默飞世尔科技 | AM9625 | |
| 探针杂交缓冲液 | 分子仪器 | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| 探针洗涤缓冲液 | 分子仪器 | Molecular Instruments, Inc. | 原位杂交 + 免疫荧光 | 100 mL |
| 蛋白酶K | 赛默飞世尔科技 | AM2548 | |
| 20× 盐水-柠檬酸钠（SSC） | 赛默飞世尔科技 | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | 赛默飞世尔科技 | S36972 | 封片液 |
| 氯化钠 (NaCl) 5 M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10%) | Teknova | T0027 | |
| 表面皿 | 卡罗来纳 | 742300 | 1 5/8" 方形；透明 |
参考文献
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