检测与定量铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）产生的单鼠李糖脂和双鼠李糖脂

摘要

Pseudomonas aeruginosa 可产生鼠李糖脂类生物表面活性剂。通过薄层色谱法可检测各菌株产生的单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的比例。采用间苯二酚法测定培养上清液中提取的生物表面活性剂所含的鼠李糖当量，以实现对总鼠李糖脂的定量分析。

摘要

环境细菌Pseudomonas aeruginosa是一种具有高度抗生素耐药性的机会性病原体，对人类健康构成威胁。该细菌可产生大量被称为鼠李糖脂（rhamnolipids, RL）的生物表面活性剂，这类分子具有重要的生物技术价值，但也与毒力特性相关。因此，RL的检测与定量在生物技术应用和生物医学研究中均具有重要意义。本文逐步演示了利用薄层色谱法（thin-layer chromatography, TLC）检测P. aeruginosa产生的两种形式RL的技术：单鼠李糖脂（mono-rhamnolipids, mRL），其分子结构由一个脂肪酸二聚体（主要为C10-C10）连接一个鼠李糖基团组成；以及双鼠李糖脂（di-rhamnolipids, dRL），其分子结构由相似的脂肪酸二聚体连接两个鼠李糖基团构成。此外，我们还介绍了一种基于酸水解法测定总RL含量的方法，即从P. aeruginosa培养上清液中提取这些生物表面活性剂，随后通过地衣酚反应检测水解后释放的鼠李糖浓度。结合这两种技术，可估算特定菌株产生的mRL和dRL的大致浓度，本文以标准菌株PAO1（系统发育群1）、PA14（系统发育群2）和PA7（系统发育群3）为例进行了说明。

引言

Pseudomonas aeruginosa 是一种环境细菌，也是一种引起广泛关注的机会性病原体，因其可产生多种与毒力相关的性状且具有高度抗生素耐药性^1,2。该细菌产生的一种特征性次级代谢产物是生物表面活性剂鼠李糖脂（RL），其生成与多种毒力相关性状（如具有氧化还原活性的抗生素吩嗪类物质——绿脓菌素，以及蛋白酶弹性蛋白酶）的表达呈协同关系³。由于RL具有降低表面张力和乳化作用，已被应用于多种工业领域，并实现了商业化⁴。

大多数属于第1和第2进化枝的P. aeruginosa菌株可产生两种类型的鼠李糖脂：单鼠李糖脂（mRL），由一个鼠李糖基团连接至主要含10个碳原子的脂肪酸二聚体组成；以及双鼠李糖脂（dRL），其在第一个鼠李糖上额外连接了一个鼠李糖基团⁴（见图1）。然而，已有研究报道，两种次要的P. aeruginosa进化枝（第3和第5组）仅产生mRL^5,6。这两种类型的鼠李糖脂均包含多种脂肪酸二聚体的混合物，如前所述，主要为C10-C10，但也产生少量含C12-C10、C12-C12和C10-C12:1二聚体的分子。已有文献报道使用HPLC-MS/MS对不同菌株产生的鼠李糖脂同系物进行表征^7,8。本文所述方法仅能区分mRL与dRL，但无法用于鼠李糖脂同系物的表征。

P. aeruginosa 以及一些 伯克霍尔德菌属 物种是鼠李糖脂的天然生产者⁹，但前者是效率最高的生产菌。然而，目前商业用的鼠李糖脂是由 Pseudomonas putida 表达KT2440衍生物 P. aeruginosa 基因以避免使用这种机会性病原体^10,11. 检测与定量由 RL 产生的 P. aeruginosa 对于研究与毒力相关性状表达所涉及的分子机制具有重要意义¹²，在对属于进化枝3或5的菌株进行表征时¹³以及用于构建 P. aeruginosa 过量产生这些生物表面活性剂但毒力降低的衍生物¹⁴不同微生物产生生物表面活性剂的检测已基于这些化合物的一些普遍特性进行，例如崩塌滴法或乳化指数¹⁵，但这些方法既不准确也不特异¹⁶.

本文描述了利用液相萃取法从不同铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株的培养上清液中提取总鼠李糖脂（RL），并通过薄层色谱法（TLC）分离单鼠李糖脂（mRL）和双鼠李糖脂（dRL）的实验方案。在该方法中，从培养上清液中提取的RL根据其在TLC所用溶剂中的溶解度差异，在硅胶板上表现出不同的迁移速率。因此，mRL的迁移速度比dRL更快，当板子干燥并用α-萘酚染色后，可观察到分别代表两种RL的独立斑点。

本文所述通过薄层色谱法检测mRL和dRL的方法基于先前发表的文章¹⁷，操作简便且无需昂贵设备。该方法已成功用于多种样本中RL的检测 P. aeruginosa 分离株¹³ 使用适当的对照，例如一个 P. aeruginosa-衍生的突变体，无法产生RL。然而，对于表征非该类细菌产生的新型生物表面活性剂，此方法并非首选 铜绿假单胞菌 由于其缺乏特异性。

此外，本文还介绍了一种定量分析从铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）培养上清液中提取的总鼠李糖脂（RL）中鼠李糖当量的方法。该方法基于地衣酚（orcinol）与还原性糖反应生成可在421 nm处通过分光光度法测定的产物，如先前所述¹⁸。由于地衣酚反应对鼠李糖不具特异性，因此必须使用不含大量其他含糖分子（如脂多糖，LPS）的培养上清液提取的RL进行该方法操作。本文采用酸化氯仿/甲醇混合液进行液-液萃取提取RL¹⁸，但也可使用乙酸乙酯，固相萃取（SPE）亦可获得很好的效果¹⁹。此处描述的地衣酚法无需复杂设备，只要在样品制备过程中特别谨慎操作，即可获得可靠结果。为确保样品制备的准确性，应包括一株不能产生RL的铜绿假单胞菌rhlA突变株²⁰，并对每次测定设置三个生物学重复和三个技术重复。

关于利用地衣酚法测定鼠李糖脂（RL）的研究在文献中存在较大争议^16,21，部分研究认为该方法会高估RL的产量，且对鼠李糖缺乏特异性，可能检测到其他糖类。然而，本文证明在适当条件下，所述方法具有准确性和特异性。此外，为与本文所述实验流程进行比较，我们采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）检测了二鼠李糖脂（dRL）标准品，并证明地衣酚法可获得相似结果。利用该方法定量RL的详细实验方案见补充文件1。

这些方案以标准菌株PAO1（系统发育群1）、PA14（系统发育群2）和PA7（系统发育群3）为例进行说明。选择这些菌株是因为它们的特征明确，且产生不同的鼠李糖脂谱型。

方案

该流程示意图见补充图1。本研究所用的试剂和设备列于材料表中。

1. 利用薄层色谱法检测铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）培养上清液中的mRL和dRL

1. 取目标铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株在液体培养基中培养24小时（达到产生鼠李糖脂的稳定生长期）后的离心培养液。通常，这些培养物每毫升含有1 × 10⁹个细菌。
2. 使用浓盐酸将培养液的pH值调节至2。
3. 将5 mL酸化后的培养上清液加入一个50 mL聚丙烯管中，并加入5 mL氯仿:甲醇（2:1）混合液。
4. 将管子倒置振荡三次，每次10秒，每次振荡之间静置2分钟，不进行倒置。
5. 将管子静置约3小时，直至两相完全分离；或在4 °C条件下以3,000 × g离心10分钟。
6. 将有机相（下层）转移至洁净的试管中，并将试管置于通风橱中直至溶剂完全挥发。
7. 从步骤1.3开始重复提取过程，将第二次氯仿:甲醇提取所得的有机相加入第一次提取所用的试管中。
8. 将有机相蒸发至剩余1 mL或1.5 mL，转移至1.5 mL离心管中，并在室温下过夜挥发溶剂至完全干燥。
9. 向干燥的管中加入50 µL甲醇，以重新溶解鼠李糖脂（RL）。
10. 在硅胶板上进行薄层色谱分析。
    注：TLC板的尺寸应根据待分析样品的数量进行裁剪。每个样品点样位置距板底边1 cm处（用铅笔画一条水平线），点样间距为1.5 cm。
11. 使用10 µL微量移液器，每点加样5 µL。
12. TLC流动相由氯仿:甲醇:乙酸（65:15:2）组成。配制35 mL该混合液时，混合26 mL氯仿、6 mL甲醇和0.8 mL 20%乙酸储备液。混合后将溶剂放入密闭的TLC展开槽中，至少平衡10分钟，使槽内气氛被挥发性溶剂饱和。
13. 将TLC板放入展开槽中，注意避免接触样品点样位置。
14. 盖上槽盖，展开至溶剂前沿距离板顶端边缘约1 cm时取出，让板自然晾干（可吹入气流以加快干燥）。
15. 配制α-萘酚显色液：将5 g α-萘酚溶于33 mL乙醇中，完全溶解后加入127.5 mL乙醇、12.6 mL水和20.5 mL冷的H₂SO₄。
16. 为检测单鼠李糖脂（mRL）和双鼠李糖脂（dRL）的存在，于通风橱中将α-萘酚溶液均匀喷洒在TLC板上，随后将板置于85 °C烘箱中加热数分钟，直至出现粉红色的鼠李糖脂斑点。
17. 使用TLC板图像，通过检测各斑点密度的软件分析每个样品中单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的比例。

2. 通过测定生物表面活性剂中存在鼠李糖当量来量化总RL含量

1. 取1.2 mL处于稳定期的培养物（培养24小时）置于1.5 mL离心管中，在4 °C条件下以3,000 × g离心3分钟。将上清液收集至洁净的离心管中。
2. 转移333 µL至洁净的离心管中（该步骤需设三个重复），加入1 mL乙醚。
3. 在涡旋振荡器上剧烈振荡30秒。每次处理一个离心管，重复此操作。
4. 在4 °C条件下以3,000 × g离心2分钟。收集有机相（上层相），转移至洁净的离心管中，并在通风橱中敞口放置至完全干燥。
5. 按照步骤2.2所述方法，再次使用乙醚进行提取。重复步骤2.3和2.4。
6. 待样品完全干燥后，向每根离心管中加入1 mL水。将离心管静置12小时，使鼠李糖脂（RL）充分水合，然后在涡旋振荡器上剧烈振荡。
7. 将一个洁净的烧瓶置于冰中冷却5分钟（该反应为放热反应）。配制60% H₂SO₄溶液（需避光保护烧瓶）。
8. 在洁净的离心管中，用蒸馏水配制1.6%地衣酚溶液。配制地衣酚试剂时，将4.4 mL的60% H₂SO₄溶液与0.6 mL的1.6%地衣酚溶液混合。
9. 计算所需地衣酚试剂的最终体积。向每个样品及标准曲线中的每个浓度点（通常使用9个不同浓度的鼠李糖，浓度范围为1 µg/mL至9 µg/mL）以及一个仅含100 µL水的对照组中，各加入900 µL该试剂，所有操作均需设三个重复。
10. 在玻璃试管中，向900 µL地衣酚试剂中加入100 µL各RL样品溶液，并充分混合两种溶液。
11. 在预热至80 °C的水浴中孵育30分钟。
12. 让试管自然冷却至室温。
13. 使用石英比色皿，在421 nm波长下测定样品及标准曲线的吸光度。
14. 通过标准曲线插值法计算各样品中鼠李糖的浓度，并结合测定所用体积进行校正。
15. 若需计算µM浓度，将测得的µg/mL浓度值除以182.2（鼠李糖的分子量），再乘以1000。

结果

在本文中，使用了三种不同的铜绿假单胞菌标准菌株来代表三个系统发育群，每种菌株产生鼠李糖脂的水平以及单鼠李糖脂（mRL）与双鼠李糖脂（dRL）的比例各不相同。这些菌株包括PAO1（1955年来自澳大利亚的伤口分离株）²²），PA14（源自美国的植物分离株，1977年）²³），以及PA7（2010年来自阿根廷的临床分离株）²⁴）。作为阴性对照，使用PAO1 rhlA 使用了无法产生鼠李糖脂（RL）的突变株。所有菌株均在特制的PPGAS培养基中培养24小时，该培养基旨在促进高水平的鼠李糖脂生成。²⁵在37 °C下，使用LB培养基将PPGAS培养物在600 nm处以0.05的光密度接种。²⁶ 过夜培养。通常， P. aeruginosa 菌株在 PPGAS 培养基中培养 24 小时后，在 600 nm 处测得的光密度达到 2，这大约相当于 1 x 10⁹ 每毫升细菌数。为收集用于RL检测与定量的培养上清液，将培养物在3,000 x g 4 °C 下离心 15 分钟，弃去细胞沉淀。采用这两种方法获得的结果图2 和 图3) 表明，三种受试菌株所产生的鼠李糖脂（RL）类型及其产量均存在差异。如图所示 图2PAO1 产生约 30% 的 mRL 和 70% 的 dRL，PA14 产生等量的 mRL 和 dRL（各占 50%），而 PA7 仅产生 mRL。该鼠李糖脂（RL）产率特征与先前报道一致^12,14.

图3A展示了这三种菌株产生的鼠李糖脂（RL）中所含鼠李糖当量的量。根据检测到的鼠李糖含量，明显可见PA14菌株产生的RL最多，而PA7菌株产生的RL最少。然而，仅凭这些结果尚无法估算各菌株产生RL的微摩尔浓度（µM）。此外，单独使用间苯三酚法也无法提供RL浓度的近似值，因为该方法依赖于表征各目标菌株产生的单鼠李糖脂（mRL）和双鼠李糖脂（dRL）的比例。因此，为了估算RL的µM浓度，必须结合薄层层析（TLC）所确定的各类RL的比例，并应建立不同鼠李糖浓度的标准曲线（图3B）。

当仅产生一种此类生物表面活性剂时，确实可以利用地衣酚法来定量RL的浓度。在这种情况下，所检测到的鼠李糖的微摩尔浓度（μM）直接对应于单鼠李糖脂（mRL）的微摩尔浓度。对于双鼠李糖脂（dRL），由于每个dRL分子水解后产生两个鼠李糖分子，因此需要将检测到的RL中鼠李糖的微摩尔浓度除以2，才能得到dRL的微摩尔浓度（参见图4）。

然而，大多数P. aeruginosa菌株会以不同比例同时产生两种类型的鼠李糖脂（如图2所示），因此只能测定总鼠李糖脂的大致浓度。考虑到这一点，我们对各菌株的鼠李糖脂产量进行了如下估算：对于PA7菌株，由于其仅产生单鼠李糖脂（mRL），构成鼠李糖脂的鼠李糖部分（44.6 µg/mL + 4.5 µg/mL）直接对应于其微摩尔浓度（244.78 µM），该值即代表该生物表面活性剂在培养上清液中的浓度，因为每个鼠李糖脂分子含有一个鼠李糖基团。而对于PAO1菌株，尽管检测到的鼠李糖浓度为111.55 µg/mL + 11.41 µg/mL，但其中仅有30%属于mRL，其余70%的鼠李糖脂分子每分子含有两个鼠李糖。为估算鼠李糖脂的总浓度，将鼠李糖的微摩尔浓度（612.24 µM）除以5，其中1/5对应mRL的微摩尔浓度（122.49 µM），2/5对应双鼠李糖脂（dRL）的微摩尔浓度（244.89 µM）。因此，该菌株产生的鼠李糖脂的近似微摩尔浓度为367.39 µM。

对于PA14菌株，检测到的鼠李糖浓度为194.39 µg/mL ± 11.5 µg/mL，该值被换算为µM浓度（1,066.9），再除以3。该结果代表每种鼠李糖脂（RL）类型的浓度，考虑到每种类型均以50%的比例生成，且双鼠李糖脂（dRL）每分子含有2个鼠李糖。因此，该菌株产生355.63 µM的单鼠李糖脂（mRL）和相同浓度的双鼠李糖脂（dRL），得到鼠李糖脂（RL）的总浓度约为711.27 µM，几乎是PAO1菌株的两倍，约为PA7菌株的三倍。

图1：单鼠李糖脂和双鼠李糖脂主要同系物的化学组成。 （A）单鼠李糖脂。（B）双鼠李糖脂。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：通过薄层色谱法检测单鼠李糖脂和双鼠李糖脂。 （A）TLC板照片，显示鼠李糖脂标准品以及菌株PAO1、PA14、PA7和PAO1衍生的ΔrhlA突变体产生的鼠李糖脂。（B）使用ImageJ软件估算（A）中各测试样品中每种鼠李糖脂类型（mRL和dRL）的比例。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：采用间苯三酚法测定RL浓度。 （A）从PAO1（黑色柱）、PA14（浅灰色柱）和PA7（深灰色柱）菌株的培养上清液中提取的RL所含的鼠李糖浓度（µg/mL）。柱状图表示标准偏差。（B）对应（A）实验的鼠李糖标准曲线。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：使用 orcinol 法与 UPLC-MS/MS 法测定 dRL 含量的对比验证。 （A）采用 UPLC-MS/MS 法对 dRL 标准品进行定量。（B）orcinol 法测定结果与以 mM 表示的鼠李糖浓度的对比。（C）相同 mM 浓度的 dRL 与鼠李糖相比，在 421 nm 处的吸光度约为其两倍，符合预期。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：实验方案的示意图。 请点击此处下载该文件。

补充文件1：通过UPLC-MS/MS定量测定dRL的详细实验方案。 请点击此处下载该文件。

讨论

检测和定量RL最准确的方法是高效液相色谱法（HPLC）与质谱法（MS）联用^7,8,27；然而，该方法需要专用且昂贵的设备，许多研究人员可能无法获得。本文所述方法可使用常规实验室材料和设备常规开展，用于检测和估算RL浓度，但这些方法存在一些局限性，特别是难以准确测定mRL和dRL的混合物。此外，用于RL定量的样品制备应谨慎操作。用于RL检测和定量的培养物不应处于稳定期后期，因为细胞可能发生聚集或裂解，导致细胞悬液不均一，从而引起实验结果的变异。此外，细胞碎片可能干扰地衣酚法的测定。

当使用适当的对照（例如）执行所述方案时，可获得准确的结果 铜绿假单胞菌 无法产生RL的菌株（如PAO1 Δ）rhlA 突变体²⁰ 本研究中使用， 图2）。这些结果有助于表征不同 P. aeruginosa 分离株^12,13，通过基因改造菌株以提高RL的产量¹⁴，或研究不同菌株产生RL的分子遗传学机制 P. aeruginosa 分离株¹².

因此，本文所述方法可用于表征铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌株产生毒力因子的能力，并评估其生物技术潜力，尤其适用于研究的初期阶段。需要注意的是，这些方法并非旨在替代高效液相色谱-质谱联用（HPLC/MS）等技术，而是作为易于实施的技术手段，用于对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株进行初步的菌株表征和遗传操作。

此外，如果研究重点是用于生物医学目的的鼠李糖脂（RL）生产，则必须认识到，RL的产生仅仅是铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）产生的多种因子之一。同时，所产生的RL类型或其产量与特定菌株的毒力之间并无严格的关联性，因为毒力受到多种因素的影响²⁸。

关于本文所述方法的可重复性，在薄层色谱法检测鼠李糖脂（RL）（步骤1.6）以及使用地衣酚法测定RL（步骤2.4）过程中获取有机相时，需特别注意。即使在萃取过程中混入少量其他相，也可能导致实验结果出现显著差异。从培养上清液中提取RL是地衣酚法获得可靠且可重复结果的关键步骤。在收集有机相时，必须避免混入中间相和水相。若乙醚相在3小时内未能完全干燥，则很可能含有水分，此时需重新进行萃取。

关于使用地衣酚法测定鼠李糖脂（RL）含量的准确性与特异性，学界一直存在争议。有观点认为该方法常导致RL含量被高估，且缺乏特异性，因为地衣酚可与多种糖类反应，而不仅限于鼠李糖。本研究数据显示，若能有效从培养上清液中提取RL，则该方法具有特异性，这一点通过以rhlA突变株作为阴性对照时无显色反应得以证实。然而，为了在不依赖提取步骤的前提下进一步验证该方法检测的准确性，我们采用此前描述的方法²⁷通过UPLC-MS/MS检测了双鼠李糖脂（dRL）标准品，并将结果与地衣酚法¹⁸进行比较（补充文件1，图4A）。我们发现，正如已有报道¹⁸所述，该方法测得的RL浓度具有极好的相关性，其中每μM 浓度的dRL所检测到的吸光度值在421 nm处约为相同μM浓度鼠李糖的两倍（图4B,C）。该对照实验明确证明了该方法在RL定量中的准确性。

然而，由于使用地衣酚法测定单鼠李糖脂（mRL）和双鼠李糖脂（dRL）混合物浓度存在困难，大多数文献均以鼠李糖脂（RL）中的鼠李糖当量来报告结果。该数值可能与实际的RL浓度并无直接相关性，本文所列举的示例即说明了这一点；但即便如此，它仍是一种在不同条件下比较RL含量的有效方法，尤其是在使用相同铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株时。

已有研究报道了一种基于溶解疏水性染料维多利亚纯蓝BO（Victoria Pure Blue BO，常用于圆珠笔中）的mRL和dRL定量替代方法²⁹。该方法快速且成本低廉。然而，该方案是为定量P. putida中鼠李糖脂的异源表达而开发的，不适用于P. aeruginosa产生的鼠李糖脂，因为蓝色毒素绿脓菌素的表达会干扰该检测方法。

综上所述，本文所述方法为检测和定量铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）产生的鼠李糖脂提供了一种可行的替代方案，且无需使用复杂且昂贵的仪器设备。这些方法为研究人员在多种实验条件下评估鼠李糖脂的产量提供了切实可行的途径。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-萘酚	SIGMA-ALDRICH	70442
乙酸	J.T. BAKER	9508-02
离心机			用于离心1.5 mL和 50 mL的离心管
氯仿	J.T. BAKER	9180-02
干燥烘箱
乙醚	J.T. BAKER	9244-02
玻璃移液管	SIGMA-ALDRICH	CLS706510
盐酸	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-鼠李糖一水合物	SIGMA-ALDRICH	R-3875
甲醇	J.T. BAKER	9049-02
地衣酚一水合物	SIGMA-ALDRICH	O1875
PPGAS肉汤			Tris HCl (0.12M)，氯化钾 (0.02M)，氯化铵 (0.02M)， 蛋白胨 (1%)，pH 7.4  经高压灭菌。使用前加入 葡萄糖 (5%) 和硫酸镁 (0.0016M)
石英比色皿	SIGMA-ALDRICH	Z276669
矩形薄层层析展开槽	FISHER SCIENTIFIC	K4161801020
鼠李糖脂	SIGMA-ALDRICH	R-90
分光光度计			VIS
喷雾器	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
硫酸	J.T. BAKER	9681-02
5 mL试管	CORNING	352002
薄层层析硅胶板 60 F254	MERCK	1.05554.0001
水浴锅			> 80 °C