Pseudomonas aeruginosa 可产生鼠李糖脂类生物表面活性剂。通过薄层色谱法可检测各菌株产生的单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的比例。采用间苯二酚法测定培养上清液中提取的生物表面活性剂所含的鼠李糖当量，以实现对总鼠李糖脂的定量分析。
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摘要
摘要
环境细菌Pseudomonas aeruginosa是一种具有高度抗生素耐药性的机会性病原体，对人类健康构成威胁。该细菌可产生大量被称为鼠李糖脂（rhamnolipids, RL）的生物表面活性剂，这类分子具有重要的生物技术价值，但也与毒力特性相关。因此，RL的检测与定量在生物技术应用和生物医学研究中均具有重要意义。本文逐步演示了利用薄层色谱法（thin-layer chromatography, TLC）检测P. aeruginosa产生的两种形式RL的技术：单鼠李糖脂（mono-rhamnolipids, mRL），其分子结构由一个脂肪酸二聚体（主要为C10-C10）连接一个鼠李糖基团组成；以及双鼠李糖脂（di-rhamnolipids, dRL），其分子结构由相似的脂肪酸二聚体连接两个鼠李糖基团构成。此外，我们还介绍了一种基于酸水解法测定总RL含量的方法，即从P. aeruginosa培养上清液中提取这些生物表面活性剂，随后通过地衣酚反应检测水解后释放的鼠李糖浓度。结合这两种技术，可估算特定菌株产生的mRL和dRL的大致浓度，本文以标准菌株PAO1（系统发育群1）、PA14（系统发育群2）和PA7（系统发育群3）为例进行了说明。
引言
Pseudomonas aeruginosa 是一种环境细菌，也是一种引起广泛关注的机会性病原体，因其可产生多种与毒力相关的性状且具有高度抗生素耐药性1,2。该细菌产生的一种特征性次级代谢产物是生物表面活性剂鼠李糖脂（RL），其生成与多种毒力相关性状（如具有氧化还原活性的抗生素吩嗪类物质——绿脓菌素，以及蛋白酶弹性蛋白酶）的表达呈协同关系3。由于RL具有降低表面张力和乳化作用，已被应用于多种工业领域，并实现了商业化4。
大多数属于第1和第2进化枝的P. aeruginosa菌株可产生两种类型的鼠李糖脂：单鼠李糖脂（mRL），由一个鼠李糖基团连接至主要含10个碳原子的脂肪酸二聚体组成；以及双鼠李糖脂（dRL），其在第一个鼠李糖上额外连接了一个鼠李糖基团4（见图1）。然而，已有研究报道，两种次要的P. aeruginosa进化枝（第3和第5组）仅产生mRL5,6。这两种类型的鼠李糖脂均包含多种脂肪酸二聚体的混合物，如前所述，主要为C10-C10，但也产生少量含C12-C10、C12-C12和C10-C12:1二聚体的分子。已有文献报道使用HPLC-MS/MS对不同菌株产生的鼠李糖脂同系物进行表征7,8。本文所述方法仅能区分mRL与dRL，但无法用于鼠李糖脂同系物的表征。
P. aeruginosa 以及一些 伯克霍尔德菌属 物种是鼠李糖脂的天然生产者9，但前者是效率最高的生产菌。然而，目前商业用的鼠李糖脂是由 Pseudomonas putida 表达KT2440衍生物 P. aeruginosa 基因以避免使用这种机会性病原体10,11. 检测与定量由 RL 产生的 P. aeruginosa 对于研究与毒力相关性状表达所涉及的分子机制具有重要意义12，在对属于进化枝3或5的菌株进行表征时13以及用于构建 P. aeruginosa 过量产生这些生物表面活性剂但毒力降低的衍生物14不同微生物产生生物表面活性剂的检测已基于这些化合物的一些普遍特性进行，例如崩塌滴法或乳化指数15，但这些方法既不准确也不特异16.
本文描述了利用液相萃取法从不同铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株的培养上清液中提取总鼠李糖脂（RL），并通过薄层色谱法（TLC）分离单鼠李糖脂（mRL）和双鼠李糖脂（dRL）的实验方案。在该方法中，从培养上清液中提取的RL根据其在TLC所用溶剂中的溶解度差异，在硅胶板上表现出不同的迁移速率。因此，mRL的迁移速度比dRL更快，当板子干燥并用α-萘酚染色后，可观察到分别代表两种RL的独立斑点。
本文所述通过薄层色谱法检测mRL和dRL的方法基于先前发表的文章17，操作简便且无需昂贵设备。该方法已成功用于多种样本中RL的检测 P. aeruginosa 分离株13 使用适当的对照，例如一个 P. aeruginosa-衍生的突变体，无法产生RL。然而，对于表征非该类细菌产生的新型生物表面活性剂，此方法并非首选 铜绿假单胞菌 由于其缺乏特异性。
此外，本文还介绍了一种定量分析从铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）培养上清液中提取的总鼠李糖脂（RL）中鼠李糖当量的方法。该方法基于地衣酚（orcinol）与还原性糖反应生成可在421 nm处通过分光光度法测定的产物，如先前所述18。由于地衣酚反应对鼠李糖不具特异性，因此必须使用不含大量其他含糖分子（如脂多糖，LPS）的培养上清液提取的RL进行该方法操作。本文采用酸化氯仿/甲醇混合液进行液-液萃取提取RL18，但也可使用乙酸乙酯，固相萃取（SPE）亦可获得很好的效果19。此处描述的地衣酚法无需复杂设备，只要在样品制备过程中特别谨慎操作，即可获得可靠结果。为确保样品制备的准确性，应包括一株不能产生RL的铜绿假单胞菌rhlA突变株20，并对每次测定设置三个生物学重复和三个技术重复。
关于利用地衣酚法测定鼠李糖脂（RL）的研究在文献中存在较大争议16,21，部分研究认为该方法会高估RL的产量，且对鼠李糖缺乏特异性，可能检测到其他糖类。然而，本文证明在适当条件下，所述方法具有准确性和特异性。此外，为与本文所述实验流程进行比较，我们采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）检测了二鼠李糖脂（dRL）标准品，并证明地衣酚法可获得相似结果。利用该方法定量RL的详细实验方案见补充文件1。
这些方案以标准菌株PAO1（系统发育群1）、PA14（系统发育群2）和PA7（系统发育群3）为例进行说明。选择这些菌株是因为它们的特征明确，且产生不同的鼠李糖脂谱型。
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方案
该流程示意图见补充图1。本研究所用的试剂和设备列于材料表中。
1. 利用薄层色谱法检测铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）培养上清液中的mRL和dRL
- 取目标铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株在液体培养基中培养24小时（达到产生鼠李糖脂的稳定生长期）后的离心培养液。通常，这些培养物每毫升含有1 × 109个细菌。
- 使用浓盐酸将培养液的pH值调节至2。
- 将5 mL酸化后的培养上清液加入一个50 mL聚丙烯管中，并加入5 mL氯仿:甲醇（2:1）混合液。
- 将管子倒置振荡三次，每次10秒，每次振荡之间静置2分钟，不进行倒置。
- 将管子静置约3小时，直至两相完全分离；或在4 °C条件下以3,000 × g离心10分钟。
- 将有机相（下层）转移至洁净的试管中，并将试管置于通风橱中直至溶剂完全挥发。
- 从步骤1.3开始重复提取过程，将第二次氯仿:甲醇提取所得的有机相加入第一次提取所用的试管中。
- 将有机相蒸发至剩余1 mL或1.5 mL，转移至1.5 mL离心管中，并在室温下过夜挥发溶剂至完全干燥。
- 向干燥的管中加入50 µL甲醇，以重新溶解鼠李糖脂（RL）。
- 在硅胶板上进行薄层色谱分析。
注：TLC板的尺寸应根据待分析样品的数量进行裁剪。每个样品点样位置距板底边1 cm处（用铅笔画一条水平线），点样间距为1.5 cm。 - 使用10 µL微量移液器，每点加样5 µL。
- TLC流动相由氯仿:甲醇:乙酸（65:15:2）组成。配制35 mL该混合液时，混合26 mL氯仿、6 mL甲醇和0.8 mL 20%乙酸储备液。混合后将溶剂放入密闭的TLC展开槽中，至少平衡10分钟，使槽内气氛被挥发性溶剂饱和。
- 将TLC板放入展开槽中，注意避免接触样品点样位置。
- 盖上槽盖，展开至溶剂前沿距离板顶端边缘约1 cm时取出，让板自然晾干（可吹入气流以加快干燥）。
- 配制α-萘酚显色液：将5 g α-萘酚溶于33 mL乙醇中，完全溶解后加入127.5 mL乙醇、12.6 mL水和20.5 mL冷的H2SO4。
- 为检测单鼠李糖脂（mRL）和双鼠李糖脂（dRL）的存在，于通风橱中将α-萘酚溶液均匀喷洒在TLC板上，随后将板置于85 °C烘箱中加热数分钟，直至出现粉红色的鼠李糖脂斑点。
- 使用TLC板图像，通过检测各斑点密度的软件分析每个样品中单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的比例。
2. 通过测定生物表面活性剂中存在鼠李糖当量来量化总RL含量
- 取1.2 mL处于稳定期的培养物（培养24小时）置于1.5 mL离心管中，在4 °C条件下以3,000 × g离心3分钟。将上清液收集至洁净的离心管中。
- 转移333 µL至洁净的离心管中（该步骤需设三个重复），加入1 mL乙醚。
- 在涡旋振荡器上剧烈振荡30秒。每次处理一个离心管，重复此操作。
- 在4 °C条件下以3,000 × g离心2分钟。收集有机相（上层相），转移至洁净的离心管中，并在通风橱中敞口放置至完全干燥。
- 按照步骤2.2所述方法，再次使用乙醚进行提取。重复步骤2.3和2.4。
- 待样品完全干燥后，向每根离心管中加入1 mL水。将离心管静置12小时，使鼠李糖脂（RL）充分水合，然后在涡旋振荡器上剧烈振荡。
- 将一个洁净的烧瓶置于冰中冷却5分钟（该反应为放热反应）。配制60% H2SO4溶液（需避光保护烧瓶）。
- 在洁净的离心管中，用蒸馏水配制1.6%地衣酚溶液。配制地衣酚试剂时，将4.4 mL的60% H2SO4溶液与0.6 mL的1.6%地衣酚溶液混合。
- 计算所需地衣酚试剂的最终体积。向每个样品及标准曲线中的每个浓度点（通常使用9个不同浓度的鼠李糖，浓度范围为1 µg/mL至9 µg/mL）以及一个仅含100 µL水的对照组中，各加入900 µL该试剂，所有操作均需设三个重复。
- 在玻璃试管中，向900 µL地衣酚试剂中加入100 µL各RL样品溶液，并充分混合两种溶液。
- 在预热至80 °C的水浴中孵育30分钟。
- 让试管自然冷却至室温。
- 使用石英比色皿，在421 nm波长下测定样品及标准曲线的吸光度。
- 通过标准曲线插值法计算各样品中鼠李糖的浓度，并结合测定所用体积进行校正。
- 若需计算µM浓度，将测得的µg/mL浓度值除以182.2（鼠李糖的分子量），再乘以1000。
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结果
本文中，采用三种不同的铜绿假单胞菌标准菌株代表三个系统发育群，各菌株产生鼠李糖脂（RL）的水平以及单鼠李糖脂（mRL）与双鼠李糖脂（dRL）的比例均有所不同。这些菌株包括PAO1（1955年来自澳大利亚的伤口分离株）22），PA14（1977年来自美国的植物分离株）23），以及PA7（2010年来自阿根廷的临床分离株）24）。作为阴性对照，使用 PAO1 rhlA 使用了无法产生鼠李糖脂（RL）的突变株。所有菌株均在特制的PPGAS培养基中培养24小时，该培养基旨在促进高水平的RL生成。25，在 37 °CPPGAS 培养物在 600 nm 处以 0.05 的光密度接种于 LB 培养基中26 过夜培养。通常， P. aeruginosa 菌株在 PPGAS 培养基中培养 24 小时后，在 600 nm 处测得的光密度达到 2，这大约相当于 1 x 109<...
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讨论
检测和定量RL最准确的方法是高效液相色谱法（HPLC）与质谱法（MS）联用7,8,27；然而，该方法需要专用且昂贵的设备，许多研究人员可能无法获得。本文所述方法可使用常规实验室材料和设备常规开展，用于检测和估算RL浓度，但这些方法存在一些局限性，特别是难以准确测定mRL和dRL的混合物。此外，用于RL定量的样品制备应谨慎操作。用于RL检测和定量的培养物不应处于稳定期后期，因为细胞可能发生聚集或裂解，导致细胞悬液不均一，从而引起实验结果的变异。此外，细胞碎片可能干扰地衣酚法的测定。
当使用适当的对照（例如）执行所述方案时，可获得准确的结果 铜绿假单胞菌 无法产生RL的菌株（如PAO1 Δ）rhlA 突变体20 本研究中使用， 图2）。这些结果有助于表征不同 ...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
GSCh 实验室的部分资助来自墨西哥国立自治大学学术人员事务总局（DGAPA-UNAM）科技研究与创新项目支持计划（PAPIIT）的 IN201222 项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-萘酚 | SIGMA-ALDRICH | 70442 | |
| 乙酸 | J.T. BAKER | 9508-02 | |
| 离心机 | 用于离心1.5 mL和 50 mL的离心管 | ||
| 氯仿 | J.T. BAKER | 9180-02 | |
| 干燥烘箱 | |||
| 乙醚 | J.T. BAKER | 9244-02 | |
| 玻璃移液管 | SIGMA-ALDRICH | CLS706510 | |
| 盐酸 | J.T. BAKER | 5622-02 | |
| LB | |||
| L-鼠李糖一水合物 | SIGMA-ALDRICH | R-3875 | |
| 甲醇 | J.T. BAKER | 9049-02 | |
| 地衣酚一水合物 | SIGMA-ALDRICH | O1875 | |
| PPGAS肉汤 | Tris HCl (0.12M)，氯化钾 (0.02M)，氯化铵 (0.02M)， 蛋白胨 (1%)，pH 7.4 经高压灭菌。使用前加入 葡萄糖 (5%) 和硫酸镁 (0.0016M) | ||
| 石英比色皿 | SIGMA-ALDRICH | Z276669 | |
| 矩形薄层层析展开槽 | FISHER SCIENTIFIC | K4161801020 | |
| 鼠李糖脂 | SIGMA-ALDRICH | R-90 | |
| 分光光度计 | VIS | ||
| 喷雾器 | SIGMA-ALDRICH | Z529710-1EA | |
| 硫酸 | J.T. BAKER | 9681-02 | |
| 5 mL试管 | CORNING | 352002 | |
| 薄层层析硅胶板 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| 水浴锅 | > 80 °C |
参考文献
- Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. A. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Frontiers in Cell Infection and Microbiology. 7, 1-29 (2017).
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: New insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
- Williams, P., Cámara, M. Quorum sensing and environmental adaptation in Pseudomonas aeruginosa: a tale of regulatory networks and multifunctional signal molecules. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 182-191 (2009).
- Soberón-Chávez, G., González-Valdez, A., Soto-Aceves, M. P., Cocotl-Yañez, M. Rhamnolipids produced by Pseudomonas: From molecular genetics to the market. Microbial Biotechnology (MBT). 14 (1), 136-146 (2021).
- Freschi, L., et al. The Pseudomonas aeruginosa pan-genome provides new insights on its population structure, horizontal gene transfer, and pathogenicity. Genome Biology and Evolution. 11 (1), 109-120 (2019).
- Quiroz-Morales, S. E., García-Reyes, S., Ponce-Soto, G. Y., Servin-Gonzalez, L. Tracking the origins of Pseudomonas aeruginosa phylogroups by diversity and evolutionary analysis of important pathogenic marker genes. Diversity. 14 (5), 345(2022).
- Déziel, E., et al. Liquid chromatography/mass spectrometry analysis of mixtures of rhamnolipids produced by Paeudomonas aeruginosa strain 57RP grown on mannitol or naphthalene. Biochemistry and Biophysic Acta. 1440 (2-3), 244-252 (1999).
- Abdel-Mawgoud, A. M., Lépine, F., Déziel, E. Rhamnolipids: Diversity of structures, microbial origins, and roles. Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1323-1336 (2010).
- Toribio, J., Escalante, A. E., Soberón-Chávez, G. Production of rhamnolipids in bacteria other than Pseudomonas aeruginosa. European Journal of Lipid Science and Technology. 112, 1082-1087 (2010).
- Filbig, M., et al. Metabolic and process engineering on the edge-Rhamnolipids are a true challenge: A review. Biosurfactants. Foundations and Frontiers in Enzymology. Soberón-Chávez, G., et al. , Academic Press. New York. Chapter 8 157-181 (2023).
- Noll, P., et al. Limits for sustainable biosurfactant production: Techno-economic and environmental assessment of a rhamnolipid production process. Bioresource Technology. 25, 101767(2024).
- García-Reyes, S., Cocotl-Yañez, M., González-Valdez, A., Servín-González, L., Soberón Chávez, G. The PqsR-independent quorum-sensing response of Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 outlier-strain reveals new insights on the PqsE effect on RhlR activity. Molecular Microbiology. 116 (4), 1113-1123 (2021).
- Grosso-Becerra, M. V., et al. Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 is a non-virulent strain suitable for mono-rhamnolipids production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (23), 9995-10004 (2016).
- Gutiérrez-Gómez, U., Soto-Aceves, M. P., Servín-González, L., Soberón-Chávez, G. Overproduction of rhamnolipids in Pseudomonas aeruginosa PA14 by redirection of the carbon flux from polyhydroxyalcanoate synthesis and overexpression of the rhlAB-R operon. Biotechnology Letters. 40 (11), 1561-1566 (2018).
- Zibek, S., Soberón-Chávez, G. Overview on glycosylated lipids produced by bacteria and fungi: Rhamno-, Sophoro-, Mannosylerythritol and Cellobiose Lipids. Biosurfactants for a Biobased. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. Hausmann, R., Henkel, M. , Springer. Berlin, Heidelberg. Chapter 4 181(2022).
- Twigg, M. S., et al. Microbial biosurfactant research: time to improve the rigour in the reporting of synthesis, functional characterization and process development. Microbial Biotechnology. 14 (1), 147-170 (2021).
- Matsuyama, T., Sogawa, M., Yano, I. Direct colony thin layer chromatography and rapid characterization of Serratia marscescens wetting agents. Applied and Environmental Microbiology. 53 (5), 1186-1188 (1987).
- Chandrasekaran, E. V., Bemiller, J. N. Constituent analyses of glycosaminoglycans. Methods on Carbohydrate Chemistry. 8, 89-96 (1980).
- Behrens, B., Engelen, J., Tiso, T., Blank, L. M., Hayen, H. Characterization of rhamnolipids by liquid chromatography/mass spectrometry after solid-phase extraction. Analytic and Bioanalytic Chemistry. 408 (10), 2505-2514 (2016).
- Rahim, R., et al. Cloning and functional characterization of the Pseudomonas aeruginosa rhlC gene that encodes rhamnosyltransferase 2, an enzyme responsible for di-rhamnolipid biosynthesis. Molecular Microbiology. 40 (3), 708-718 (2001).
- Irorere, V. U., Tripathi, L., Marchant, R., McClean, S., Banat, I. M. Microbial rhamnolipid production: A critical re-evaluation of published data and suggested future publication criteria. Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (10), 3941-3951 (2017).
- Holloway, B. W. Genetic Recombination in Pseudomonas aeruginosa. Journal of General Microbiology. 13 (3), 572-581 (1955).
- Mathee, K. Forensic investigaction into the origin of Pseudomonas aeruginosa PA14-old but not lost. Journal of Medical Microbiology. 67 (8), 1019-1021 (2018).
- Roy, P. H., et al. Complete genome sequence of the multiresistant taxonomic outlier Pseudomonas aeruginosa PA7. PLoS ONE. 5, e8842(2010).
- Zhang, Y., Miller, R. M. Enhanced octadecane dispersion and biodegradation by a Pseudomonas rhamnolipid surfactant (biosurfactant). Applied and Environmental Microbiology. 58 (10), 3276-3282 (1992).
- Miller, J. Experiments in Molecular Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. 352-355 (1992).
- Abdel-Mawgoud, A. M., Lépine, F., Déziel, E. Liquid chromatography/mass spectrometry for the identification and quantification of rhamnolipids. Pseudomonas Methods and Protocols. 30, 359-373 (2014).
- Lee, D. G., et al. Genomic analysis reveals that Pseudomonas aeruginosa virulence is combinatorial. Genome Biology. 7 (10), 90(2006).
- Kubicki, S., et al. A straightforward assay for screening and quantification of biosurfactants in microbial culture supernatants. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 958(2020).
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