过敏性鼻炎大鼠鼻黏膜组织切片的免疫荧光标记 通过 多色免疫分析

摘要

本方案描述了一种用于评估过敏性鼻炎大鼠模型的多色免疫荧光技术。

摘要

变应性鼻炎（AR）是一种由特异性免疫球蛋白E（IgE）介导的鼻黏膜慢性非感染性炎症性疾病，影响全球约10%至20%的人口。尽管免疫荧光（IF）染色长期以来一直是检测疾病特异性蛋白表达的标准技术，但传统的IF技术在同一样本中检测三种或更多种蛋白表达水平方面存在局限性。因此，近年来发展了多色IF技术，可实现对细胞或组织中多个靶标的同步标记。

本方案全面概述了建立大鼠变应性鼻炎（AR）模型、获取鼻黏膜样本以及多色免疫荧光技术操作的完整流程。AR组所有大鼠均表现出典型的症状，如打喷嚏、流鼻涕和鼻痒，行为学评分≥5分。苏木精-伊红（H&E）染色显示AR组炎症细胞数量增加，鼻黏膜完整性受损。多色免疫荧光（mIF）结果显示，AR大鼠鼻黏膜组织中RORγt和TICAM-1表达升高，而Foxp3表达降低。

引言

变应性鼻炎（AR）是一种主要由特异性免疫球蛋白E（IgE）介导的慢性非感染性鼻黏膜炎症^1,2。其特征症状包括打喷嚏、流涕、鼻塞和鼻部瘙痒。随着工业化和城市化进程，AR的患病率逐渐上升，影响全球约10%–20%的人口¹。免疫荧光（IF）技术是一种利用抗体-抗原结合反应的荧光染色方法，可用于检测和定量生物组织或细胞中特定蛋白质的分布及表达水平。在AR研究中，IF可同时检测多种靶标，包括与AR相关的细胞因子、炎症细胞、受体等，有助于探讨AR的发病机制及药物作用效果^3,4,5,6。

多色免疫荧光（mIF）染色过程与传统免疫荧光（IF）非常相似，但在每轮染色过程中增加了抗体洗脱步骤。这一改进使得通过连续的单标记和多轮重复染色，能够在同一组织切片上同时检测多种生物标志物。mIF基于酪胺信号放大技术（TSA），可实现TSA荧光染色的多次循环，并利用微波加热去除抗体，同时保留荧光信号^7,

方案

实验方案和操作程序已获得成都中医药大学行政与动物研究委员会的批准（记录编号：2022DL-010）。8周龄雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，体重180–200 g，从商业渠道获得（见材料表），在自然光照/黑暗循环条件下饲养，环境温度控制在（23 ± 2 °C），相对湿度为（55% ± 10%）。将12只大鼠随机分为两组：对照组和AR组。所有大鼠在试验开始前均在此环境中适应一周，可自由进食和饮水。

1. 建立大鼠AR模型

1. 制备致敏溶液：将30 mg卵清蛋白（OVA）和3 g Al(OH)₃悬浮于溶液中₃ 在100 mL生理盐水中（参见 材料表)^14,15.
2. 基础致敏：抓握并固定完全清醒的大鼠，使其腹部朝上。使用浸有75%酒精的棉球对腹部进行消毒。用1.5 mL注射器将步骤1.1中配制的致敏溶液1 mL注入AR组大鼠的左侧腹腔。每隔两天重复注射一次，持续14天（图1A).
   注意：注射时应确保大鼠头部低于尾部，以防止插入注射器时损伤大小肠。注射部位位于腹侧正中线旁1.5 cm处。对照组大鼠应于14天内每两天接受一次腹....

结果

通过腹腔注射和鼻腔激发OVA，成功建立了六只SD大鼠的变应性鼻炎（AR）模型。AR组中所有大鼠均成功诱导出AR，占该组的100%。AR组所有大鼠均表现出典型的症状，如打喷嚏、流鼻涕和鼻痒。所有行为学观察评分均≥5分（表2）。

H&21号染色结果^st 建模当天的观察显示，对照组大鼠鼻黏膜的上皮细胞和纤毛排列整齐，未见炎性细胞浸润迹象。相反，过敏性鼻炎组大鼠鼻中隔黏膜出现损伤和脱落，并伴有明显的中性粒细胞浸润（图3).

与对照组相比，在过敏性鼻炎大鼠的鼻黏膜组织中观察到RORγt（Th17细胞特异性转录因子）和TICAM-1（Toll样受体衔接分子-1）的表达升高，而Foxp3（Treg细胞特异性转录因子）的表达降低（图4）。

讨论

变应性鼻炎（AR）是一种由环境和遗传因素共同作用引起的鼻黏膜非感染性炎症性疾病。它已成为全球性的健康问题，影响工作效率，降低生活质量，损害睡眠和认知功能，并导致易怒和疲劳。AR影响全球10%至20%的人口¹，带来巨大的经济负担，仅欧盟国家每年的损失就高达300至500亿欧元¹⁸。此外，多项研究已证实AR与哮喘之间存在显著关联^18,19,20，患有AR的个体发展为哮喘的可能性是无AR者的七倍²¹。目前的研究表明，辅助性T细胞1型（Th1）与辅助性T细胞2型（Th2）之间的失衡，尤其是向Th2细胞偏移，是导致AR的重要因素。Th2细胞在白细胞介素-4的刺激下产生IL-5和IL-13等Th2样细胞因子，从而触发B淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和树突状细胞的炎症反应²²。此外，近期关于AR的研究表明，辅助性Th17细.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Al(OH)3	索莱宝生物科技有限公司	A7130
75%乙醇	安徽怡仁安医疗科技有限公司	20210107
氨水	成都科隆化学品有限公司	2021070101
无水乙醇	成都科隆化学品有限公司	2022070501
抗荧光淬灭封片剂	SouthernBiotech	0100-01
自动染色机	Thermo Scientific	Varistain Gemini ES
载玻片架	南通美维德实验设备有限公司	220518001
柠檬酸-磷酸盐缓冲液	赛维尔生物科技有限公司	G1201
柠檬酸抗原修复液（pH 6.0）	厦门谊瑞生物科技有限公司	G1201
盖玻片	南通美维德实验设备有限公司	220518001
盖玻片	南通美泰生物科技有限公司	CS01-2450
CY3-酪胺	赛维尔生物科技有限公司	G1223-50UL
DAPI	赛维尔生物科技有限公司	G1012
脱色摇床	SCILOGEX	S1010E
EDTA脱钙液	武汉谊瑞生物科技有限公司	CR2203047
电热鼓风干燥箱	上海一恒科学仪器有限公司	DHG-9240A
包埋盒打号机	Thermo Scientific	PrintMate AS
包埋机	武汉俊杰电子有限公司	JB-P5
快速组织脱水机	Thermo Scientific	STP420 ES
封片机	Thermo Scientific	Autostainer 360
FITC-酪胺	赛维尔生物科技有限公司	G1222-50UL
荧光显微镜	舜宇光学科技有限公司	CX40
Foxp3	联科生物技术有限公司	bs-10211R
冷冻台	武汉俊杰电子有限公司	JB-L5
羊抗兔IgG H&L (HRP)	联科生物技术有限公司	GAR0072
羊血清	百奥莱博	BL210A
H&E染色试剂盒	雷根	DH0020
止血钳	上海医疗器械有限公司	J31010
盐酸	西陇科学股份有限公司四川分公司	210608
免疫组化笔	百奥莱博	BC004
微波炉	美的	M1-L213B
中性树胶	国药集团化学试剂有限公司	10004160
卵清蛋白	索莱宝生物科技有限公司	A804010
烘箱	上海一恒科学仪器有限公司	DHG-9240A
掌上离心机	SCILOGEX	D1008E
多聚甲醛	碧云天生物技术有限公司	P0099-100ml
病理切片扫描仪	3DHISTECH Kft	Pannoramic SCAN
PBS缓冲液	百奥莱博	G4202
移液器	Dragon	KE0003087/KA0056573
Rorγt	联科生物技术有限公司	DF3196
手术刀	泉州卓越医疗器械有限公司	20170022
自发性荧光淬灭剂苏丹黑B	生物工程有限公司	A602008-0025
切片机	Thermo Scientific	HM325
切片机	Thermo Scientific	HM325
载玻片	南通美泰生物科技有限公司	PC2-301
SD大鼠	四川省中医药科学院	SYX 2023-0100
TICAM-1	联科生物技术有限公司	DF6289
组织剪	上海医疗器械有限公司	J22120
展片烘片机	武汉俊杰电子有限公司	JK-6
TYR-690荧光染料	上海如通生物科技有限公司	RC0086-34RM
涡旋混合器	SCILOGEX	SLK-O3000-S
水浴式载玻片干燥器	武汉俊杰电子有限公司	JK-6
石蜡修块机	武汉俊杰电子有限公司	JXL-818
二甲苯	成都科隆化学品有限公司	2022051901