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方法文章

过敏性鼻炎大鼠鼻黏膜组织切片的免疫荧光标记 通过 多色免疫分析

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DOI：

10.3791/65937

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2023年9月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种用于评估过敏性鼻炎大鼠模型的多色免疫荧光技术。

摘要

变应性鼻炎（AR）是一种由特异性免疫球蛋白E（IgE）介导的鼻黏膜慢性非感染性炎症性疾病，影响全球约10%至20%的人口。尽管免疫荧光（IF）染色长期以来一直是检测疾病特异性蛋白表达的标准技术，但传统的IF技术在同一样本中检测三种或更多种蛋白表达水平方面存在局限性。因此，近年来发展了多色IF技术，可实现对细胞或组织中多个靶标的同步标记。

本方案全面概述了建立大鼠变应性鼻炎（AR）模型、获取鼻黏膜样本以及多色免疫荧光技术操作的完整流程。AR组所有大鼠均表现出典型的症状，如打喷嚏、流鼻涕和鼻痒，行为学评分≥5分。苏木精-伊红（H&E）染色显示AR组炎症细胞数量增加，鼻黏膜完整性受损。多色免疫荧光（mIF）结果显示，AR大鼠鼻黏膜组织中RORγt和TICAM-1表达升高，而Foxp3表达降低。

引言

变应性鼻炎（AR）是一种主要由特异性免疫球蛋白E（IgE）介导的慢性非感染性鼻黏膜炎症1,2。其特征症状包括打喷嚏、流涕、鼻塞和鼻部瘙痒。随着工业化和城市化进程，AR的患病率逐渐上升，影响全球约10%–20%的人口1。免疫荧光（IF）技术是一种利用抗体-抗原结合反应的荧光染色方法，可用于检测和定量生物组织或细胞中特定蛋白质的分布及表达水平。在AR研究中，IF可同时检测多种靶标，包括与AR相关的细胞因子、炎症细胞、受体等，有助于探讨AR的发病机制及药物作用效果3,4,5,6。

多色免疫荧光（mIF）染色过程与传统免疫荧光（IF）非常相似，但在每轮染色过程中增加了抗体洗脱步骤。这一改进使得通过连续的单标记和多轮重复染色，能够在同一组织切片上同时检测多种生物标志物。mIF基于酪胺信号放大技术（TSA），可实现TSA荧光染色的多次循环，并利用微波加热去除抗体，同时保留荧光信号7,8。与传统IF相比，mIF具有多项优势：（1）能够检测传统IF难以识别的低表达抗原9,10；（2）染色质量高，信噪比更优；（3）可对组织特异性结构和感兴趣区域进行定量分析11；（4）通过多重检测多个信号通路，可高效利用组织样本，节约有限的病理资源12；（5）mIF的多参数分析可提供对组织更深入的理解，揭示隐藏的生物学信息13。

总体而言，多重免疫荧光（mIF）技术能够在同一样本中观察不同抗原的表达与分布情况，有助于对目标蛋白的研究。未来，希望了解多种目标蛋白表达与分布特征的研究人员将发现该技术是一种有价值的工具。本研究展示了mIF技术在对过敏性鼻炎（AR）大鼠鼻黏膜样本进行染色中的应用，并评估了AR大鼠模型的建立情况。

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方案

实验方案和操作程序已获得成都中医药大学行政与动物研究委员会的批准（记录编号：2022DL-010）。8周龄雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，体重180–200 g，从商业渠道获得（见材料表），在自然光照/黑暗循环条件下饲养，环境温度控制在（23 ± 2 °C），相对湿度为（55% ± 10%）。将12只大鼠随机分为两组：对照组和AR组。所有大鼠在试验开始前均在此环境中适应一周，可自由进食和饮水。

1. 建立大鼠AR模型

  1. 制备致敏溶液：将30 mg卵清蛋白（OVA）和3 g Al(OH)₃悬浮于溶液中3 在100 mL生理盐水中（参见 材料表)14,15.
  2. 基础致敏：抓握并固定完全清醒的大鼠，使其腹部朝上。使用浸有75%酒精的棉球对腹部进行消毒。用1.5 mL注射器将步骤1.1中配制的致敏溶液1 mL注入AR组大鼠的左侧腹腔。每隔两天重复注射一次，持续14天（图1A).
    注意：注射时应确保大鼠头部低于尾部，以防止插入注射器时损伤大小肠。注射部位位于腹侧正中线旁1.5 cm处。对照组大鼠应于14天内每两天接受一次腹腔注射，每次注射1 mL生理盐水。
  3. 鼻腔激发：给予50 µL 5% OVA 通过 使用100 µL移液器滴加鼻滴液图1B) 在基础致敏后的第二天开始，连续重复此操作7天（图1C).
    ​注意：通过将5 g OVA与100 mL生理盐水混合制备5% OVA溶液。对于对照组，给予相同体积的生理盐水滴注。

2. 大鼠行为学评分

  1. 在末次鼻腔激发后30分钟内，使用数码相机观察并记录大鼠的鼻搔抓、打喷嚏和流鼻涕等症状，评分标准见表1（图1D）。
    ​注意：过敏性鼻炎模型成功建立的判定标准为总评分≥5分14。

3. 鼻黏膜样本的采集

  1. 处死大鼠：通过暴露于过量 CO2 的方式处死大鼠。随后用 75% 乙醇对大鼠进行消毒（参见材料表）。使用手术刀沿口角两侧做切口，以暴露肌肉组织（图 2A）。接着使用组织剪剪开颅骨两侧的颧骨与下颌骨关节（图 2B），并移除下颌骨（图 2C）。
  2. 暴露鼻腔：使用止血钳分离上颌骨皮肤（图 2D），以暴露鼻腔（图 2E）。用组织剪剪断鼻腔与上颌骨之间的骨性连接（图 2F）。然后在眶下孔处切断鼻腔与双侧眼眶骨之间的连接（图 2G），并取出鼻腔组织（图 2H）。
  3. 固定：将取出的鼻腔组织置于 4% 多聚甲醛中进行固定，在室温下保存 24–72 小时（参见材料表）。
    注意：确保所用多聚甲醛固定液的量足以完全浸没组织样本，以实现充分固定。

4. 鼻黏膜样本的预处理

  1. 脱钙：从步骤3.1中取出的组织开始进行固定。用PBS清洗三次，每次20分钟。随后用蒸馏水清洗三次，每次20分钟。接着在脱钙液中进行脱钙处理，脱钙液体积应为组织体积的20-30倍，在室温下进行。
    1. 脱钙液（见材料表）应维持pH值在7.2-7.4之间。最后将脱钙后的组织放入脱水盒中。
      注意：脱钙液需每周更换一次。当组织变软时（约2个月），即可结束脱钙过程。
  2. 脱水与浸蜡：将脱水盒转移至脱水机中（见材料表）。依次使用75%乙醇处理4小时、85%乙醇处理2小时、90%乙醇处理2小时、95%乙醇处理1小时。
    1. 随后将组织浸入无水乙醇中30分钟，重复一次；再用二甲苯处理5-10分钟，重复一次；将组织浸入石蜡中1小时，重复一次；最后再将组织浸入石蜡中额外1小时。
  3. 包埋：将熔化的石蜡块放入包埋盒中（见材料表），置于-20 °C冰箱中冷却。待石蜡完全凝固后取出，并对石蜡块进行修整。
  4. 切片：将修整好的石蜡块放入石蜡切片机中（见材料表），切成厚度为3 µm的切片。将切片置于展片机中40 °C的水浴上，展平组织后用载玻片捞起，并在60 °C烘箱中烘干。
    1. 待水分完全蒸发且石蜡充分固化后，取出载玻片，于25 °C条件下保存。

5. 鼻黏膜组织的H&E染色

  1. 脱蜡与水化：将切片放入二甲苯中20分钟，重复一次20分钟；再依次放入无水乙醇中5分钟，重复一次5分钟；75%乙醇中5分钟；最后冲洗5分钟。
  2. 苏木精染色：使用100 µL移液器加入100 µL苏木精染色液（见材料表），染色3–5分钟，冲洗5–10秒；加入100 µL 0.5%盐酸乙醇溶液，分化10–30秒；冲洗5–10秒；加入100 µL 0.2%氨水溶液，返蓝10–30秒；最后冲洗30秒。
    注意：苏木精染色后需用0.5%盐酸乙醇进行分化，以去除细胞核过度结合及细胞质吸附的多余苏木精染料。随后进行伊红染色时，细胞核与细胞质可被清晰着色。分化后切片呈红色或粉红色，因此需立即冲洗，以清除组织切片中的酸，终止分化过程。随后使用0.2%氨水增强细胞核染色效果。
  3. 伊红染色：使用100 µL移液器加入100 µL伊红染色液（见材料表），染色5分钟，然后冲洗30秒。
  4. 脱水与封片：将切片依次浸入无水乙醇中5分钟，重复一次5分钟，再重复一次5分钟；随后放入二甲苯中5分钟，再换一次二甲苯5分钟。最后用中性树胶封片（见材料表）。
  5. 显微镜观察：将染色后的切片置于显微镜载物台上，调节显微镜焦距至图像清晰，设定放大倍数为40倍，拍摄图像。

6. 鼻黏膜组织的多色免疫染色

  1. 脱蜡与水化：步骤同5.1所述。
  2. 柠檬酸-磷酸盐缓冲液处理：将柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 6.0）（见材料表）放入微波炉适用容器中，加热至沸腾后取出，再将切片放入容器中。以中等功率微波加热8分钟至沸腾，关闭加热静置8分钟，再调至中低功率加热7分钟。
    1. 自然冷却后，将切片转移至PBS（pH 7.4）中，置于脱色摇床震荡洗涤3次，每次5分钟。
      注意：确保此过程中缓冲液不蒸发，并防止切片干燥。
  3. 封闭内源性过氧化物酶：将切片干燥，用免疫组化笔在组织周围画圈（防止抗体流失），并在圈内加入3%过氧化氢溶液（过氧化氢：纯水 = 1:9）。
    1. 室温避光孵育15分钟。自然冷却后，将切片置于PBS（pH 7.4）中，在脱色摇床上震荡洗涤3次，每次5分钟。
  4. 封闭：在圈内加入5%山羊血清，孵育30分钟。
  5. 一抗孵育：轻轻吸除封闭液，在切片上加入FOXP3抗体（稀释比例：1:200，见材料表），置于湿盒中，4 °C孵育过夜。
    注意：在湿盒中加入少量水，防止抗体蒸发。
  6. 二抗孵育：将切片置于PBS（pH 7.4）中，在脱色摇床上震荡洗涤3次，每次5分钟。轻轻吸干切片，在圈内加入二抗（Goat Anti-Rabbit IgG H&L，见材料表），室温避光孵育50分钟。
  7. Tyramide稀释液的配制：将100 µL的3% H2O2与100 mL的1x TBST（见材料表）混合。
  8. TSA工作液的添加：将1 mL Tyramide稀释液与2 µL CY3-Tyramide混合，配制成TSA工作液。每张切片加入100 µL TSA工作液，室温避光孵育10分钟。随后用PBS洗涤3次，每次5分钟。
    注意：TSA工作液需现配现用，配制后置于4 °C避光保存，有效期不超过24小时。
  9. 重复步骤6.2–6.8：依次更换为1:200稀释的RORγt抗体（FITC荧光染料标记）和1:200稀释的TICAM1抗体（TYP620染料标记）（见材料表）。
  10. DAPI复染细胞核：轻轻震荡切片使其干燥，加入DAPI染色液，室温避光孵育10分钟。
  11. 淬灭自发荧光：将切片置于PBS（pH 7.4）中，在脱色摇床上震荡洗涤3次，每次5分钟。向切片上加入自发荧光淬灭剂（见材料表），静置5分钟后，再洗涤10分钟。
  12. 封闭：将切片置于PBS（pH 7.4）中，在脱色摇床上震荡洗涤3次，每次5分钟。轻轻震荡切片使其干燥，并用抗荧光淬灭封片剂（见材料表）封片。
  13. 显微镜观察：将染色切片置于显微镜载物台上，调节焦距以获得清晰图像，设定放大倍数为20×和40×，采集图像。
    注意：DAPI的激发波长为330–380 nm，发射波长为420 nm（蓝光）；FITC的激发波长为465–495 nm，发射波长为515–555 nm（绿光）；CY3的激发波长为510–560 nm，发射波长为590 nm（红光）；TYP-690的激发波长为630 nm，发射波长为690 nm（粉光）。

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结果

通过腹腔注射和鼻腔激发OVA，成功建立了六只SD大鼠的变应性鼻炎（AR）模型。AR组中所有大鼠均成功诱导出AR，占该组的100%。AR组所有大鼠均表现出典型的症状，如打喷嚏、流鼻涕和鼻痒。所有行为学观察评分均≥5分（表2）。

H&21号染色结果st 建模当天的观察显示，对照组大鼠鼻黏膜的上皮细胞和纤毛排列整齐，未见炎性细胞浸润迹象。相反，过敏性鼻炎组大鼠鼻中隔黏膜出现损伤和脱落，并伴有明显的中性粒细胞浸润（图3).

与对照组相比，在过敏性鼻炎大鼠的鼻黏膜组织中观察到RORγt（Th17细胞特异性转录因子）和TICAM-1（Toll样受体衔接分子-1）的表达升高，而Foxp3（Treg细胞特异性转录因子）的表达降低（图4）。

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讨论

变应性鼻炎（AR）是一种由环境和遗传因素共同作用引起的鼻黏膜非感染性炎症性疾病。它已成为全球性的健康问题，影响工作效率，降低生活质量，损害睡眠和认知功能，并导致易怒和疲劳。AR影响全球10%至20%的人口¹，带来巨大的经济负担，仅欧盟国家每年的损失就高达300至500亿欧元18。此外，多项研究已证实AR与哮喘之间存在显著关联18,19,20，患有AR的个体发展为哮喘的可能性是无AR者的七倍21。目前的研究表明，辅助性T细胞1型（Th1）与辅助性T细胞2型（Th2）之间的失衡，尤其是向Th2细胞偏移，是导致AR的重要因素。Th2细胞在白细胞介素-4的刺激下产生IL-5和IL-13等Th2样细胞因子，从而触发B淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和树突状细胞的炎症反应22。此外，近期关于AR的研究表明，辅助性Th17细...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由四川省科学技术厅（2021YJ0175）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Al(OH)3索莱宝生物科技有限公司A7130
75%乙醇安徽怡仁安医疗科技有限公司20210107
氨水成都科隆化学品有限公司2021070101
无水乙醇成都科隆化学品有限公司2022070501
抗荧光淬灭封片剂SouthernBiotech0100-01
自动染色机Thermo ScientificVaristain Gemini ES
载玻片架南通美维德实验设备有限公司220518001
柠檬酸-磷酸盐缓冲液 赛维尔生物科技有限公司G1201
柠檬酸抗原修复液（pH 6.0）厦门谊瑞生物科技有限公司G1201
盖玻片南通美维德实验设备有限公司220518001
盖玻片南通美泰生物科技有限公司CS01-2450
CY3-酪胺赛维尔生物科技有限公司G1223-50UL
DAPI赛维尔生物科技有限公司G1012
脱色摇床SCILOGEXS1010E
EDTA脱钙液武汉谊瑞生物科技有限公司CR2203047
电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司DHG-9240A
包埋盒打号机Thermo Scientific PrintMate AS
包埋机武汉俊杰电子有限公司JB-P5
快速组织脱水机Thermo ScientificSTP420 ES
封片机Thermo ScientificAutostainer 360
FITC-酪胺赛维尔生物科技有限公司G1222-50UL
荧光显微镜舜宇光学科技有限公司CX40
Foxp3联科生物技术有限公司bs-10211R
冷冻台武汉俊杰电子有限公司JB-L5
羊抗兔IgG H&L (HRP)联科生物技术有限公司GAR0072
羊血清百奥莱博BL210A
H&E染色试剂盒雷根DH0020
止血钳上海医疗器械有限公司J31010
盐酸西陇科学股份有限公司四川分公司210608
免疫组化笔百奥莱博BC004
微波炉美的M1-L213B
中性树胶国药集团化学试剂有限公司10004160
卵清蛋白 索莱宝生物科技有限公司A804010
烘箱上海一恒科学仪器有限公司DHG-9240A
掌上离心机SCILOGEXD1008E
多聚甲醛碧云天生物技术有限公司P0099-100ml
病理切片扫描仪3DHISTECH KftPannoramic SCAN 
PBS缓冲液百奥莱博G4202
移液器 DragonKE0003087/KA0056573
Rorγt联科生物技术有限公司DF3196
手术刀泉州卓越医疗器械有限公司20170022
自发性荧光淬灭剂苏丹黑B生物工程有限公司A602008-0025
切片机Thermo ScientificHM325
切片机Thermo ScientificHM325
载玻片南通美泰生物科技有限公司PC2-301
SD大鼠四川省中医药科学院SYX figure-materials-1 2023-0100
TICAM-1联科生物技术有限公司DF6289
组织剪上海医疗器械有限公司J22120
展片烘片机武汉俊杰电子有限公司JK-6
TYR-690荧光染料上海如通生物科技有限公司RC0086-34RM
涡旋混合器SCILOGEXSLK-O3000-S
水浴式载玻片干燥器武汉俊杰电子有限公司JK-6
石蜡修块机武汉俊杰电子有限公司JXL-818
二甲苯成都科隆化学品有限公司2022051901

参考文献

  1. Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
  2. Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
  3. Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825(2023).
  4. Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012(2022).
  5. Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294(2019).
  6. Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
  7. Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  8. Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
  9. Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue - a review. Diagnostic Pathology. 9, 221(2014).
  10. Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
  11. Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
  12. Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
  13. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  14. Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
  15. Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
  16. Bousquet, J., et al. Allergic rhinitis. Nature reviews. 6 (1), 95(2020).
  17. Free Thinking. Multiplex fluorescence immunohistochemistry. , http://www.freethinking.com.cn/?xinwendongtai/156.html (2023).
  18. Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314(2015).
  19. Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
  20. Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
  21. Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
  22. Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
  23. Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528(2020).
  24. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
  25. Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
  26. Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
  27. Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
  28. Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
  29. Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
  30. Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
  31. Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  32. Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
  33. Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
  34. Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
  35. Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067(2021).

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过敏性鼻炎大鼠鼻黏膜组织切片的免疫荧光标记 通过 多色免疫分析
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