一种用于研究甲状腺激素对小脑功能影响的多功能行为学方法

摘要

本文介绍了一种近期开发的多功能行为学检测方法——梯梁实验。与传统的运动功能评估行为学实验相比，该实验的优势在于能够检测出中枢神经系统中甲状腺激素作用缺陷所引起的细微小脑性共济失调。

摘要

甲状腺激素（TH）在中枢神经系统（包括小脑）的发育过程中发挥着至关重要的作用。若在生命早期出现TH缺乏，例如先天性甲状腺功能减退症，患者会出现认知迟滞和运动功能障碍等神经系统疾病。目前已有多种研究利用组织或细胞特异性TH缺乏的小鼠模型，来探究TH在小脑中的功能。与全身性先天性甲状腺功能减退小鼠相比，小脑细胞特异性TH缺乏小鼠表现出较轻且较隐匿的共济失调特征，因此在使用转棒实验等常规方法评估运动功能时较为困难。

由于需要一种替代工具来评估与甲状腺激素（TH）相关动物模型的运动功能，我们开发了一种多功能的行为学方法，称为“梯梁实验”。根据模型小鼠共济失调的严重程度，可设计多种不同形式的梯梁测试。我们采用了转基因小鼠模型，该模型小鼠的小脑浦肯野细胞（小脑皮层中调控运动表现的唯一输出神经元）特异性表达显性负性甲状腺激素受体。新建立的梯梁实验能够比旋转棒实验更显著地检测到转基因小鼠在运动表现上的严重损伤。此外，梯梁实验还检测到了运动学习能力的障碍，而旋转棒实验则未能发现这一缺陷。该新型行为学装置的操作方案可应用于其他可能表现出轻度共济失调表型的动物模型，以检测小脑功能的细微变化。

引言

甲状腺激素（TH）对大脑发育至关重要¹。特别是其在小脑中的作用尤为关键，因为生命早期缺乏TH会导致小脑发育异常^1,2。例如，在先天性甲状腺功能减退症患者中，会出现一系列神经系统发育迟滞，包括认知和运动功能障碍³。为了揭示TH在小脑功能发育中的作用，一些研究通过在小脑特定细胞中限制TH缺乏来建立模型⁴。然而，与全身性先天性甲状腺功能减退小鼠（所有组织和细胞均受TH缺乏影响）相比，这类小脑特异性模型所表现出的共济失调极为轻微，常规行为学检测方法（如转棒实验、足迹实验和平衡木实验）几乎无法检测出差异。因此，为了全面研究TH对小脑功能的影响，亟需一种新的评估工具，以检测模型小鼠在运动协调能力上的细微变化。

转棒实验是评估运动协调性最常用的工具，最初由 Dunham 和 Miya⁵ 开发，随后 Jones 和 Roberts⁶ 将其改进为加速版本。小鼠从旋转棒上跌落的潜伏期被用作评估运动协调性的指标，其操作简便、结果简洁，因此在研究运动功能的行为学研究人员中广泛应用⁷。然而，该实验的易用性也是一把双刃剑。由于转棒会自动旋转，小鼠可以紧贴棒体并停留在上面而不进行主动运动。此外，小鼠可能主动选择跌落，而非持续维持在转棒上的平衡状态。在这两种情况下，该实验用于评估"纯粹的运动协调性"的有效性和可靠性均值得怀疑⁷。换句话说，该实验并不能准确反映小脑功能，还可能混杂抓握所需的肌肉力量等其他因素。

与传统的运动协调评估工具不同，本文介绍了一种由我们实验室近期开发的新型行为学检测方法，称为"梯梁实验"。该水平梯式行走实验旨在评估与小脑相关的复杂运动能力：前馈预测及运动整合⁸。实验装置由四块带孔的有机玻璃板组成(图1)。通过将螺钉和杆插入板上的孔中，将四块板平行连接。两块外侧板用于稳定装置，两块内侧板则用于设计不同类型梯梁横档(图2C)。横档宽度根据动物体型进行调整，以尽量减少动物后退行为(图2B)。起点到终点的距离为110 cm。装置位于实验台上方60 cm处，其下方设有安全缓冲垫(图2A)。在终点附近放置一个暗室，以促使动物向目标方向移动(图2A)。

我们利用在小脑浦肯野细胞中表达显性负性甲状腺激素受体（TR）的转基因小鼠（Mf-1/FVB小鼠），研究了甲状腺激素（TH）对小脑功能发育的影响。在转棒实验和梯梁实验中，均观察到Mf-1/FVB小鼠出现小脑共济失调表型；然而，梯梁实验比转棒实验更成功地检测出显著差异(图3)。此外，梯梁实验能更全面地评估运动学习能力(图3B、C)。在该行为表型的细胞机制方面，Mf-1/FVB小鼠浦肯野细胞在接受长时程抑制（LTD）诱导性刺激后，LTD的诱导受到抑制，反而出现了长时程增强（LTP）⁹。LTD对小脑中的运动协调和运动学习至关重要¹⁰。许多研究报道，在小脑功能关键调控基因的敲除或突变小鼠中存在运动功能障碍及LTD抑制现象，但尚无研究报道在LTD诱导性刺激后出现LTP的诱导^11,12。综上所述，这一现象可能为Mf-1/FVB小鼠或TH缺乏小鼠所特有（在成年期起病的甲状腺功能减退小鼠中也观察到相同现象），提示TH对小脑功能的调控机制不同于其他关键蛋白。若确实如此，则TH作用异常的小鼠可能并不以与其他模型小鼠相同的方式表现出小脑共济失调。这再次强调了建立特异性方法以评估TH对小脑功能影响的必要性。本文提出了一种利用新建立的梯梁实验研究TH对小脑功能影响的创新性实验方案。

方案

本研究的动物实验方案已获得群马大学动物护理与实验委员会的批准。所有动物护理和处理程序均依照日本《动物福利与管理法》以及日本科学理事会发布的《动物实验的适当实施指南》进行。该设备的装配图见图1。

1. 梯子设置

1. 水平梯测试（图2C 左侧）
   1. 将铝棒（直径2 mm）插入亚克力板壁上的孔中。
      注：间隔距离根据测试小鼠的品系或性别导致的体型差异而变化（见表1）。
   2. 通过扩大或缩小亚克力板壁之间的距离来调节梯子横档的宽度。
      注：宽度可能根据测试小鼠的品系或性别导致的体型差异而变化（见表1）。
2. 之字形梯测试（图2C 右侧）
   1. 将铝棒（直径2 mm）插入亚克力板壁上水平和垂直方向每隔两个孔的孔位中。
      注：间隔距离根据测试小鼠的品系或性别导致的体型差异而变化（见表1）。
   2. 通过扩大或缩小亚克力板壁之间的距离来调节梯子横档的宽度。
      ​注：宽度可能根据测试小鼠的体型、品系或性别而变化（见表1）。
   3. 将暗室放置在目标位置。
   4. 为安全起见，在梯子装置下方30 cm处放置缓冲垫（可用装有缓冲材料的塑料袋制成）。

2. 习惯化（第0天）

注意：建议至少用 1 天时间使小鼠适应梯子装置。

1. 将小鼠放置在梯子的边缘（起始点）。
2. 使用气流刺激，促使小鼠在梯子横档上向前移动。
3. 重复操作，直至小鼠适应在梯子横档上行走。

3. 运动功能的测量

1. 将小鼠置于梯子的边缘（起始点）。
2. 记录小鼠完成穿越梯子所需的时间，以及当小鼠未能将爪子准确放置在铝棒上或放置后发生滑动时的踩空次数（见图2D）。如有可能，录制视频以便后续检查错误步态。
3. 间隔15分钟后，重复测量（每天进行4-5次试验）。
4. 为评估运动学习能力，连续重复实验3-4天。

4. 分析

1. 计算每天的时间和足部打滑次数的平均值。
2. 比较各组之间的平均值。

结果

在转棒实验中，与野生型小鼠相比，Mf-1/FVB 小鼠在连续3天内从旋转棒上跌落的潜伏期显著缩短，表明其运动协调能力受损(图3A)。然而，在组内结果方面，Mf-1/FVB 小鼠从第1天到第3天的表现显著改善，提示其运动学习能力得以保留(图3A)。

水平梯和之字形梯测试均检测到 Mf-1/FVB 小鼠的运动协调能力出现显著损伤，表现为完成穿越梯子所需时间明显延长，且脚滑次数多于野生型小鼠（图3B，C）。更重要的是，Mf-1/FVB 小鼠在连续3天内评分未见改善，而野生型小鼠则表现出进步（图3B，C）。与转棒实验不同，Mf-1/FVB 小鼠在梯子行走测试中未能表现出任何运动学习能力。这些结果表明，梯子行走测试在评估运...

讨论

我们的设计借鉴了Metz和Whishaw之前的研究，他们报道了"梯格行走试验"^13,14的实用性。他们设计梯格行走试验用于评估精细行走能力，并通过让动物在水平梯子上从起点走向目标点，来测量前肢和后肢的落脚、迈步以及肢体间的协调性^13,14。我们的梯子行走试验与他们的不同之处在于其灵活性：实验者可通过改变垂直方向5个孔位和水平方向100个孔位中铝棒的位置，调整梯子结构，从而改变试验的复杂程度。"之字形梯子试验" (图2C 右图和 图3C) 使实验者能够检测旋转杆试验无法评估的更复杂的运动行为。这类复杂运动需要肢体运动的协调，可能反映了小脑功能¹⁵

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
气流刺激器	DAISO
铝棒	CAINZ		直径2 mm，数量根据梯子设计可能有所不同。制作水平梯子（横档间距4 cm）大约需要30根。
蓝丁胶	Bostik
有机玻璃板	CAINZ		110 cm × 20 cm，110 cm × 10 cm，每种各两块
螺丝	CAINZ