方法文章

用于多重荧光成像的琼脂糖包埋肺组织自动振动切片

DOI：

10.3791/65943

⸱

2023年10月6日

 ,  , 
1Wallenberg Centre for Molecular Medicine, Lund University, 2Department of Clinical Sciences, Lund University, 3Lund Stem Cell Centre, Lund University, 4Department of Cardiothoracic Surgery and Transplantation, Skåne University Hospital

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们开发了一种利用振动切片机和琼脂糖包埋的肺组织进行组织处理的技术，以制备肺组织切片，从而获得肺部结构的高分辨率图像。我们采用免疫荧光染色法，结合特异性的肺结构标志物，观察蛋白质的空间表达分布。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于肺组织本身结构脆弱，被认为是进行显微成像分析较难处理的组织之一。为了在切片时提供结构支撑，肺组织通常被包埋在石蜡或OCT包埋剂中，并分别使用切片机或冷冻切片机进行切片。一种较新的技术称为精密切割肺片（precision-cut lung slices），通过琼脂糖渗透为新鲜肺组织提供结构支持，并为原代肺组织的体外培养提供了平台。然而，由于表位遮蔽和组织形变，这些技术均难以适用于开发可重复的高级光学成像分析方法，也无法兼容多种抗体和不同物种。

为此，我们开发了一种组织处理流程，该流程采用琼脂糖包埋固定后的肺组织，并结合自动振动切片技术。该方法可从小鼠、猪和人肺组织中制备出厚度在200 µm至70 µm之间的肺切片，且无需进行抗原修复，代表了对原位分离组织最少“加工”的处理方式。利用这些组织切片，我们建立了一种多重成像检测方法，能够生成高分辨率图像，其空间蛋白表达信息可用于定量分析，并更深入地理解肺损伤与再生的潜在机制。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

离体肺组织切片被广泛用于肺部疾病的研究1。目前的金标准，特别是在临床和转化性大型动物研究中，通常采用苏木精-伊红染色结合明场显微镜观察及基于观察者的评分方法来评估和分级肺功能障碍2,3。尽管该技术仍然具有重要价值，但在空间分辨率以及可同时成像的标记物数量方面存在局限性。此外，肺组织需要经过大量基于有机溶剂的清洗步骤，导致组织在最终成像前经历脱水、收缩和再水化过程4。这一过程不仅耗时，而且对环境不友好，会遮蔽蛋白表位，并可能引发组织结构的改变5,6,7,8。然而，由于肺组织结构脆弱，在切片前通常必须进行石蜡包埋。相比之下，脑等实体器官则可在固定或新鲜状态下直接使用振动切片机（vibratome）进行切片9,10,11,12。

为了实现肺组织的振动切片，已建立了一种称为精密切割肺切片 (PCLS) 的方法，该方法通过气道或血管将低熔点琼脂糖注入新鲜肺组织，并使其凝固13,14。气道中的琼脂糖可提供足够的结构支撑，从而允许进行振动切片9,14。在啮齿类动物中，可通过气管直接注射琼脂糖，操作较为简便；然而，在猪和人肺组织中，往往难以在给定的活检样本中找到合适的气道或血管15,16。此外，即使找到了合适的气道或血管，通常也需要施加较大的压力才能完成琼脂糖注射，这可能会影响后续的肺组织形态17。

为克服石蜡包埋/切片/染色以及PCLS工作流程中遇到的挑战，我们建立了一种新的固定肺组织处理流程。该流程可使用振动切片机进行切片，能够获得比PCLS更薄的切片，并且所得切片在进行多重荧光成像时无需抗原修复。该方法提供了一种"最小化处理"的方式来制备可用于先进光学显微镜观察的肺组织切片。此外，通过获取组织的三维结构信息，成像结果可用于展示肺组织内细胞与解剖结构之间的空间关系18,19,20,21。本文描述了制备此类肺组织切片的实验方案，并展示了应用于这些组织的多重染色方法，以及如何利用这些先进的成像数据进行定量分析。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小鼠肺脏由使用其他器官系统的研究人员捐赠，以践行“3R”原则。所有猪的实验操作均依照欧洲指令 2010/63/EU 进行，并经马尔默-隆德动物研究伦理委员会（Dnr 5.8.18-05527/2019）批准，同时遵循瑞典研究理事会的 CODEX 指南。使用人源样本的许可由瑞典国家伦理委员会批准（Dnr 2020-07115 和 Dnr 2020-01864）。有关本实验方案中使用的所有材料和仪器的详细信息，请参见材料表。

1. 溶液与材料的准备

  1. 将肺组织在室温下用 4% 多聚甲醛固定 48 小时。随后，将肺组织转移至含有 0.01% 叠氮化钠的磷酸盐缓冲液（PBS）中，置于 50 mL 锥形管内。
  2. 通过将 1.5 g 低熔点琼脂糖溶解于 50 mL 无菌 PBS 中，制备 3%（w/v）琼脂糖溶液。准备一个塑料杯、精细镊子和无菌剪刀。
  3. 将琼脂糖在微波炉中加热至沸腾，然后在水浴中冷却至 42 °C。使用前将琼脂糖保持在水浴中，以维持其液态。
    注意：加热琼脂糖时，需在微波炉旁观察，防止沸腾溢出。通常需要约 1.5 分钟。

2. 琼脂糖包埋的肺组织

  1. 将肺活检组织从 PBS-叠氮化钠溶液中取出，使用精细镊子和无菌剪刀小心分离肺叶。将肺叶切成更小的组织块。
    注意：虽然可以保留胸膜进行切片，但其较厚的弹性纤维束可能妨碍振动切片机刀片切割。因此，若非必要，建议将其去除。
  2. 将一个塑料杯从中间切开，并在其底部加入少量琼脂糖。将一个50 mL锥形管的管盖（去除边缘）放置在琼脂糖表面，然后将杯子置于4 °C环境中5分钟，使琼脂糖凝固，以备后续使用。
  3. 从4 °C冰箱中取出塑料杯，在管盖表面加入约1 mL液态琼脂糖，然后轻轻将肺组织块放置于管盖上。在室温下静置2–3分钟，使琼脂糖部分凝固。随后，缓慢将液态琼脂糖倒入，直至完全浸没肺组织。
  4. 置于4 °C冰箱中冷藏约15分钟，直至琼脂糖完全凝固。接着，小心使用锋利刀片去除肺组织周围的多余琼脂糖，使组织周围保留一层厚度均匀、约5 mm的琼脂糖包埋层（图1）。

3. 切割肺组织切片

  1. 为准备肺组织切片，使用超级胶水将每块组织固定在振动切片机的样品盘上。接着，用 PBS 填充振动切片机的缓冲槽，并在周围的冰浴中放入冰块。最后，小心地将样品盘安装到缓冲槽中。
  2. 使用以下参数设置对肺组织进行振动切片：厚度：200 µm，频率：100 Hz，刀片振幅：1.3 mm，刀片前进速度：0.02–0.03 mm/s，具体速度取决于组织的硬度。
    注意：若将刀片速度降低至 0.01 mm/s，可实现低至 70 µm 的切片厚度。某些振动切片机（例如 Leica V1200s）可通过设定切片窗口实现切片过程的自动化。
  3. 为收集切片，使用刷子轻轻将振动切片机槽中的组织切片舀起，并转移至含有 PBS 中 0.01% 叠氮化钠的 24 孔板中。最后，将肺组织切片在 4 °C 下保存。

4. 弹性蛋白、CD31、HTII-280 和 SMA 的免疫染色

  1. 在 4 °C 条件下，将组织置于含有 1% 牛血清白蛋白、0.5% Triton 和 5% 正常山羊血清的溶液中，轻轻振荡孵育 45 分钟，进行通透和封闭处理。
  2. 用 PBS 稀释一抗 （SMA 1:500；elastin 1:250；CD31 1:250；HTII-280 1:250），每孔加入 300 µL，在 4 °C 轻轻振荡孵育过夜。
  3. 避免触碰组织切片，使用移液枪头移除一抗溶液后，用 PBS 洗涤 3 次，每次 20 分钟（每次 400 µL）。
  4. 用 PBS 稀释二抗 （1:1000），每孔加入 300 µL，在 4 °C 轻轻振荡孵育 90 分钟。
  5. 用移液枪头移除二抗溶液，加入 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1:1000）和番茄凝集素-488（tomato lectin-488）（1:500），室温孵育 30 分钟，随后用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
  6. 在载玻片上滴加三滴封片剂，盖上盖玻片，进行成像分析。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

制备肺组织切片的过程包括多个关键步骤，如组织准备、包埋和切片。通过将1.5 g低熔点琼脂糖溶解于50 mL无菌PBS中，配制3% (w/v)的琼脂糖溶液。所需耗材包括一个塑料杯、一个50 mL锥形管的管盖（去除边缘）、镊子和剪刀。使用精细镊子和无菌剪刀小心地将肺组织剪切成较小的组织块（图1A，B）。接下来，为包埋肺组织块，先在塑料杯底部加入少量琼脂糖溶液，将管盖置于琼脂糖表面，并将杯子置于4 °C环境中5分钟（图1C）。随后，在管盖上加入约1 mL液态琼脂糖，并将肺组织块放置于管盖上。在室温下静置2–3分钟，使琼脂糖部分凝固（图1D）。当肺组织块被半凝固的琼脂糖固定后，继续向杯中倒入液态琼脂糖，直至完全浸没肺组织块。然后将样品置于4 °C环境中15分钟（图1E，F）。低熔点琼脂糖包埋为肺组织提供了必要的支撑和刚性，有助于在切片过程中维持其原始结构。使用锋利刀片去除肺组织周围多余的琼脂糖，保留组织周围约5 mm厚度的均匀包埋层（图1G）。随后，将包埋好的肺组织块小心地粘附在组织固定夹上（图1H）。将PBS加入振动切片机的缓冲槽中，冰块置于周围的冰浴中，并将样品盘安装至缓冲槽内（图1I）。在控制面板上设置的振动切片参数如下：切片厚度：200 µm；振动频率：100 Hz；刀片振幅：1.3 mm；刀片前进速度：0.02–0.03 mm/s，具体数值取决于组织的硬度（图1J）。最后，对自由漂浮的切片进行染色处理（图1K-M）。

对每种物种的200 µm切片进行免疫荧光染色，检测平滑肌肌动蛋白（SMA，平滑肌细胞和肌成纤维细胞标志物）、弹性蛋白（细胞外基质蛋白）以及番茄凝集素（LEA），后者可结合支气管肺泡上皮细胞。肺是结构异质性组织，因此在不同结构中可观察到SMA和弹性蛋白分布的差异，这些结构包括小鼠、猪和人类的肺泡管、血管、肺内细支气管以及肺泡（图2A-L）。对细支气管20 µm体积的高分辨率成像显示，肺内精细结构可在半三维水平上进行观察（补充视频S1）。作为定量示例，通过图像追踪技术，我们展示了不同样本间肺泡大小的差异（n = 20个肺泡）（图2L，M）。

为了展示如何对这些高级成像数据进行定量利用，我们比较了成人与婴儿人肺组织中Ⅱ型肺泡上皮细胞（TII）的分布情况。人源性Ⅱ型肺泡细胞特异性抗体HTII-280对人Ⅱ型细胞表面具有强亲和力（图3A-F）。利用容积成像技术，可在单个肺泡的三维空间中进一步观察这些细胞补充视频 S2）。为了量化成人与婴儿样本之间的II型肺泡细胞（TII）数量，我们对10个随机视野（fov）中的HTII-280阳性细胞进行了计数。在这些样本之间，婴儿样本的TII细胞数量显著更高（图 3G然而，婴儿样本的支架覆盖率也显著高于成人样本，这可能解释了其较高的细胞数量图3H）。为了对此进行校正，我们随后基于支架覆盖度评估了TIIs数量，单位为每平方毫米细胞数2 的组织，其中婴儿样本中仍维持显著更高数量的TIIs（图3I因此，婴儿样本中较高的II型肺泡细胞（TII）计数并非源于支架覆盖面积的增加，这凸显了在评估肺组织细胞分布时，应基于支架面积而非整个视野（fov）进行分析的重要性。

使用琼脂糖制备、切片机切片、染色步骤的组织包埋与切片过程。
图 1：肺组织切片制备流程图。（A）溶液与材料：将1.5 g低熔点琼脂糖溶于50 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中制得的3%（w/v）琼脂糖溶液；塑料杯；50 mL锥形管盖；镊子和剪刀。（B）使用精细镊子和无菌剪刀分离肺组织。（C）在杯底加入少量琼脂糖，将管盖置于琼脂糖表面，4 °C下保存5分钟。（D）缓慢向管盖上加入1–2 mL液态琼脂糖，小心将肺组织块放置于管盖上，4 °C下保存2分钟。（E,F）将液态琼脂糖倒入杯中，直至完全浸没肺组织块，4 °C下保存15分钟，然后轻轻敲碎塑料杯。（G）使用锋利刀片去除肺组织周围多余的琼脂糖，使组织周围保留约5 mm厚度的均匀琼脂糖层。（H）将切除的肺组织块小心粘附于组织固定架上。（I）在振动切片机缓冲槽中加入PBS，在周围冰浴中放置冰块，并将样本盘安装至缓冲槽内。（J）在振动切片机控制面板上设置切割参数：切片厚度：200 μm，振动频率：100 Hz，刀片振幅：1.3 mm，刀片前进速度：0.02–0.04 mm/s。（K–M）仍包埋于琼脂糖中的自由漂浮切片的代表性图像，可用于免疫荧光染色。请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠、猪和人肺组织显微比较：肺泡导管、血管、细支气管和肺泡。
图 2：人、猪和小鼠肺组织结构的免疫荧光图像。 （A-L） 分别来自小鼠、猪和人肺组织切片中肺泡导管、血管、细支气管和肺泡的代表性图像。SMA（绿色显示）是平滑肌细胞的标志物，在肺组织的血管壁和支气管壁中可见。弹性蛋白（红色显示）构成肺细胞外基质的一部分。（M） 通过在每张人、猪和小鼠肺组织切片上随机选取20个位置来定量肺泡大小。使用直方图展示各组内肺泡大小的分布情况。比例尺 = 50 µm（A-F, H-L），100 µm（G）。Kruskall-Wallis 检验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。缩写：DAPI = 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚；LEA = 番茄凝集素；SMA = 平滑肌肌动蛋白；ms = 小鼠；hmn = 人。请点击此处查看该图的放大版本。

成人与婴儿肺组织分析；荧光图像、柱状图；HTII-280 检测；DAPI、LEA。
图 3．人成体与婴儿样本中 II 型肺泡上皮细胞的分布。（A,B） 成人与婴儿人肺组织切片的代表性图像，分别用 HTII-280（红色显示）、CD31（绿色显示）和 LEA（灰色显示）进行染色。（C,D） 显示成人与婴儿人肺组织中 II 型肺泡上皮细胞分布的代表性图像。（E,F） 来自成人与婴儿人肺组织样本的单个 II 型肺泡上皮细胞的单细胞分辨率代表性图像。（G） 成人与婴儿样本之间 II 型肺泡上皮细胞数量的定量分析。（H） 成人与婴儿样本中肺组织支架区域覆盖率（% 与空气相比）的定量分析。（I） 成人与婴儿样本中每 mm2 组织内 II 型肺泡上皮细胞数量的定量分析。比例尺 = 5 µm（E,F），100 µm（A-D）。每样本 n = 10 个视野。采用非配对 t 检验或 Mann-Whitney 检验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。缩写：DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；LEA = 番茄凝集素（Lycopersicon Esculentum lectin）；HTII = 人 II 型细胞；CD31 = 血小板内皮细胞黏附分子-1/分化簇 31；fov = 视野。请点击此处查看该图的放大版本。

补充视频 S1：使用 DAPI、LEA、SMA 和弹性蛋白对单个猪气道进行染色后，获得的 20 µm 成像体积视频，展示了气道壁结构成分的高分辨率图像。缩写：DAPI = 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚；LEA = 番茄凝集素；SMA = 平滑肌肌动蛋白。请点击此处下载该文件。

补充视频 S2： 使用 DAPI、LEA 和 HTII-280 染色的单个肺泡的 30 µm 成像体积视频，显示肺泡结构中 II 型肺泡上皮细胞的分布。缩写：DAPI = 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚；LEA = 番茄凝集素（Lycopersicon Esculentum lectin）；SMA = 平滑肌肌动蛋白。 请点击此处下载该文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在本实验方案中，我们介绍了一种改进的基于振动切片机的方法，用于制备肺组织切片。与传统的石蜡包埋处理技术相比，该方法更具成本效益、更节省时间，且对环境更友好22。此外，该方法有助于保持肺组织切片的结构完整性，并可在无需抗原修复的情况下实现高级免疫荧光成像。然而，在实验过程中，我们也发现该工作流程存在某些局限性。病变肺组织可能因病理变化引起的组织破坏而干扰切片过程。在使用振动切片机进行切片时，气道阻塞和严重的纤维化肺组织可能阻碍刀片行进，使这些组织的切片过程更具挑战性。但通过降低刀片速度并使用细毛笔对组织进行支撑，可克服这一问题。类似的问题也可能源于胸膜增厚，这是胸膜炎、慢性阻塞性肺疾病（COPD）和特发性肺纤维化（IPF）中的常见现象23,24,25。如果实验无需关注胸膜，我们建议在切片前将其去除，或选择远离胸膜的肺组织区域进行分离。若必须保留胸膜，则可采用与上述类似的操作方式，即降低刀片速度并用细毛笔辅助支撑切片。

尽管精密切割的肺组织切片能够保留肺部的三维结构和天然微环境26，但需要指出的是，制备PCLS是一个复杂且耗时的过程。肺组织切片制备的成功与否在很大程度上取决于琼脂糖灌注的效率，而后者又受到获取组织中胸膜完整性及可用注射位点的影响。在啮齿类动物中，这一过程较为简单，因为琼脂糖可通过气管直接注入完整的肺组织27,28,29。然而，在大型动物研究中，实验过程中获取的活检样本通常来自远端肺段，这些区域缺乏足够大的气道用于插管30,31。因此，我们采用一种替代方法：无论组织来源物种或样本体积如何，均将肺组织包埋于低熔点琼脂糖中以制备肺组织切片，而非向支气管或血管内注射琼脂糖。该方法在技术上更为简便，并旨在尽可能减少组织损伤。根据我们的经验，该方法在制备肺组织切片方面表现出更高的效率和操作便利性，能有效保持肺泡形态，特别适用于肺组织的切片处理，可实现可重复的高分辨率多重荧光成像。

在本研究中，我们进一步展示了针对所生成成像数据的两种基于样本的定量分析方法。第一种方法采用图像追踪技术，评估不同物种样本肺泡大小的差异。不出所料，小鼠的肺泡最小，而猪和人的肺泡大小相似，凸显了猪作为肺部研究中一个有价值的转化模型。

在第二次定量分析中，我们比较了成人与婴儿肺组织样本中HTII的分布情况。II型肺泡上皮细胞（TIIs）在远端肺上皮结构中发挥着至关重要的作用。TIIs的这一独特能力有助于肺泡上皮的修复与再生32。在健康的成人人类肺组织中，TIIs约占总细胞群体的15%，而其覆盖肺泡表面积的比例估计约为5%33。HTII-280是一种广泛认可的肺组织特异性标志物，用于研究肺泡上皮细胞的发育及其对损伤的反应，且特异性定位于TIIs的顶膜质膜。在本实验中，成人肺组织来自因脑内出血死亡并伴有肺损伤的供体，而婴儿肺组织则来自窒息相关死亡病例。我们的研究结果表明，HTII-280在成人肺组织样本中的表达显著低于婴儿样本。值得注意的是，尽管HTII-280在大多数HTIIs中均有表达，但其表达水平也可能受到组织质量的影响，并在受损的人类肺组织中显著降低34。与年轻组织相比，衰老的肺组织中TIIs的数量及其分泌活性均显著下降，老年人的TIIs在增殖能力、分泌功能及抗凋亡活性方面也明显低于年轻个体35。与此一致的是，鉴定和检测一种特异性表达于人TIIs细胞表面的蛋白，将有助于评估肺损伤的严重程度，并评价旨在促进肺修复的治疗策略36,37。因此，利用该技术流程，在更大规模的健康与疾病人群队列中开展肺泡II型上皮细胞的研究将具有重要意义。

综上所述，本实验方案提供了一种更快捷、更简便的肺组织切片方法。该方法详细阐述了肺组织的制备、切片和染色步骤，确保完整保留肺组织的结构。此方法优化了用于研究健康与病变肺组织结构的模型，提高了实验效率。总体而言，本研究提出了一种有前景的方法，可用于跨物种研究肺组织病理生理学中的复杂空间生物学，有助于更深入理解疾病发生与修复过程中的分子机制。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者衷心感谢瓦伦贝里分子医学基金会和隆德大学干细胞中心提供的资助，并感谢隆德大学生物成像中心（LBIC）提供使用尼康A1RHD的机会。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24 孔组织培养小室SARSTEDT83.3932.300
4% 多聚甲醛SOLVECO6095714
4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）Thermo Fisher ScientificD1306
50 mL Falcon 管 SARSTEDT2045221
分化簇 31（CD31）Abcamab28364
共聚焦显微镜 NikonA1R HD25
弹性蛋白Abcamab23747
Epredia X1000 盖玻片Thermo Fisher Scientific10318963
Epredia SuperFrost Plus 黏附载玻片Thermo Fisher Scientific10149870
镊子AESCULAPFB395R
山羊抗小鼠 647 Invitrogen A21235
山羊抗兔 568Invitrogen A11011
人 II 型细胞Terrace BiotechTB-27AHT2-280 
Invitrogen Fluoromount-G 封片介质Thermo Fisher ScientificE41473
低凝胶温度琼脂糖Sigma-Aldrich1003467046
番茄凝集素（Lycopersicon Esculentum lectin）Thermo Fisher Scientific2531965
磷酸盐缓冲液（PBS）Thermo Fisher Scientific50-100-8798
塑料杯kontorsgiganten885221
剪刀STILLE101-8380-18
平滑肌肌动蛋白Abcamab5694
叠氮化钠Sigma-AldrichK54329188239
超级胶水LOCTITE2721643
振动切片机LeicaVT1200S

参考文献

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